全 文 ：江苏农业学报( Jiangsu J． of Agr． Sci． ) ，2012，28( 1) : 41 ～ 45
王兰英，廖凤仙，骆焱平． 九里香内生细菌 HBS-1 的鉴定及其对芒果采后病害的防效［J］． 江苏农业学报，2012，28 ( 1 ) :
41-45．
九里香内生细菌 HBS-1 的鉴定及其对芒果采后病害
的防效
王兰英， 廖凤仙， 骆焱平
( 海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南大学环境与植物保护学院，海南 海口 570228)
收稿日期: 2011-08-16
基金项目:海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点
实验室项目 ( 2010hckled-08 ) ; 海南省自然科学基金项目
( 311028) ;海南大学青年基金( Qnjj1157)
作者简介:王兰英( 1976-) ，女，山东郓城人，硕士，讲师，研究方向为
生物防治。( E-mail) daivemuwly@ 126． com
通讯作者:骆焱平，( E-mail) yanpluo@ yahoo． com． cn
摘要: 通过组织表面消毒法对九里香内生菌进行分离，以芒果炭疽病菌 ( Colletotrichum gloeosporioides Penz)
和芒果蒂腐病菌 ( Botryodiplodia theobromae Pat) 为靶标菌对获得菌株进行皿内拮抗能力筛选，利用浸果法测定菌株
发酵滤液对芒果采后病害的防治效果，结合菌株形态、生理生化特征及 16S rDNA序列鉴定菌株。结果从九里香中
分离到 28 株内生菌，其中有 8 株真菌、9 株细菌对 2 种病原菌均有拮抗活性，以 HBS-1 抑菌活性最好，对芒果炭疽
病菌及芒果蒂腐病菌抑制率分别为 42． 0%和 50． 0% ;菌株 HBS-1 发酵滤液能明显降低芒果采后病害的发病率，10
倍稀释液的防效优于化学药剂特克多 800 倍液，50 倍稀释液的防效与化学药剂特克多 800 倍液相当;经鉴定，内生
菌 HBS-1 为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) 。
关键词: 九里香; 内生菌; 芒果炭疽病菌; 芒果蒂腐病菌; 防效
中图分类号: S436． 67 文献标识码: A 文章编号: 1000-4440( 2012) 01-0041-05
Identification of an endophytic bacterial strain HBS-1 isolated from Man-
gifern indica and its biological control efficacy against diseases of posthar-
vest mango
WANG Lan-ying， LIAO Feng-xian， LUO Yan-ping
( Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources，Ministry of Education，College of Environment and Plant
Protection，Hainan University，Haikou 570228，China)
Abstract: Endophytic bacteria were isolated by Mangifern indica by surface disinfection method． Their antagonistic
activities against Colletotrichum gloeosporioides Penz and Botryodiplodia theobromae Pat were tested to get the best strain．
For the strain，control effect of its fermentation liquid filtrate was determined，and identified by morphology，physiological
and biochemical characteristics，and 16S rDNA sequence． The results were as follows． 8 fungi and 9 bacteria of 28 endo-
phytes from Mangifern indica showed high antagonistic activities，among which HBS-1 displayed 42． 0% and 50． 0% con-
trol efficacy against Colletotrichum gloeosporioides and Botryodiplodia theobromae，respectively． Its fermentation liquid fil-
trate could significantly reduce the incidences of mango postharvest diseases． By analysing the morphology physiological and
biochemical characteristics， and 16S rDNA sequence，
HBS-1 strain was identified as Bacillus subtilis．
Key words: Mangifern indica; endophytic bacteri-
um; Colletotrichum gloeosporioides; Botryodiplodia theo-
bromae; efficacy
芒果 ( Mangifern indica L． ) 被誉为“热带水
14
果之王”，在热带水果中排名第三，果肉嫩滑，营
养价值极高，广受国内外消费者青睐［1］。但是
芒果采后易遭病原微生物的潜伏侵染，品质受
到严重影响。这些病原微生物主要是芒果炭疽
病菌( Colletotrichum gloeosporioides Penz) 和芒果
蒂腐病菌( Botryodiplodia theobromae Pat) ［2］。生
产上多采用化学杀菌剂、防腐剂进行防治，但这
类药剂会给食品安全带来负面影响，研究者不
断从自然界中寻找对人畜安全无毒、无残留、特
异性强、不伤害有益生物的药剂进行防治［3］。
作为重要生防微生物之一的内生菌，可以通过
提高植物抗病性、与病原菌竞争生态位或产生
拮抗物质等发挥防病功效，具有防治水果采后
病害的优势。而关于芒果采后病害拮抗内生菌
的相关报道鲜见［4-5］。因此寻求更多芒果采后
病害内生拮抗菌株，具有一定的意义。
九里香( Murraya paniculata L． ) 属芸香科九里
香属植物，是著名南药植物之一，根、叶粗提物具有
杀虫、抑菌活性［6-7］，但有关九里香拮抗内生菌的研
究未见报道。本研究以芒果采后两种主要病害为靶
标菌，对九里香内生菌进行分离、筛选，并检测其防
治效果，以期获得对芒果采后病害具有生防应用价
值的菌株。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
1 ． 1 ． 1 植株及菌种 九里香( Murraya panicu-
lata L． ) 采自海南大学儋州校区，靶标菌芒果炭
疽病菌( Colletotrichum gloeosporioides Penz ) 和芒
果蒂腐病菌( Botryodiplodia theobromae Pat) 由海
南大学环境与植物保护学院提供，芒果 ( Man-
gifern indica L． ) 品种为台农 l号，采自三亚南田
农场。
1． 1． 2 培养基 真菌分离及纯化培养基为马铃薯
葡萄糖琼脂培养基，细菌分离及纯化培养基为牛肉
膏蛋白胨培养基，放线菌分离及纯化培养基为高氏
一号培养基。
1． 2 试验方法
1 ． 2 ． 1 内生菌的分离培养及纯化 将新鲜九里
香的根、茎、叶用自来水冲洗，室内晾干，在 75%
酒精中浸泡( 根、茎 8 min，叶 3 min) ，无菌水冲洗
3 ～ 4 次，随后用 0 ． 1% 升汞浸泡2 ～ 3 min，无菌
水冲洗 5 次。采用组织块法进行内生真菌分离，
采用研磨法进行内生放线菌及细菌分离。分离
平板适温培养2 ～ 7 d。以压组织块法及涂抹最后
一次消毒的无菌水法检验外植体消毒是否彻
底［8］。采用顶端逐级纯化法及划线法纯化获得
菌株，斜面保存，备用。
1． 2． 2 拮抗内生菌筛选 采用对峙法筛选拮抗
内生菌。用 5 mm 无菌打孔器打取纯化的内生真
菌菌饼接种于 PDA 平板中央，或用接种环挑取少
量内生细菌于培养皿中央划一条直线，然后距离
中央菌饼或菌线 2 cm 处左右各接种一块直径为 5
mm的靶标菌( 芒果炭疽病菌和芒果蒂腐病菌) 菌
饼，以不接内生菌为对照，每处理 3 次重复，( 26 ±
1) ℃培养1 ～ 3 d，计算抑菌率，对皿内拮抗效果理
想的菌株进行发酵液防治效果测定。菌落直径
( mm) = 测量菌落直径平均值 － 5. 0，抑菌率 = ( 对
照组菌落直径 －处理组菌落直径) / 对照组菌落直
径 × 100%。
1 ． 2 ． 3 菌株 HBS-1 发酵液对芒果采后病害的
防治试验 参照李锦龙等［9］方法配制菌株发酵
培养液，接入内生细菌 HBS-1 后 180 r /min、30
℃恒温振荡培养 48 h，过滤，用无菌水将滤液稀
释至 10 倍、50 倍、100 倍、150 倍、200 倍备用。
选择无机械损伤、无病虫害、生理成熟的芒果果
实，平肩剪蒂，用 2% NaClO 溶液浸泡 2 min，用
自来水冲洗干净，晾干后放入不同稀释倍数的
HBS-1 菌株发酵液中浸泡 3 min，自然晾干，每
个处理 3 次重复，每次重复 15 个芒果。 ( 28 ±
2 ) ℃、相对湿度80% ～ 90% 条件下贮藏。以化
学药剂特克多 ( 45%硫苯唑悬浮剂，德国拜耳公
司生产) 800 倍液处理作为药剂对照，以无菌水
处理作为空白对照。根据果实成熟情况，每隔 3
d 观察 1 次，记录果实炭疽病、蒂腐病的发病等
级，计算其发病率及病情指数。
芒果炭疽病的分级标准如下: 0 级，无病; 1 级，病
斑面积占果实面积的 5%及以下; 3级，病斑面积占果
实面积的6% ～ 15% ; 5 级，病斑面积占果实面积的
16% ～ 25% ; 7 级，病斑面积占果实面积的26% ～
50% ; 9 级，病斑面积占果实面积的 50%以上。芒果
蒂腐病的分级标准如下: 0 级，无病斑; 1 级，果蒂处
稍有淡灰褐色小斑块 ; 3级，果蒂周围变色病斑
直径1. 4 cm以下 ; 5级，病斑直径达1． 4 ～ 10 cm ;
24 江 苏 农 业 学 报 2012 年 第 28 卷 第 1 期
7 级，病斑直径达 10 cm 以上［10］。数据用 SAS 软件
Duncan氏新复极差法进行多重比较。
1． 2． 4 菌株 HBS-1 的鉴定 根据细菌学方法进行
细菌培养特征、形态特征及生理生化特性鉴
定［11-12］。参照林玲等［13］方法进行 16S rDNA序列测
定，然后用 BLAST 软件进行分析，并与 GenBank 中
已知序列进行同源性比较，通过 Treeview 软件构建
系统进化树。
2 结 果
2． 1 九里香内生菌的分布
采用组织块法和研磨法对九里香根、茎、叶进行
内生菌的分离纯化，结果共分离获得 28 株内生菌，
其中真菌 10 株，占菌株总数的 35. 7% ;细菌 18 株，
占菌株总数的 64. 3% ;未分离到放线菌。从植物不
同部位分离到的内生菌的数量也不同，根部最多，共
13 株，占分离菌株的 46. 4% ;其次是茎部，10 株; 叶
部最少，只 5 株。
2． 2 拮抗作用
采用对峙法测定了 28 株内生菌的拮抗作
用，结果见表 1。对 2 种靶标菌( 芒果炭疽病菌
和芒果蒂腐病菌) 有拮抗能力的内生真菌 8 株，
但它们对 2 种病菌的抑制率存在较大差异，总
体上是对芒果炭疽病菌的抑菌率高于对芒果蒂
腐病菌，其中 HAS-5 对芒果炭疽病菌的抑制效
果最好，抑菌率达到 25. 6% ; HAJ-3 对芒果蒂腐
病菌抑制活性最高，抑菌率达到 15. 0%。对 2
种靶标菌有拮抗活性的内生细菌 9 株，其中
HBS-1抑菌活性最强，对芒果炭疽病菌、芒果蒂
腐病菌的抑菌率分别为 42. 0% 和 50. 0%。统
计分析结果表明，内生细菌 HBS-1 抑菌活性显
著高于其他菌株。
2． 3 菌株 HBS-1 发酵液对芒果采后病害的防效
从表 2 可以看出 : 随着 HBS-1 菌株发酵滤液
稀释倍数的增加，芒果炭疽病与芝果蒂腐病 2 种
病害的发病率均逐渐升高，发病指数逐渐增大，
防效逐渐降低。其中滤液稀释 10 倍处理防病效
果最明显，芒果炭疽病与芒果蒂腐病发病率分别
为 21. 46% 和 10. 12%，防 效 可 达 84. 50% 和
71. 53%，极显著高于化学药剂特克多 800 倍液
( 化学药剂对照) ; 其次是稀释 50 倍的滤液，防效
与化学药剂对照相当。比较 2 种病害发病率可
以发现 : 不同稀释倍数滤液处理，芒果炭疽病发
病率低于芒果蒂腐病 ; 滤液稀释倍数增加对芒果
蒂腐病影响大于芒果炭疽病，滤液稀释 100 倍，
芒果炭疽病防效仍然可达 63. 65%，与化学药剂
对照( 64. 39% ) 相比差异不显著，而对芒果蒂腐
病防效为 45. 59%，与药剂对照 ( 50. 27% ) 相比
差异极显著。
表 1 内生菌对芒果炭疽病菌及芒果蒂腐的抑制作用
Table 1 Inhibition of endophytes against Colletotrichum gloeosporioides and Botryodiplodia theobromae
菌 株 芒果炭疽病菌 芒果蒂腐病菌 菌 株 芒果炭疽病菌 芒果蒂腐病菌
抑菌率( % ) 抑菌率( % )
真菌 HAS-1 18． 2Bb 10． 2Cc 细菌 HBS-1 42． 0Aa 50． 0Aa
真菌 HAS-2 19． 0ABab 10． 6Cc 细菌 HBS-2 25． 8Bb 17． 6Cc
真菌 HAS-3 14． 8Cc 10． 8BCbc 细菌 HBS-3 27． 8Bb 16． 8Cc
真菌 HAS-4 22． 2Aa 12． 8Bb 细菌 HBS-4 18． 0BbCc 12． 0Cc
真菌 HAS-5 25． 6Aa 12． 2Bb 细菌 HBS-5 20． 4Bb 14． 8Cc
真菌 HAJ-2 14． 8Cc 9． 8Cc 细菌 HBS-6 18． 6BbCc 18． 6Cc
真菌 HAJ-3 17． 8Bb 15． 0Aa 细菌 HBJ-2 16． 0Cc 32． 5Bb
真菌 HAY-1 17． 5Bb 13． 5ABab 细菌 HBJ-3 40． 5Aa 30． 5Bb
－ － － 细菌 HBY-3 15． 0Cc 18． 0Cc
同列数据后不同小写英文字母表示 0. 05 水平上差异显著，不同大写英文字母表示 0． 01 水平上差异显著。
34王兰英等:九里香内生细菌 HBS-1 的鉴定及其对芒果采后病害的防效
表 2 HBS-1 发酵滤液对芒果采后病害的防效
Table 2 Control effects of the fermentation filtrate of HBS-1 against diseases of postharvest mango
处 理
芒果炭疽病
发病率( % ) 发病指数 防效( % )
芒果蒂腐病
发病率( % ) 发病指数 防效( % )
发酵滤液稀释 10 倍 21． 46 0． 84 84． 50aA 10． 12 1． 58 71． 53aA
发酵滤液稀释 50 倍 25． 58 1． 76 67． 53bB 15． 64 2． 46 55． 68bB
发酵滤液稀释 100 倍 29． 00 1． 97 63． 65bB 20． 47 3． 02 45． 59cC
发酵滤液稀释 150 倍 44． 96 3． 28 39． 48cC 35． 42 5． 17 6． 85dD
发酵滤液稀释 200 倍 45． 87 4． 89 9． 78dD 48． 46 5． 25 5． 41dD
特克多 800 倍稀释液( 化学药剂对照) 30． 22 1． 93 64． 39bB 30． 56 2． 76 50． 27bB
无菌水 50． 78 5． 42 － 58． 94 5． 55 －
菌株 HBS-1 发酵液在 600 nm下 OD值为 1． 94;特克多为 45%硫苯唑悬浮剂，德国拜耳公司生产。同列数据后不同小写英文字母表示在 0． 05
水平上差异显著，不同大写英文字母表示在 0． 01 水平上差异极显著。
2． 4 HBS-1 生物学特征及系统发育
2． 4． 1 形态特征 将 HBS-1 接种于牛肉膏蛋白胨
培养基上 30 ℃培养 24 h，菌落平坦、光滑、土黄色。
对培养18 ～ 28 h菌株进行革兰氏染色、芽孢染色及
鞭毛染色，结果表明，该菌株革兰氏阳性，芽孢中生，
鞭毛周生，长度约为 1. 88 μm。
2． 4． 2 生理生化特征 参照细菌学鉴定方法对
HBS-1菌株进行生理生化测定，结果表明:该菌株属
好氧型，接触酶为阳性; 含有过氧化氢酶，可以将过氧
化氢分解成水和氧; 无脲酶; 能水解淀粉; 含卵磷脂
酶;能利用柠檬酸盐作为唯一碳源;吲哚乙酸试验阴
性;石蕊牛奶中反应阴性;不能将苯丙氨酸氧化脱氨;
不能分解培养基中含硫氨基酸生成硫化氢;能使明胶
液化;不能形成果聚糖;优-普试验阳性; 甲基红试验
阳性;能够发酵 d-葡萄糖、l-阿拉伯糖、d-木糖、d-甘露
醇，产酸不产气;碳源利用广泛，可以在蔗糖、葡萄糖、
麦芽糖、果糖及木糖作为唯一碳源的培养基上生长良
好;在浓度为2% ～ 7% NaCl 中生长良好，10% NaCl
中生长受抑制。
2． 4． 3 16S rDNA 序列分析 测得菌株 HBS-1 的
16S rDNA 碱基序列全长为1 515 bp，将它在 Gen-
Bank中注册，注册号为 HQ268825。运用在线 Blast
软件进行同源性分析，发现与 HBS-1 同源性较高的
菌株多数为枯草芽孢杆菌属。选取其中 10 株同源
性 97%以上的菌株构建系统发育树 ( 图 1 ) 。菌株
HBS-1 与芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌( Bacillus subti-
lis) 在进化树的同一支上，同源性最高，达 99%。结
合菌株生理生化等特征，鉴定该菌株为枯草芽孢杆
菌( Bacillus subtilis) 。
图 1 基于 16S rDNA序列构建的 HBS-1 系统发育树
Fig． 1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of HBS-1
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3 讨 论
本研究通过组织表面消毒法对九里香根、茎、叶
进行内生菌株分离、筛选，获得一株对芒果炭疽病菌
和芒果蒂腐病菌拮抗作用较强的菌株 HBS-1。经测
定该菌株 10 倍及 50 倍发酵滤液稀释液均可以降低
芒果采后病害的发病率，防治效果理想。通过形态
观察、生理生化测定及 16S rDNA 序列分析，将该内
生菌鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌( Bacillus sub-
tilis) 。据报道［10，14-15］，采用芽孢杆菌发酵液直接浸
果，对芒果炭疽病、芒果蒂腐病防效最高可达
48. 6%和 68. 3%。本研究用 HBS-1 发酵滤液浸果，
10 倍稀释液对 2 种病害防效可达 84. 5% 和
71. 53%，效果优于已报道菌株。另外已报道的拮抗
菌株主要来源于芒果等种植园区土壤，由于从土壤
中获得的菌株很难在植物体表或体内定殖，植物内
生细菌因其本身就存在于植株体内，容易占据有利
的生态位［16］，因此本研究获得的菌株 HBS-1 更具生
防应用的潜力。
参考文献:
［1］ 苏小军，蒋跃明，于 新，等． 芒果采后生物学及贮运保鲜技术
研究进展［J］． 仲恺农业技术学院学报，2001，14( 1) : 60-66．
［2］ 赖传雅． 农业植物病理学［M］． 北京: 科学出版社，2003:
222-225．
［3］ 张鲁斌，常金梅，詹儒林． 芒果采后病害生物防治研究进展
［J］． 热带作物学报，2010，31( 8) : 1427-1432．
［4］ 郑燕玲． 石斛兰( Dendrobium chrysopterum) 内生菌的分离及其
生物防治功能研究［D］． 广州: 中山大学，2006．
［5］ 陈宝如，詹儒林，何 红，等． 红树内生细菌 AiL3 菌株鉴定及
其胞外抗菌活性物质特性［J］． 农业生物技术学报，2010，18
( 4) : 801-806．
［6］ 骆焱平，朱朝华，谭仲清． 九里香提取物对斜纹夜蛾拒食活性
的初步研究［J］． 湖北农业科学，2005( 6) : 49-51．
［7］ 卢远倩，王兰英，骆焱平． 九里香精油的抑菌活性及成分分析
［J］． 农药，2011，50( 6) : 443-445，448．
［8］ 谢 洁，夏 天，林立鹏，等． 一株桑树内生拮抗菌的分离鉴定
［J］． 蚕业科学，2009，35 ( 1) : 121-125．
［9］ 李锦龙，王有琪，贾秀芬，等． 四个内生菌菌株防治西瓜枯萎病
初报［J］． 中国蔬菜，2009( 20) : 59-60．
［10］ 杨胜远，陈桂光，肖功年，等． 芒果主要病原菌拮抗微生物的分
离筛选［J］． 植物保护，2004，30( 3) : 55-58．
［11］ 东秀珠，蔡妙英． 常见细菌系统鉴定手册［M］． 北京: 科学出
版社，2001: 62-65．
［12］ 布坎南 R E，吉本斯 R E． 伯杰细菌鉴定手册［M］． 8 版． 北
京:科学出版社，1984: 729-731．
［13］ 林 玲，金中时，马长文，等． 棉花黄萎病生防内生细菌 Jaas cd
的鉴定及田间防效［J］． 江苏农业学报，2010，26( 1) : 65-69．
［14］ 张荣意，谭志琼，简日明． 芒果炭疽病生防细菌的筛选、鉴定及
生防潜能的初步研究［J］． 热带作物学报，1998，19 ( 3 ) :
21-27．
［15］ 任建国，黄思良，晏卫红，等． 拮抗微生物防治芒果炭疽病研究
［J］． 西南农业学报，2002，15( 4) : 82-85．
［16］ 林 玲，乔勇升，顾本康，等． 植物内生细菌及其生物防治植物
病害的研究进展［J］． 江苏农业学报，2008，24( 6) : 969-974．
( 责任编辑:汪恒英)
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