全 文 ：檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
其是小相对分子质量的活性多糖，因为活性多糖的
特性是水溶性 D-葡聚糖和具线性结构或尽可能短
的分枝，较容易通过 2 万的 4 级膜而被 5 级膜截留。
从 2 个药的“相对分子质量分布”看，文献报导相对
分子质量小于 1 万的溶解性有机物在金银花中占
68. 6%，在黄芩中占 56%［7］，本试验 5 级截留液汇
聚的是 300 ～ 2 万的物质，所得干膏占总干膏
的 70%。
［参考文献］
［1］ 程鹏，武超，华剑，等 ．超滤膜分离的技术原理及其在中
药领域中的应用［J］．中国医药指南，2010，11(8):47．
［2］ 陈铭祥，王定勇 ．天然产物提取分离新技术的研究进展
［J］．中国医药导报，2009，22(6):9．
［3］ 郭武艳，孔焕宇，朱嘉 ． 两种制备工艺的银黄方中有效
成分的分析［J］． 中国实验方剂学杂志，2011，17
(5):6．
［4］ 苏显中，王河清，于敏 ． 中草药体外抑菌作用的研究进
展郑全喜［J］．中国医药生物技术，2009，4(4):295．
［5］ 徐玉田 ． 黄芩的化学成分及现代药理作用研究进展
［J］．光明中医，2010，25(3):544．
［6］ 林雄平，陈晓清，苏育才 ． 金银花和苦丁茶多糖提取物
抗菌活性研究［J］． 亚热带植物科学，2008，37(1):51．
［7］ 樊文玲，郭立玮，董洁 ． 中药水提液中可溶性有机物分
子量分布及其对陶瓷膜通量的影响［J］． 南京中医药
大学学报，2004，20(5):295．
［责任编辑 仝燕］
响应面法优化贯叶连翘中金丝桃素超声提取工艺
郭凯1，2，梁剑平1* ，华兰英1，王学红1，石广亮3
(1. 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 新兽药工程重点实验室，兰州 730050;
2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081;3. 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070)
［摘要］ 目的:以贯叶连翘为原料，应用响应面法探求超声提取金丝桃素的最优工艺。方法:在对影响金丝桃素提取率的
单因素系统考察的基础上，采用部分析因设计分析筛选以上因素，并应用响应面法对其显著因素进行研究和优化。结果:建立
了超声提取贯叶连翘中金丝桃素的工艺数学模型。超声提取金丝桃素的最佳工艺条件为超声提取时间 36. 15 min，丙酮 /乙醇
混合提取溶剂中丙酮体积分数为 68. 14%，液料比为 11. 87 mL·g － 1，此时金丝桃素提取率理论值可达到 1. 454%。经验证，提
取率为 1. 44%，与理论值相符。主效应关系为超声提取时间 ＞丙酮体积分数 ＞液料比。结论:通过以上试验得到的提取工艺
条件可靠，金丝桃素提取率远高于常规提取方法，可为金丝桃素的工业化放大生产提供了一定的理论依据。
［关键词］ 贯叶连翘;金丝桃素;超声提取;部分析因设计;响应面法
［中图分类号］ R283. 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2011)11-0007-06
Optimization of Ultrasonic Extraction of Hypericin in Hypericum perforatum
by Response Surface Methodology
GUO Kai1，2，LIANG Jian-ping1* ，HUA Lan-ying1，WANG Xue-hong1，SHI Guang-liang3
(1. Key Laboratory of New Animal Medicine Project Lanzhou Institute of Animal Husbandry
and Veterinary Pharmacology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730050，China;
2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China;
3. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China)
［收稿日期］ 20100808(001)
［基金项目］ “十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD31B05)
［第一作者］ 郭凯，硕士研究生，从事中药提取工艺的研究，Tel:13659319252，E-mail:guook@ live． cn
［通讯作者］ * 梁剑平，研究员，博士生导师，研究方向:新型中兽药的研发，Tel:13008781170，E-mail:liangjp100@ sina． com
·7·
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2011 年 6 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medic al Formulae
Vol． 17，No． 11
Jun．，2011
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2011.11.010
［Abstract］ Objective:The objective of the current study was to determine the optimum ultrasonic extraction
conditions for hypericin from H． perforatum． Method:The optimum conditions were evaluated with 2-level fractional
factorial design and optimized using response surface methodology． Result:High yields of hypericin were observed
from H． perforatum by ultrasonic extraction technology． The extraction time，acetone concentration and the ratio of
solvent to material were the most significant parameters on hypericin extraction as evaluated through FFD． The
extraction conditions were further investigated with central composite design． The results showed that the optimal
parameters for this method were:extraction time of 36. 15 min，acetone concentration of 68. 14 (Vol)of acetone /
ethanol solvent，and ratio of solvent to material of 11. 87 mL·g － 1 ． Under the optimized condition，the maximum
productivity of hypericin was 1. 44% ． The yield of hypericin under the optimized extraction conditions was greater
than that obtained from conventional solvent extraction． Conclusion:The present study demonstrates that ultrasonic
is a great efficient tool for the fast extraction of hypericin from H． perforatum
［Key words］ Hypericum perforatum;hypericin;ultrasonic extraction;fractional factorial design;response
surface methodology
贯叶连翘 Hypericum perforatum L．为藤黄科金丝
桃属植物，是近年来全世界最畅销的中草药之一。
金丝桃素被认为是贯叶连翘提取物中最具生物活性
的物质，具有多种药理作用，临床上已用于治疗基体
细胞癌、胰腺癌、脑瘤等［1-4］，体外试验发现其对多种
病毒均有杀灭作用，国外已完成其抗艾滋病的Ⅱ期
临床试验［5］。金丝桃素的特殊理化性质使得以往报
道的方法所得产品收率过低［6］，成为其进行深入研
究的桎梏。本实验以金丝桃素提取率为考察指标，
就该指标的超声提取的影响因素做了系统性研究。
通过单因素考察，选取了 5 个因素做部分析因试验，
对该试验确定的影响较大的 3 个因素采用响应面法
进行了优化，所得工艺条件下金丝桃素提取率远高
于其他工艺的报道，可为制药工业提供一定参考。
1 材料
高效液相色谱仪(美国 VARIAN)，DL-1000E 数
控双频恒温模具超声波清洗机(上海之信仪器有限
公司)，JA2003N 型电子天平(上海精密科学仪器有
限公司)，Pine-tree 纯水机(北京湘顺源科技有限公
司)。
贯叶连翘饮片，兰州安泰堂中药饮片有限公司，
经中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中兽药室
罗永江副研究员鉴定，金丝桃素对照品(纯度≥95%，
批号 142 311 810 609 064，Sigma 公司)，乙腈和甲醇，
色谱纯(山东禹王实业有限公司化工分公司)，去离子
水(本实验室自制)，其余试剂均为分析纯。
2 方法
2. 1 金丝桃素提取 精密称取贯叶连翘饮片 5. 00
g 于 100 mL 锥形瓶中，加入一定量的提取溶液，超
声提取金丝桃素，提取后溶液稀释 100 倍，过 0. 45
μm 高效液相色谱专用有机膜，用 HPLC 检测其金丝
桃素含量。全部实验应在避光或弱光条件下进行。
2. 2 金丝桃素提取率的测定
2. 2. 1 色谱条件 Agilent HC-C18色谱柱(4. 6 mm
× 250 mm，5 μm)，流动相乙腈-甲醇-乙酸铵缓冲液
(0. 30 mol·L － 1，pH 3. 75)50 ∶ 40 ∶ 10，检测波长 588
nm，流速 1 mL·min － 1，进样量 20 μL，柱温 25 ℃。
2. 2. 2 标准曲线的制备 取 1 mg 对照品储备液置
于 5 mL 量瓶中，用甲醇依次稀释为 10. 0，5. 0，2. 5，
1. 25，0. 625 mg·L － 1，依次注入高效液相色谱仪中，
按上述色谱条件测定。以质量浓度为横坐标，峰面
积为纵坐标，进行线性回归，求得回归方程为 Y =
68 247X(R2 = 0. 999)，金丝桃素在 0. 625 ～ 10. 0
mg·L － 1呈现良好的线性关系。
2. 2. 3 金丝桃素提取率的计算
金丝桃素提取率 = CVnm
× 100%
式中 C 为提取液中金丝桃素质量分数(g·L － 1)，V 为
提取液体积(mL)，n 为稀释倍数(本文为 100 倍)，m
为贯叶连翘质量(mg)。
2. 3 单因素试验 分别以不同的超声提取溶剂、溶
剂浓度、溶剂加碱量、提取时间、提取功率、料液比、
温度和提取级数等为因素，考察各因素对金丝桃素
提取工艺的影响。
2. 4 部分析因试验 根据单因素实验结果，采用 5
因素 2 水平的析因设计分析影响金丝桃素提取工艺
的主要因素，进行实验因素筛选。
·8·
第 17 卷第 11 期
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 17，No． 11
Jun．，2011
2. 5 响应面优化试验 在单因素和析因试验基础
上，确定影响金丝桃素提取工艺的显著因素，采用
Design Expert 7. 1. 6 统计分析软件的响应面法安排
实验，以获取最优化工艺参数。
3 结果与讨论
3. 1 单因素试验结果
3. 1. 1 超声提取溶剂对金丝桃素提取率的影响
精密称取 5. 00 g 贯叶连翘饮片 8 份，分别置于 100
mL 锥形瓶中。根据相关文献［6］，分别加入甲醇、无
水乙醇、丙酮、乙醇-水(4 ∶ 1)、甲醇-丙酮(1 ∶ 1)、乙
醇-丙酮(1 ∶ 1)、甲醇-乙醇(1 ∶ 1)、甲醇-乙醇-丙酮
(1∶ 1∶ 1)60 mL，超声提取 1 h(超声功率为 150 W)，
检测，结果见图 1。由图可知，乙醇-丙酮(1 ∶ 1)作为
超声提取溶剂时，金丝桃素提取率最高。因此，选用
乙醇-丙酮混合溶剂作为超声提取溶剂。
图 1 提取溶剂对金丝桃素提取率的影响
A. 甲醇;B. 无水乙醇;C. 丙酮;D. 乙醇-水(4∶ 1);
E. 甲醇-丙酮(1∶ 1)，F. 乙醇-丙酮(1∶ 1);
G. 甲醇-乙醇(1∶ 1);H. 甲醇-乙醇-丙酮(1∶ 1∶ 1)
图 2 丙酮体积分数对金丝桃素提取率的影响
3. 1. 2 乙酸-丙酮比例对金丝桃素提取率的影响
精密称取 5. 00 g 贯叶连翘饮片 11 份，置于 100 mL
锥形瓶中，分别加入丙酮-乙醇比为 0 ∶ 10，1 ∶ 9，2 ∶ 8，
3∶ 7，4∶ 6，5∶ 5，6∶ 4，7∶ 3，8∶ 2，9∶ 1，10∶ 0的混合溶液 60
mL，超声提取 1 h(超声功率为 150W)，测定金丝桃
素提取率，结果见图 2。由图可知，随着丙酮比例的
增加，金丝桃素提取率逐渐升高，当达到 7 ∶ 3时，金
丝桃素提取率达到最大;再增加丙酮比例，金丝桃素
提取率下降。因此，选用丙酮-乙醇(7 ∶ 3)作为混合
溶剂配比最优值。
3. 1. 3 溶液加碱量对金丝桃素提取率的影响 精
密称取 5. 00 g 贯叶连翘饮片 12 份，分别置于 100
mL 锥形瓶中。根据相关文献［7］，加入 NaOH 含量为
0，0. 01，0. 03，0. 06，0. 09，0. 12，0. 15，0. 20，0. 25，
0. 30，0. 35，0. 40 g 的乙醇-丙酮(3∶ 7)50 mL，超声提
取 1 h(超声功率为 150 W)。测定金丝桃素提取率，
结果见图 3。由图可知，加碱明显提高金丝桃素提
取率，可能原因是部分苯并二蒽酮类化合物在碱性
条件下转化为金丝桃素，但 NaOH 过多会造成金丝
桃素的分解。由于加碱量和提取率相关性不强，不
考虑对此因素做进一步考察，选择质量浓度为 2. 4
g·L － 1(即 0. 06 moL·L － 1)作为提取溶剂加碱量，与
文献［7］报道相同。
图 3 NaOH 加入量对金丝桃素提取率的影响
图 4 超声提取时间对金丝桃素提取率的影响
3. 1. 4 超声提取时间对金丝桃素提取率的影响
精密称取 5. 00 g 贯叶连翘饮片 10 份，分别置于 100
mL 锥形瓶中，加入乙醇-丙酮 (3 ∶ 7，NaOH 2. 4
g·L － 1)60 mL，超声提取 5，10，15，20，25，30，35，40，
45，50 min(超声功率为 150 W)，分别测定金丝桃素
提取率，结果见图 4。由图可知，前 30 min，随超声时
间增加，金丝桃素提取率升高，30 min 后，延长时间
对金丝桃素提取率提高不明显。因此，选用 30 min
作为超声提取时间最优值，同时，超声提取时间选择
在 20 ～ 40 min 做进一步优化。
·9·
郭凯，等:响应面法优化贯叶连翘中金丝桃素超声提取工艺
3. 1. 5 超声波功率对金丝桃素提取率的影响 精
密称取 5. 00 g 贯叶连翘饮片 8 份，分别置于 100 mL
锥形瓶中，加入乙醇-丙酮溶液(3 ∶ 7，NaOH 2. 4 g·
L － 1)60 mL，超声提取 50 min，超声功率分别为 100，
120，140，160，180，200，220，240 W，检测，结果见图
5。随着超声功率的增大，金丝桃素提取率逐渐升
高，到达 180 W 时，提取率达到最大;再增强超声功
率，金丝桃素提取率下降明显。可能是大功率的超
声波易导致金丝桃素分解，致使提取率下降。因此，
选用 180 W 作为超声提取功率最优值，同时，超声提
取功率选择在 160 ～ 200 W 做进一步优化。
图 5 超声提取功率对金丝桃素提取率的影响
图 6 液料比对金丝桃素提取率的影响
3. 1. 6 液料比对金丝桃素提取率的影响 精密称
取 5. 00 g 贯叶连翘饮片 10 份，分别置于 100 mL 锥
形瓶中，加入乙醇-丙酮(3 ∶ 7，NaOH 2. 4 g·L － 1)20，
30，40，50，60，80，100，120，150，200 mL，180 W 功率
提取 50 min，检测，结果见图 6。达到 12 mL·g － 1之
前，随着液料液料比增加，金丝桃素提取率增加;达
到 12 mL·g － 1之后，提取率随液料比增加而减小。
可能是因为增加提取溶剂量有利于金丝桃素的溶
出，使得金丝桃素提取率增加，但当金丝桃素溶出已
基本达到平衡时，再加入大量提取剂不但不能增加
提取率，还会阻碍超声波能量的传递，不利于金丝桃
素的提取。因此，选用 12 mL·g － 1作为料液比最优
值，同时，料液比选择在 10 ～ 14 mL·g － 1做进一步
优化。
3. 1. 7 不同提取温度对金丝桃素提取率的影响
提取时间为 50 min，超声波功率为 180 W，液料比为
12 mL·g － 1，分别加入乙醇-丙酮(3 ∶ 7，NaOH 2. 4 g·
L － 1)，考察不同提取温度对金丝桃素提取率影响，结
果见图 7。从图 7 可以看出，在 40 ℃时金丝桃素提
取率最高，可能是由于高温利于提取剂入侵细胞，有
利于金丝桃素的溶出，但高于 40 ℃时易引起金丝桃
素降解。因此，选用 40 ℃作为超声提取温度最优
值，同时，超声提取温度选择在 30 ～ 50 ℃做进一步
优化。
图 7 超声提取温度对金丝桃素提取率的影响
3. 1. 8 提取级数对金丝桃素提取率的影响 精密
称取 5. 00 g 贯叶连翘饮片，置于 100 mL 锥形瓶中。
加入乙醇-丙酮溶液(体积比为 3∶ 7，加 NaOH 的质量
浓度为 2. 4 g·L － 1)60 mL，在 180 W 功率下超声提取
50 min，抽滤。滤渣再加入 60 mL 提取溶剂进行第 2
次提取，提取方法同第 1 次。如此反复，直至萃取液
颜色接近无色，可以认为已完全提取。收集各次滤
液，检测，结果见图 8，随提取次数增加，金丝桃素提
取率逐次降低。第 1 次提取量占 3 次总提取量的
90%。考虑到生产成本，提取级数选择 1 次较合理。
图 8 提取次数对金丝桃素提取率的影响
3. 2 部分析因试验 综合单因素实验结果，取超声
时间、丙酮体积分数、液料比、超声提取功率和提取
温度 5 个因素进行 2-level fractional factorial 试验设
计，其实验设计与结果见表 1。
对表 1 结果进行分析可知，在实验的 5 个因素
中，超声时间、丙酮体积分数和液料比对金丝桃素提
取率影响比较显著，可考虑作为主要因素进行下一
步实验。
·01·
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Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 17，No． 11
Jun．，2011
表 1 2-Level Fractional Factorial 试验设计
No．
A 超声
时间 /
min
B 丙酮
体积分数
/%
C 液料比
/mL·g － 1
D 超声
提取功率
/W
E 提取
温度 / ℃
金丝桃素
提取率
/%
1 20 50 10 200 50 1. 12
2 40 50 10 160 30 1. 23
3 20 90 10 160 50 1. 17
4 40 90 10 200 30 1. 38
5 20 50 14 200 30 1. 18
6 40 50 14 160 50 1. 41
7 20 90 14 160 30 1. 37
8 40 90 14 200 50 1. 29
3. 3 响应面分析法优化工艺条件
3. 3. 1 响应面分析实验与结果 根据部分析因设
计所得结论，本试验对超声时间、丙酮体积分数和液
料比 3 个因素进行中心组合设计(central composite
design，CCD)，以金丝桃素提取率(%)为响应值，对
应于因变量 Y，其实验设计方案及结果如表 2 所示。
表 2 响应面设计方案及试验
No．
A 超声
时间 /min
B 丙酮
体积分数 /%
C 液料比
/mL·g － 1
金丝桃素
提取率 /%
1 20 50 10 1. 121
2 40 50 10 1. 329
3 20 90 10 1. 171
4 40 90 10 1. 379
5 20 50 14 1. 181
6 40 50 14 1. 411
7 20 90 14 1. 372
8 40 90 14 1. 300
9 13. 2 70 12 1. 072
10 46. 8 70 12 1. 401
11 30 36. 4 12 1. 341
12 30 103. 6 12 1. 381
13 30 70 8. 6 1. 340
14 30 70 15. 4 1. 298
15 30 70 12 1. 397
16 30 70 12 1. 434
17 30 70 12 1. 428
18 30 70 12 1. 440
19 30 70 12 1. 450
20 30 70 12 1. 437
3. 3. 2 中心组合设计的结果与分析 对实验数据
进行多项拟合回归，建立回归方程
Y = 1. 43 + 0. 083A + 0. 018B + 0. 014C － 0. 038AB －
0. 032AC － 2. 5 × 10 －3BC － 0. 072A2 － 0. 028B2 － 0. 043C2
对模型进行方差分析，结果见表 3。
由表 3 可知，本实验所选模型不同处理间差异
极显著(P ＜ 0. 05)，说明所拟合回归方程合适;决定
系数 R2 = 0. 903 5，说明回归方程拟合程度较好;变
异系数较低(3. 61)说明实验具有良好的稳定性。
表 3 回归模型方差分析
方差来源 f SS MS F P
模型 9 0. 220 0. 024 10. 40 0. 000 5
A 1 0. 093 0. 093 40. 04 ＜ 0. 000 1
B 1 0. 004 0. 004 1. 93 0. 195 3
C 1 0. 003 0. 003 1. 18 0. 303 2
AB 1 0. 011 0. 011 4. 91 0. 051 1
AC 1 0. 008 0. 008 3. 58 0. 087 8
BC 1 0. 000 0. 000 0. 022 0. 886 3
A2 1 0. 075 0. 075 32. 06 0. 000 2
B2 1 0. 011 0. 011 4. 82 0. 052 8
C2 1 0. 026 0. 026 11. 33 0. 007 2
误差 10 0. 023 0. 002 3
失拟项 5 0. 022 0. 004 3 13. 07 0. 006 8
变异系数 3. 61
R2 0. 903 5
由表 3 可知，超声时间(A)对金丝桃素提取率
的主效应明显(A 的 P ＜ 0. 000 1)，且在超声提取时
间(A)、丙酮体积分数(B)之间和超声提取时间
(A)、液料比(C)之间存在交互作用(PAB = 0. 051 1，
PAC = 0. 087 8)。根据系数值 A = 0. 083，B = 0. 018，
C = 0. 014，可知因素的主效应顺序为:超声提取时间
(A)、丙酮体积分数(B)、液料比(C)。
3. 3. 3 响应面图分析 由响应面回归分析和回归
方程拟合可以绘出响应面图形如图 9 ～ 11 所示。
图 9 超声提取时间和丙酮体积
分数对金丝桃素提取率的响应面
由图 9 ～ 11 可知，在试验范围内，金丝桃素提取
率随提取时间(A)增加而增大，随着丙酮体积分数
(B)增加先增大后下降，随液料比(C)增加先增大后
减小。这与单因素实验分析时的结果相吻合。金丝
桃素提取率的变化速率显示超声提取时间(A)主效
·11·
郭凯，等:响应面法优化贯叶连翘中金丝桃素超声提取工艺
图 10 超声提取时间和液料比对金丝
桃素提取率的响应面
图 11 丙酮体积分数和液料比对金丝桃素提取率的响应面
应大于丙酮体积分数(B)大于液料比(C)，与部分
析因设计和中心组合设计的统计结果相符。
3. 3. 4 最佳工艺条件的获取 为了确证各因素最
佳点，对已回归的非线性模型方程求一阶偏导，并令
其等于零，可以得到曲面的最大点，求导方程整理得
0. 083 － 0. 038B － 0. 032C － 0. 144A = 0
0. 018 － 0. 038A － 0. 0025C － 0. 056B = 0
0. 014 － 0. 032A － 0. 0025B － 0. 086C =
{
0
求解方程组得 A = 0. 615;B = － 0. 093;C = － 0. 065。
最后求得超声提取时间、丙酮体积分数、液料比的最
适值分别为 A = 36. 15 min，B = 68. 14% (体积比)，
C = 11. 87 mL·g － 1。此时，金丝桃素最大提取率
为 1. 454%。
经过 CCD 设计优化的最佳提取工艺参数为超
声提取时间为 36. 15 min、丙酮 /乙醇混合溶剂中丙
酮体积分数为 68. 14%、液料比为 11. 87 mL·g － 1，此
时金丝桃素提取率理论值可达到 1. 454%。验证实
验表明，提取率为 1. 440%，与理论值相符。因此，
该方法得到的提取条件参数较为可靠。
4 结论
利用响应面法得到的模型进行研究，得到最佳
工艺条件为超声提取时间 36. 15 min、丙酮 /乙醇混
合溶剂中丙酮体积分数 68. 14%、液料比 11. 87
mL·g － 1，此 时 金 丝 桃 素 提 取 率 理 论 值 可 达 到
1. 454%。验证试验表明，提取率 1. 440%，与理论值
相符。因此，该方法得到的提取工艺条件可行。
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［责任编辑 仝燕］
·21·
第 17 卷第 11 期
2011 年 6 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 17，No． 11
Jun．，2011