全 文 ：反相制备液相色谱分离白花败酱草异戊烯基黄酮
彭金咏 1　范国荣* 1　吴玉田1　陈洪渊2
1(第二军医大学药学院 , 上海药物(中药)代谢产物研究重点实验室 ,上海 200433)
2(南京大学分析科学研究所 , 南京 210000)
摘　要　用半制备型反相高效液相色谱(RPLC)对白花败酱草氯仿萃取物进行了分离制备。色谱柱为 YWG
C18(200 mm × 10. 0 mm .i d. , 10 μm),流动相为乙腈∶水∶乙酸(55∶45∶1, V /V), 检测波长 280 nm , 流速 4. 0
mL /m in, 进样 750 μL (样品液浓度 30 g /L)。在此条件下一次分离得到 5个单体化合物 , 经理化反应和光谱
分析分别鉴定为 bo lusan thol B(1), (2S)-5, 7, 2′, 6′-tetrahydroxy-6-lavandu ly lated flavanone(2), (2S)-5, 2′,
6′-trihydroxy-2″, 2″-dime thy lpy rano [ 5″, 6″∶6, 7] flavanone(3), o ro tin in (4)和 o ro tinin-5-m e thy l e ther(5)。其中
2和 3为新化合物 , 1、4和 5为首次从败酱属植物中分离得到。
关键词　白花败酱草 , 黄酮 ,制备色谱
　 2005-11-21收稿;2006-01-09接受
本文系国家高新技术研究发展计划(863)基金资助项目(No. 2003AA2Z3524)
1　引　　言
白花败酱草 (Patrinia villosa Juss)系败酱科多年生草本植物 ,分布于我国华东 、华中 、华南及西南各
地 ,具有清热利湿 、解毒排脓 、活血化瘀 、清心安神 、促进肝细胞再生 、改善肝功能 、增强抑菌和抗病毒等
作用。有关白花败酱草化学成分的研究报道较少 ,除几种环烯醚萜外 [ 1] ,前期工作采用高速逆流色谱
技术从中分离得到了两种黄酮苷[ 2] ,一种二肽衍生物 [ 3]和几种异戊烯基黄酮 [ 4] ,其它的未见文献报道。
因此 ,进一步研究白花败酱草的化学成分 ,对阐明其药效物质基础 ,开发现代中药新药和充分利用我国
的药材资源等具有重要意义。
本研究采用半制备型反相高效液相色谱法对白花败酱草氯仿萃取物进行了分离制备 ,经一次分离
得到 5种纯度高于 97%化合物 ,分别鉴定为 bolusanthol B (1)、(2S)-5, 7, 2′, 6′-te trahydroxy-6-lavandu-
ly lated flavanone (2)、(2S)-5, 2′, 6′-trihyd roxy-2″, 2″-d imethylpy rano [ 5″, 6″∶6, 7] flavanone (3)、orotinin
(4)和 o ro tinin-5-me thy l ether (5)。其中 2和 3为新化合物 , 1、4和 5为首次从败酱属植物中分离得到。
2　实验部分
2. 1　仪器与试剂
W ate rs半制备型高效液相色谱仪 (包括 515泵 、2487检测器和 1000 μL定量圈 );Shimadzu LC-
10AVP分析型高效液相色谱仪 (包括 SPD-10A UV-V is检测器 , LC-10AT泵 , 20 μL定量圈 );所用色谱工
作站均为 N2000(浙江大学智能信息工程研究所)。柱层析用硅胶购自青岛海洋化工厂;MAT-711型高
分辨质谱仪 (美国 F inn igan公司);Varian INOVA-500型核磁共振仪 (TM S内标 )。白花败酱草药材(上
海童涵春中药饮片厂 );乙腈 、甲醇为色谱纯(德国默克公司);其余所用试剂均为分析纯 (中国医药集团
上海化学试剂公司);水为自制重蒸馏水 ,并经微孔滤膜过滤 。
2. 2　实验方法
2. 2. 1　样品制备　称取药材粗粉 5. 0 kg,用 80%乙醇回流提取 ,滤液减压浓缩得浸膏约 800 mL。此浸
膏加一倍量水混悬后 ,依次用石油醚 (1000 mL ×3)和氯仿 (1000 mL ×3)萃取 ,合并氯仿萃取液 ,减压回
收氯仿后进行硅胶柱层析 。依次用氯仿(1000 mL)、氯仿:甲醇 (100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1、10∶1,每
梯度洗脱液均为 1000mL)梯度洗脱 ,分段接收 。
2. 2. 2　白花败酱草异戊烯基黄酮的制备　硅胶柱洗脱流分减压回收至干 ,用甲醇溶解成 30 g /L的溶
第 34卷
2006年 7月　　　　　　　　　　　　
分析化学 (FENXI HUAXUE)　研究简报
Ch inese Journa l o f Ana ly tica l Chem istry
　　　　　　　　　　　　 第 7期
983 ～ 986
液 ,微孔滤膜过滤后进样 750 μL,根据色谱图接收流分。对所得产物纯度检测进行结构鉴定 。
2. 2. 3　色谱条件　分析用色谱柱 Lichro sphe rC18(4. 6mm ×250mm .i d. , 5μm)(江苏汉邦 ),流动相
CH 3CN-H2O-HAC (60∶40∶1, V /V),流速 1. 0 mL /m in。半制备用色谱柱 Lichrospher C18(10 mm ×200
mm .i d. , 10μm)(江苏汉邦 ),流动相 CH3CN-H2O-HAC (55∶45∶1, V /V),流速 4. 0mL /m in。柱温均为
　图 1　白花败酱草粗提物 HPLC色谱图
F ig. 1　H igh Pe rform ance liquid chrom atography
chrom atogram o f ex tract o fPatrin ia villosa Juss
1. b olusan thol B;2. (2S)-5, 7, 2′, 6′-tetrahyd roxy-6-
lavandu ly lated flavanon;3. (2S)-5, 2′, 6′-trihydroxy-2″,
2″-dimeh ty l″pyrano[ 5, ″6″:6, 7] f lavanon;4. orotin in;
5. orotin in-5-m ethy l ether; 6. 未知 成分 ( undnow
compound)。
室温 ,检测波长均为 280 nm。
3　结果与讨论
3. 1　样品制备及其 HPLC分析
本研究中采用硅胶柱层析对白花败酱草氯仿萃取物进
行粗分 ,氯仿-甲醇梯度洗脱 ,共得到 35个流分 , HPLC跟踪
检测。其中 10 ～ 16流分主要含有 6个色谱峰 ,分离较为理
想 (见图 1),适合于 RPLC分离制备。
3. 2　半制备液相色谱分离条件优化
在 RPLC分离制备中 ,流动相及流速 ,样品液浓度和进
样体积等都会影响分离效果。本研究中首先依据 HPLC分
析条件考察了不同流动相组成 CH3CN-H2O-HAC /H 3PO4 、
M eOH-H2O-HAC /H3PO 4、 CH 3CN-M eOH-H 2O-HAC /H3PO4
及其不同配比对分离效果的影响 。再采用 L9 (3)4正交试
验法优选了最佳的流动相流速 、样品液浓度和进样体积 。
研究结果表明:制备用流动相为 CH3 CN-H2O-HAC (55∶45∶1, V /V),样品液浓度为 30 g /L,进样量为
750μL,流动相流速为 4. 0 mL /m in时能达到良好分离(图 2)。分离时间约为 60m in。色谱图接收 6个
流分(Ⅰ ～Ⅵ )。当流动相流速过高或进样量过大时 ,峰Ⅴ和 Ⅵ就完全合并为一个色谱峰 。随着流速和
进样量的进一步加大 ,峰Ⅲ和Ⅳ也合并为一个流分 。当样品液浓度很高时 ,虽然进样体积可以减少 ,却
增加了色谱柱入口的浓度超载 ,从而减少柱子的负荷量和柱效。本研究对 RPLC的重复性进行了考察 ,
结果发现重复进样多次对产物的纯度影响较小 ,说明在此制备条件下 RPLC的重复性良好 。按此制备
条件重复进样 12次得到 41 mg流分 Ⅰ 、35 mg流分 Ⅱ 、74 mg流分 Ⅲ、29 mg流分Ⅳ、12 mg流分Ⅴ和
21 mg流分 Ⅵ 。
3. 3　纯度检测
制备所得各流分经 HPLC不同检测波长下分析表明:流分 Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和 Ⅵ均为单一色谱峰 ,流分
Ⅴ含有两个色谱峰(峰 5和峰 6)。同时也在不同 TLC条件下对各流分进行分析 ,结果 Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ 、Ⅳ和 Ⅵ
　图 2　白花败酱草粗提物制备液相色谱图
F ig. 2　Reve rsed phase liquid(RPLC) chrom ato-
g ram of the crude sam ple from Patrinia villosa
Juss
也均为单一斑点 。
3. 4　结构鉴定
根据理化反应和光谱分析 (UV , IR, HR-ESI-MS, 1D
NMR和 2D NMR)对所得单体化合物进行结构鉴定。其中流
分Ⅰ、Ⅳ和Ⅵ均为已知成分 ,分别鉴定为 bolusantho l B (1)、oroti-
nin (4)和 orotinin-5-methyl ether(5),与文献报道一致[ 5, 6] 。
化合物 2(流分 Ⅱ):白色片状物 , m. p. 192 ～ 193℃,易
溶于甲醇 、氯仿和丙酮 ,不溶于水 。盐酸镁粉反应阳性 ,示
为黄酮类。经 HR、ES I-MS分析分子式 C25H28O6 (实测值
423. 1262 ,计算值 423. 1234 [M - 1] - 。13 C和 DEPT NMR
谱显示 3×CH3 , 4×CH 2 , 7×CH , 11×C。 IR显示结构中
有 OH , C O 和苯环。二氢黄酮的母核结构可从
1
H NMR信号 δ5. 86 (1H , dd, J =14. 0Hz, 3. 0, H-2)、δ2. 43 (1H , dd, J =17. 0, 3. 0H z, H-3e)和δ3.92
984　　 分 析 化 学 第 34卷
(1H , dd, J =17. 0, 13. 0 Hz, H-3a)]和 13C NMR信号 δ71. 4 (C-2)、39. 0 (C-3)和 197. 5 (C-4)] 得到证
实 , C环显示出 2′, 6′-双取代 。 1H NMR谱中δ12. 30 (1H , b rs)为 5-OH信号 ,有 3组三质子单峰信号:
δ1. 58 (3H , s), 1. 51 (3H , s), 1. 47 (3H , s),对应 3个伯碳原子信号 δ25. 2 (C-5 ), 18. 4 (C-5″)和 17. 3
(C-4 ),表明该结构中有 3个甲基 , δ5. 97 (1H , s, H-8)为 C-8上的芳氢信号 , δ4. 56 (1H , s)和 4.53
(1H , s)为烯碳原子 δ110. 2 (C-4″)上的两个烯氢质子信号;从 1H NMR信号 [ δH 1. 47、1. 51、1. 58 (s,
3H ×3), 1. 96 (m , 2H), 2. 46 (m , 2H), 2.45 (m , 1H), 4. 56 (s, 1H), 4.53 (s, 1H), 4. 93 (brs,
1H)]和13C NMR信号 [ δC 26. 5 (C-1″)、46. 1 (C-2″)、147. 8 (C-3″)、110. 2 (C-4″)、18. 4 (C-5″)、30. 7
(C-1 )、123. 3 (C-2 )、130. 2 (C-3 )、17. 3 (C-4 )和 25. 2 (C-5 )]可以断定该化合物含有一个 lavan-
dulyl取代基 ,经过 HMBC实验确定该基团连接在 C-6上。从 C-2和 C-3位质子间的偶合常数(J2, 3 =14. 0
Hz)并结合 NOESY谱中的相关性 ,暗示这两质子是 a-a键相关 ,从而可以表明 H-2是以 a键与 C-2相连。
B环是以 e键与 C-2相连;结合该化合物负的旋光性特性 , [ α] 25D - 200(c. 1. 00, CH3OH)和该黄烷类化合
物中只有一个手性碳原子 (C-2)的特点 ,并参照相关文献 [ 7]确定 C-2为 S构型。综合分析 1H NMR,
13
C NMR, HMQC , HMBC , NOESY及 HR ESI-MS等波谱数据 ,确定化合物 2的结构为(2S)-5, 7, 2′, 6′-tetra-
hydroxy-6-lavandu ly lated flavanone。结构式及主要的 HMBC关系见图 3。 1H 和 13C NMR信号归属见表 1。
表 1　化合物 2 NMR数据 (500MH z, in DM SO)
Table 1　Nuclearm agne tic resonance (NMR) spectra data of compound 2 (500MH z, in dim e thy l su lfoxide (DMSO))
原子序号
No.
碳化学位移δC
氢化学位移δH
原子序号
No.
碳化学位移δC
氢化学位移δH
2 71. 4 5. 86 dd (14. 0, 3. 0 ) 3′, 5′ 106. 7 6. 39 d (8. 0 )
3 39. 0
2. 47 dd (17. 0, 3. 0 )
3. 92 dd (14. 0, 17. 0 ) 4′ 129. 4 6. 98 t(8. 0)
4 197. 5 - 1″ 26. 5 2. 46 m
5 161. 3 12. 30 b rs 2″ 46. 1 2. 45 m
6 106. 2 - 3″ 147. 8 -
7 164. 7 - 4″ 110. 2 4. 56 s 4. 53 s
8 94. 8 5. 97 s 5″ 18. 4 1. 51 s
9 161. 1 - 1 30. 7 1. 96 m
10 101. 4 - 2 123. 3 4. 93 b rs
1′ 110. 4 - 3 130. 2 -
2′, 6′ 157. 1 - 4 17. 3 1. 47 s
5 25. 2 1. 58 s
　
　图 3　化合物 2和 3的化学结构式和 HMBC偶合关系
F ig. 3　Chem ical structures and he te ronuclear m ultip le
bond coherence (HMBC) co rre la tions of com pounds 2
and 3
　　化合物 3(流分 Ⅲ ):浅黄色粉末 , m. p. 167 ～
168℃。盐酸镁粉反应阳性 , 示为黄酮类。 ESI-MS
m /z:353 [M -H ] - 。 HR ESI-MS给出其分子式 C20
H18O6(实测值 353. 1126,计算值 353. 1131),该分子
式能被其 13C NMR, 1HNMR和 DEPT得以证实。 IR
显示该化合物含有羟基 (3412 cm - 1)、羰基 (1668
cm
- 1)和苯环 (1587 and 1465 cm -1), UV (MeOH ,
λm ax ):275和 310 nm。从 1H NMR数据 δH 2. 48 (1H ,
dd, J = 3. 0, 17. 0 H z), δH 3. 90 (1H , dd , J =
13.0, 17. 0 H z)、δH 5. 78 (1H , dd, J =3. 0, 13.0
H z)可以确定该化合物为 ABX系统的二氢黄酮类。
1
H NMR信号 δH 6. 37 (d, 2H , J =8. 0 H z, H-3′,
5′)和 6. 99 (t, 1H , H-4′)示有一含有 3个相邻芳
质子的苯环 , δH 12. 28是 5-OH信号 。从1H NMR信号
[ δH 1.36、1.39 (3H each, s, Me ×2)、5. 94、6. 53 (1H
each, d, J =10. 0 Hz, 环烯质子信号)] 和 13C NMR信
号 [ δc 27. 7、28. 0 (M e×2)、77. 9 (C-2″)、126. 4 (C-3″)和 115. 0 (C-4″)为两个环烯碳原子信号 ]可以
985第 7期 彭金咏等:反相制备液相色谱分离白花败酱草异戊烯基黄酮 　　
断定该化合物含有一个二甲基吡喃环 ,并且通过 HMBC可以确定该环连接在 C-6、C-7上。从 C-2和C-3
位质子间的偶合常数 (J 2, 3 = 13. 0 Hz)并结合 NOESY和该化合物负的旋光性特性 , [ α] 25D-120
(c. 1.00, CH 3OH)确定 C-2为 S构型 ,与化合物 2相似 。综合分析 1H NMR、13C NMR、HMQC、HMBC、
NOESY及 HR ES I-MS等波谱数据 ,化合物 3被鉴定为 (2S)-5, 2′, 6′-trihydroxy-2″, 2″-dime thy lpy rano
[ 5″, 6″∶6, 7] flavanone,结构式及 HMBC偶合关系见图 3, 1H和 13C NMR信号归属见表 2。
表 2　化合物 3 NMR数据(500MH z, in DM SO)
Table 2　NMR spectra data of compound 3(500MH z, in DMSO)
原子序号
No.
碳化学位移δC
氢化学位移δH
原子序号
No.
碳化学位移δC
氢化学位移δH
2 72. 0 5. 78 dd (3. 0, 13. 0) 1′ 110. 0 -
3 39. 0
2. 48 dd (3. 0, 17. 0)
3. 90 dd (13. 0, 17. 0) 2′, 6′ 157. 3
4 197. 6 - 3′, 5′ 106. 8 6. 37 d (8. 0)
5 159. 5 12. 28 b rs 4′ 129. 9 6. 99 t
6 106. 8 - 2″ 77. 9 -
7 162. 2 - 3″ 126. 4 5. 94 d (10. 0)
8 96. 0 5. 90 s 4″ 115. 0 6. 35 d (10. 0)
9 157. 9 - 2″-M e 27. 7 1. 36 s
10 101. 0 - 2″-M e 28. 0 1. 39 s
　
References
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Isolation and Pur ification of Prenylated F lavonoids from Patrinia Villosa
Juss by Reversed Phase Preparative L iquid Chromatography
Peng Jinyong1 , Fan Guo rong*1 , Wu Yutian1 , Chen H ongyuan2
1(Shangha iKey Laboratory forD rugMetabolism , College of Pharmacy, TheSecondM ilitary MedicalUniversity, Shanghai 200433)
2(Institute of Analy sis, Nan jing University, Nanjing 210000)
Abstract　A sem i-preparative reversed phase liquid chroma tography (RPLC)was used to isolate the chem ical
constituents from the ch loroform ex tract ofPatrinia villosa Juss. The separation condition w as optim ized as fo llow s:
the columnw as YWG C18(10. 0mm ×200mm .i d. , 10μm), the mobile phase w as composed of CH3CN-H2O-
HAC (55∶45∶2, V /V) at a flow rate o f 4. 0mL /m in, the detection w ave leng th and sample size were se t at 280 nm
and 750μL (30 g /L). Under the optim ized conditions, five compoundsw ere isolated by RPLC in one run. The ir
chem ical structures were identified as bo lusanthol B (1);(2S)-5, 7, 2′, 6′-tetrahydroxy-6-lavanduly lated flava-
none (2);(2S)-5, 2′, 6′-trihydroxy-2″, 2″-dimethylpyrano [ 5″, 6″:6, 7] flavanone (3);oro tinin (4) and
oro tinin-5-me thy l ether (5) by spectroscopic methods including ultraviolet, infrared, electrospray mass
spectromctry, 1D nuclearmagne tic resonance (NMR) and 2D NMR techniques. Among them , compounds 2 and 3
w ere new compounds, and compounds 1, 4 and 5 we re iso lated from the P. genius for the first time.
Keywords　Patrin ia villosa Juss, flavonoid, preparative chromatog raphy
(Received 21 Novem ber 2005;accep ted 9 January 2006)
986　　 分 析 化 学 第 34卷