全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod ResDev 2006 , 18:569-576
文章编号:1001-6880(2006)04-0569-08
　
　
　收稿日期:2005-05-27　　　接受日期:2005-06-21
　基金项目:湖南省自然科学基金项目(03JJY5017)
＊通讯作者 Tel:86-744-8231386;E-mai l:duyatian6688@163.com
植物生长调节剂对南方红豆杉愈伤组织培养和
紫杉醇合成的影响
杜亚填1＊ ,陈建华2 ,许建宇1 ,曹　庸1 ,周朴华3
(1.吉首大学湖南省林产化工工程重点实验室;2.吉首大学城乡资源与规划学院 ,张家界 427000;
3.湖南农业大学生物科学与技术学院 , 长沙 410128)
摘　要:通过不同种类和水平植物生长调节剂对南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)愈伤组织诱导 、生长和紫
杉醇合成能力影响的研究发现:诱导培养初期 ,以无植物生长调节剂的 MS为基本培养基 , 在附加不同植物生长
调节剂组合作用下愈伤组织产生的时间和生长 、在相同植物生长调节剂组合作用下不同外植体愈伤组织的产
生时间和生长均表现出较显著差异 , 2 , 4-D/NAA高于 0.4 时 , 不利于南方红豆杉愈伤组织的诱导。转换到附加
不同植物生长调节剂组合的 B5 培养基上后 , 随培养继代次数的增加 , 生长差异逐渐缩小 , 直至不显著 , 表明参
考不同文献报道最优配方所设计的各植物生长调节剂组合对南方红豆杉愈伤组织的生长均较适宜 , 有利南方
红豆杉愈伤组织生长的植物生长调节剂优化组合没有唯一性。但不同调节剂组合作用下的同源愈伤组织中 、
相同调节剂作用下不同源愈伤组织中紫杉醇含量均存在着极显著差异 ,适当水平(2 mg/ L)的 2 , 4-D单用 , 或与
适当水平的KT、6-BA、KT+GA 配合使用 ,对南方红豆杉愈伤组织紫杉醇的合成较有利 , NAA则不太有利 , 幼茎和
叶愈伤组织产紫杉醇的水平较其它愈伤组织为高。
关键词:植物生长调节剂;南方红豆杉;紫杉醇;愈伤组织培养
中图分类号:Q813.1+2;Q946.88　　 文献标识码:A
Influence of Plant Growth Regulator on Taxus chinensis var.mairei
Callus Culture and Biosynthesis of Taxol
DU Ya-tian1＊ ,CHEN Jian-hua2 ,XU Jian-yu1 ,CAO Yong1 ,ZHOU Pu-hua3
(1.Forest Products Chemical Industry Engineering Key Laboratory of Hunan Province , Jishou University;
2.Town-village Resource &Program College , Jishou University , Zhangjiajie 427000 , China;
3.Bioscience &Biotechnology College , Hunan Agricultural University , Changsha 410128 , China)
Abstract:To explore the influence of different kinds and concentrations of plant growth regulators on induction , growth and
biosynthesis ability of taxol of Taxus chinensis var.mairei callus , various explants of T.mairei , including young stem , young
stems bark , cambium , immature needle , apical meristem were respectively inoculated on 8 kinds of callus-induction medium
containing MS basal salts and vitamins , 2% sucrose and different kinds of plant growth regulators with different concentrations ,
and were induced to produce callus and cultured for 3 ages(about 29 day.age-1), then the calluses were respectively transfered
on 8 kinds of callus-multiplication medium containing Gamborg B5 basal salts and vitamins , 3% sucrose and different kinds of
plant growth regulators with different concentrations.Taxol content of various callus cultures were analysed by HPLC when sub-
cultured for two ages(60 day).The result shows:for initial stages of inducing culture , the differences between the time of pro-
ducting callus and the growth value of callus were significant when the same callus was cultured in different medium containing
various regulator combination , or when different callus were cultured on the same medium containing certain regulator combina-
tion.The induction rate of T.mairei callus would be reduced when the concentration of 2 , 4-D to the concentration of NAA is
higher than 0.4.However , for following frequent subculturing , when these calluses were transferred on 8 kinds B5 callusmuliti-
DOI :10.16333/j.1001-6880.2006.04.010
plication medium , the above differences would be gradually deminished till insignificant.These results suggested that all the reg-
ulator combinations in callus-multiplication medium determined based on the optimization directions in reference , were beneficial
to the growth of T.mairei various callus , i.e..There are many optimized combinations of plant growth regulator suitable for the
growth of T.mairei callus.Nevertheless , there were significant difference between taxol content in the calluses , when the same
callus was cultured on different medium containing various plant growth regulator combination , or when different callus were cul-
tured on the same medium containing the certain regulator combination.Proper concentration of(2 mg/ L)2 , 4-D used indepen-
dently , or properly supplemented with KT , 6-BA or KT+GA , benefit the biosynthesis of taxol in T.mairei callus , but NAA is
not.The biosynthesis of taxol in young stem and leaf callus are higher than in other explant calluses.
Key words:plant growth regulator;Taxus chinensis var.maire;taxol;callus culture
　　南方红豆杉(Taxus chinensis(Pilg.)Rehd.var.
mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu.又称美丽红
豆杉)为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)在中
国的 1个变种[ 1] ,经研究发现其枝 、皮 、叶 、根和果肉
中均含有紫杉醇[ 2] ,故以其组织和细胞培养生产紫
杉醇的研究报道较多 ,但未见有关植物生长调节剂
种类和水平对其愈伤组织诱导 、生长和愈伤组织合
成紫杉醇影响的系统研究报道[ 3-12] 。所以 ,我们以
其幼茎 、较成熟幼茎皮 、形成层 、幼叶 、顶端分生组织
为原始诱导材料 ,以 MS附加不同水平和组合的 2 ,
4-D 、NAA 、KT 、6-BA 为愈伤组织诱导培养基 ,以 B5
附加不同水平和组合的 2 , 4-D 、NAA 、KT 、6-BA 、GA
为生产培养基 ,结合 HPLC 法检测 ,对该方面进行了
比较系统的研究 ,以探索植物生长调节物质对植物
次生代谢的调控作用 ,为组织或细胞大量培养工业
化生产紫杉醇提供基础。
1　材料与方法
1.1　南方红豆杉愈伤组织诱导 、培养
1.1.1　外植体
原始外植体:南方红豆杉幼茎 、较成熟幼茎皮 、
形成层 、幼叶 、顶端分生组织均自本室资源收集圃所
采南方红豆杉(1996年引种于桑植八大公山自然保
护区所培育约 7年生苗)春梢(茎皮为绿色)上获得 。
1.1.2　外植体消毒
将野外材料洗净后分剪成较成熟幼茎 、嫩枝 、带
幼叶枝梢三个部分 ,然后分别进行表面消毒处理 。
将带幼叶枝梢先用自来水冲洗干净 ,晾干表面水后 ,
分别用 75%酒精浸泡 5 s 、0.1%HgCl浸泡 20 min ,
无菌水清洗 7次后备用;将较成熟幼茎和嫩枝先用
自来水冲洗 2 h ,晾干表面水后分别用 75%酒精浸
泡15 s 、0.1%HgCl浸泡 20 min ,无菌水清洗 7次后
备用 。
1.1.3　培养基(表 1 ,表 2)
1.1.4　无菌接种
茎段:将已经消好毒的幼茎切去其上叶片 ,再切
成 0.5 cm 长的小段接入诱导培养基中。
较成熟幼茎皮:将已消好毒的较成熟幼茎用手
术刀小心刮去表面栓皮 ,后剥取周皮 , 将皮切成约
0.5×0.5 cm小块接入诱导培养基中(注意剥取周皮
时不要伤及形成层),裸茎杆留作削取形成层用 。
形成层:用手术刀小心切削剥皮后裸茎上的表
面形成层组织 ,然后切成小块接入培养基 。
发育未成熟幼叶:将已消毒带幼叶枝梢上发育
未成熟幼叶自叶柄基部切下 ,后切成 0.5 cm 长小段
接入诱导培养基中 。
顶端分生组织:用尖头镊子从取过幼叶的枝梢
顶端挑取顶端分生组织 ,接入诱导培养基中。
接种量:每一个处理接 5瓶(5个重复),每瓶接
5块外植体 ,共计有 40组实验 、200个重复 、约 1000
个外植体。
1.1.5　培养
暗诱导培养:温度 25±1 ℃、湿度 85%±5%和
温度23±1 ℃、湿度 80%±5%条件下各暗培养12 h
交替进行 ,诱导培养 7 d。
弱光诱导培养:经暗培养 7 d后 ,转为每天白天
温度 25±1 ℃、湿度 85%±5%、光照 1000 ～ 1200 Lx
弱光 ,夜晚温度 23±1 ℃、湿度 80%±5%黑暗条件
下 12 h 。
1.1.6　观测记录与数据处理
诱导时间:外植体接入诱导培养基后每天观察
一次 ,每个处理 5个重复中第 1块外植体长出愈伤
组织所需时间即为该处理的愈伤组织诱导时间 。计
算愈伤组织诱导率的公式:
愈伤组织诱导率(%)= 产生愈伤组织外植体个数接入外植体个数-被污染外植体个数 ×100%
在继代培养前观察记录愈伤组织的颜色 、形状
和生长状态 。
570 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.18
表 1　愈伤组织诱导培养基
Table 1　Callus-induction medium
Medium
number
Base
medium
2 , 4-D
mg/ L
6-BA
mg/ L
GA 3
mg/L
KT
mg/ L
NAA
mg/ L
Sucrose
g/ L
Agar
g/ L
pH
value
MS1[ 13] MS 3.0 - - - - 20 8 5.8
MS2[ 13] MS - - - - 3.0 20 8 5.8
MS3[ 13] MS 2.0 - - - 0.5 20 8 5.8
MS4[ 13] MS 0.5 - - - 3.0 20 8 5.8
MS5[ 16] MS 1.5 - - 0.5 - 20 8 5.8
MS6[ 17] MS - - 0.5 0.1 3.0 20 8 5.8
MS7[ 14] MS 1.2 2.8 - - 3.0 20 8 5.8
MS8[ 14] MS 1.2 2.8 - - 4.0 20 8 5.8
表 2　生产培养基
Table 2　Production medium
Medium
number
Base
medium
2 , 4-D
mg/ L
6-BA
mg/ L
GA3
mg/ L
KT
mg/L
NAA
mg/ L
CH
g/L
Coconut
mL/ L
Sucrose
g/ L
Agar
g/ L
pH
value
C1
[18] B5 2.0 - - - - - - 30 8 5.8
C2
[19] B5 2.0 0.1 - - - 1.0 - 30 8 5.8
C3
[13] B5 2.0 - - - 0.5 - - 30 8 5.8
C4
[16] B5 2.0 - - 0.5 - 1.0 100 30 8 5.8
C5
[13] B5 0.5 - - 0.5 1.0 - - 30 8 5.8
C6
[20] B5 2.0 - 0.5 1.0 - - - 30 8 5.8
C7
[16] B5 1.5 - - 0.5 - 1.0 100 30 8 5.8
C8
[17] B5 - - - 0.1 3.0 - - 30 8 5.8
1.2　南方红豆杉愈伤组织增殖继代培养
选取在 8种诱导培养基 (表 1)上诱导 、继代培
养了 3代以上 、黄绿色 、生长旺盛 、结构疏松 、大小一
致的 5种外植体来源愈伤组织 ,在无菌条件下转接
到8种生产增殖培养基(表 2)上进行增殖继代培
养 ,每一个处理接 5瓶(5个重复),每瓶接 5块愈伤
组织 ,共计有 40组实验 、200个重复 、约 1000块愈伤
组织 ,接入的每块愈伤组织大小基本保持一致 。
1.2.1　生产增殖培养
于25±1 ℃、湿度 85%±5% , 1000 Lx 左右光
下12 h ,23±1 ℃、湿度 80%±5%,黑暗 12 h ,连续
循环培养 2代(每代培养 30 d)。
1.2.2　观测记录与数据处理
愈伤组织块直径月平均生长量:经诱导培养基
诱导培养所获得愈伤组织继代接入生产增殖培养基
后每三天观测一次(共观测 10次),用直尺量取每块
愈伤组织最大方向上的直径 Dd+2(mm), 5瓶共 25
块愈伤组织每 3 d 第 3 d 最大方向直径的和为 ∑
Dd+225 ,若前一次观测的和为 ∑Dd25 ,则 ∑Dd+225-∑
Dd
25即为当次观测每处理 5重复 25块愈伤组织直径
3 d的总生长量 ,观测次数为 10次 ,每处理每块愈伤
组织直径的月均生长量的公式:
月均增长量= ∑(∑Dd+2
25-∑Dd25)10
25(或每处理愈伤组织总块数)(mm)
　　同时观察记录愈伤组织的颜色 、形状和生长状
态 。
1.3　紫杉醇含量检测
1.3.1　材料
将在生产培养基上继代培养了 2代的愈伤组织
按来源和处理不同分别收集冻藏待测 。
1.3.2　紫杉醇标准溶液的配制
用十万分之一天平准确称取紫杉醇对照品
2.94 mg ,用甲醇(色谱纯)溶解定容至 10 mL备用。
1.3.3　HPLC检测[ 15-19]
色谱柱:Sciencehome C18(4.60×250 mm , 5μm);
流动相:甲醇∶乙腈∶水(25∶35∶45 , v/v/v);进样量:5
μL(未经处理对照品为 1μL);灵敏度:0.01 Aufs;流
速:1 mL/min;柱温:40 ℃;检测波长:227 nm。
1.4　仪器与试剂
1.4.1　仪器设备
LC-9A高效液相色谱仪(日本岛津);SPD-6AV
紫外检测器(日本岛津);R-210薄膜旋转蒸发仪(日
571Vol.18 杜亚填等:植物生长调节剂对南方红豆杉愈伤组织培养和紫杉醇合成的影响 　
本);UC-55N恒温水浴(日本);AEL-4OSM 十万分之
一天平(日本岛津);冷冻干燥器;FD-230型红外水
分计(日本);生长室(LPH-300);无菌操作台(CCV-
1311);高压蒸汽灭菌锅(SM-52);干热灭菌箱(SG-
62);过滤装置;萃取装置 。
1.4.2　试剂与药品
除HPLC检测所用试剂与药品为色谱纯外 ,其
余均为分析纯。紫杉醇对照品购于中国药品生物制
品检定所。
2　结果与分析
2.1　植物生长调节剂对南方红豆杉愈伤组织诱导
培养的影响
2.1.1　对诱导时间的影响(表 3)
表 3　植物生长调节剂对愈伤组织诱导时间的影响
Table 3　Influence of plant growth regulators on the callus induced time
培养基中植物生长调节剂的组合与水平
Concentration of plant growth regulators in medium
愈伤组织诱导所需天数 Callus induced time(day)
Young stems Bark Cambium Needle Apical meristem
MS1:MS+3 mg/ L 2, 4-D 13 10 - 6 6
MS2:MS+3 mg/ LNAA 13 14 - 11 8
MS3:MS+2 mg/ L2 ,4-D+0.5 mg/ LNAA 13 41 - 11 8
MS4:MS+0.5 mg/ L2 , 4-D+3 mg/ LNAA 9 9 - 21 7
MS5:MS+1.5mg/L2 , 4-D+0.5 mg/ LKT 26 19 - 7 4
MS6:MS+3 mg/ LNAA+0.1 mg/ LKT+0.5 mg/ LGA3 12 44 - 11 8
MS7:MS+1.2 mg/ L2 , 4-D+3 mg/ LNAA+2.8 mg/ L6-BA 17 47 - 32 17
MS8:MS+1.2 mg/ L2 , 4-D+4 mg/ LNAA+2.8 mg/ L6-BA 9 12 - 13 7
　　结果显示 ,植物生长调节剂各组合对南方红豆
杉幼茎和较成熟幼茎皮的影响比较一致 , 2 , 4-D 与
NAA适当的组合较有利二者愈伤组织的快速诱导 ,
似乎与2 ,4-D/NAA的比值有关 ,组合为 2 mg/L 2 ,4-
D+0.5 mg/L NAA(比值为 4)时的明显不如组合为
0.5 mg/L 2 ,4-D+3 mg/L NAA(比值约为 0.17),在
有6-BA存在时差异更加明显(MS7与 MS8),较低的
该比值(0.16 ～ 0.3)较为有利。较高的 2 ,4-D(MS1:
3 mg/L)、或较低的 2 ,4-D(MS5:1.5 mg/L)适当增补
KT(0.5 mg/L)均较有利于幼叶愈伤组织的诱导 ,
NAA对幼叶愈伤组织的快速诱导不太适合 。顶端
分生组织启动最快 ,较低水平的 2 ,4-D或NAA对其
起动更有利 ,这可能与其本身的内源生长素水平较
高有关。形成层组织在各组合的作用下均未启动 ,
可能是取材不当所致 。总的看来 ,2 , 4-D/NAA高于
0.4时(MS7),不利于南方红豆杉愈伤组织的诱导 。
2.1.2　对诱导率的影响(表 4)
结果与 2.1.1的相接近 ,诱导率的结果进一步
证明 , 2 ,4-D/NAA的组合对南方红豆杉愈伤组织的
诱导影响较大 ,其比率大小应据材料不同而定 。3
mg/L 2 , 4-D条件下幼茎的诱导率只有 5%的结果 ,
是非正常现象 ,可能是材料和接种的原因所致。
表 4　植物生长调节物质对诱导率的影响
Table 4　Influence of plant growth regulators on percentage of callus induced
培养基中植物生长调节剂的组合与水平
Concentration of plant growth regulators in medium
愈伤组织诱导率Percentage of callus induced(%)
Stems Bark Cambium Needle Apical meristem
MS1:MS+3 mg/ L 2 ,4-D 5.00 100.00 - 93.33 100.00
MS2:MS+3 mg/LNAA 100.00 0 - 93.33 100.00
MS3:MS+2 mg/L2, 4-D+0.5 mg/ LNAA 100.00 75.00 - 100.00 100.00
MS4:MS+0.5 mg/ L2 , 4-D+3 mg/ LNAA 100.00 71.40 - 62.96 100.00
MS5:MS+1.5 mg/ L2 ,4-D+0.5 mg/ LKT 100.00 77.78 - 100.00 83.33
MS6:MS+3 mg/ LNAA+0.1 mg/ LKT+0.5mg/ LGA3 100.00 100.0 - 93.33 100.00
MS7:MS+1.2 mg/ L2 ,4-D+3mg/LNAA+2.8 mg/ 83.33 0 - 43.43 100.00
L6-BA
MS8:MS+1.2 mg/ L2 , 4-D+4 mg/ LNAA+2.8 mg/ 100.00 100.00 - 86.21 100.00
L6-BA
572 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.18
2.1.3对愈伤组织生长状况的影响(表 5)
表中所示结果与上述诱导率结果基本相对应 ,
除深褐色外 ,其它生长状态均为正常 。皮和叶愈伤
组织的颜色相对偏深。
表 5　植物生长调节剂对诱导培养基中各愈伤组织生长状态的影响
Table 5　Influence of plant growth regulators on the growth state of callus on induction medium
培养基Medium
Young stem apical meristem 愈伤组织种类 Young stem bark(callus) Needle
颜色
Colour
生长状态
Growth state
颜色
Colour
生长状态
Growth state
颜色
Colour
生长状态
Growth state
颜色
Colour
生长状态
Growth state
MS1 黄绿 Olivine 疏松 Friable 浅褐 Beige 疏松Friable 深褐Puce 紧密Tightness 黄绿Olivine 疏松 Friable
MS2 浅褐 Beige 疏松 Friable 黄绿Olivine 疏松Friable 浅褐 Beige 紧密Tightness 黄绿Olivine 疏松 Friable
MS3 黄绿 Olivine 疏松 Friable 黄绿Olivine 疏松Friable 浅褐 Beige 紧密Tightness 浅褐 Beige 疏松 Friable
MS4 黄绿 Olivine 疏松 Friable 浅褐 Beige 疏松Friable 浅褐 Beige 紧密Tightness 黄绿Olivine 疏松 Friable
MS5 深褐Puce 疏松 Friable 浅褐 Beige 疏松Friable 浅褐 Beige 紧密Tightness 黄绿Olivine 疏松 Friable
MS6 黄绿 Olivine 疏松 Friable 浅褐 Beige 疏松Friable 黄绿 Olivine 紧密Tightness 黄绿Olivine 疏松 Friable
MS7 浅褐 Beige 疏松 Friable - - 浅褐 Beige 紧密Tightness 浅褐 Beige 疏松 Friable
MS8 浅褐 Beige 疏松 Friable 浅褐 Beige 疏松Friable 浅褐 Beige 紧密Tightness 浅褐 Beige 疏松 Friable
2.2　植物生长调节物质对南方红豆杉愈伤组织生
长和紫杉醇合成量的影响
2.2.1　对愈伤组织生长的影响 (表 6 ～ 8)
结果显示 ,在生产培养基上培养的第一个月内 ,
植物生长调节剂的作用极显著 ,如幼茎皮愈伤组织 ,
其愈伤组织块最大方向直径的月均生长量最高是最
低的约 10倍 ,以 2 ,4-D附加适当水平的KT 为佳;顶
端分生组织的是近 18倍 ,形成层的是 5倍多 ,幼茎
和幼叶愈伤组织的差异虽不如上述显著 ,但最高也
是最低的2倍多(表 6)。愈伤组织生长状态与其生
表 6　植物生长调节物质对生产培养基中愈伤组织生长的影响(第 1月)
Table 6　Influence of plant growth regulators on callus growth on production medium(the first month)
培养基中植物生长调节剂的组合与水平
Concentration of plant growth regulators in medium
Every month average growth value of diameter of each callus mass(mm)
Young stems bark Young stem Callus cambium Immature needle Apical meristem
2 mg/L 2 , 4-D 0.31 1.87 0.33 0.49 0.09
2mg/L 2 , 4-D+0.1 mg/ L6-BA 1.00 2.63 0.23 0.32 0.13
2mg/L2 , 4-D+0.5 mg/ LNAA 0.82 1.49 0.37 0.30 0.25
2 mg/ L2 , 4-D+0.5 mg/LKT 1.41 3.28 0.31 0.79 0.45
0.5 mg/ L2 , 4-D+1 mg/ LNAA +0.5 mg/ LKT 1.37 3.18 0.49 0.54 0.29
2 mg/ L 2 , 4-D +1 mg/ LKT +0.5 mg/LGA3 0.98 3.38 0.41 0.45 0.27
1.5 mg/ L2 , 4-D+0.5 mg/ LKT 3.00 2.31 1.16 0.76 1.58
3 mg/ LNAA+0.1 mg/ LKT 0.92 2.21 0.44 0.71 0.41
表 7　植物生长调节物质对生产培养基中愈伤组织生长的影响(第 2月)
Table 7　Influence of plant growth regulators on callus growth on production medium(the second month)
培养基中植物生长调节剂的组合与水平
Concentration of plant growth regulators in medium
Every month average growth value of diameter of each callus mass(mm)
Young stems bark Young stem Callus cambium Immature needle Apical meristem
2 mg/L 2 , 4-D 1.64 2.03 1.30 1.47 1.51
2mg/L 2 , 4-D+0.1 mg/ L6-BA 3.04 2.25 1.60 2.03 1.90
2mg/L2 , 4-D+0.5 mg/ LNAA 2.46 2.21 0.87 1.41 1.31
2 mg/ L2 , 4-D+0.5 mg/LKT 2.10 2.46 0.78 1.66 1.77
0.5 mg/ L2 , 4-D+1 mg/ LNAA +0.5 mg/ LKT 1.69 1.90 0.92 1.43 1.25
573Vol.18 杜亚填等:植物生长调节剂对南方红豆杉愈伤组织培养和紫杉醇合成的影响 　
2 mg/ L 2, 4-D +1 mg/ LKT +0.5 mg/ LGA 1.35 1.46 0.67 1.47 0.94
1.5 mg/ L2 , 4-D+0.5 mg/ LKT 2.01 2.61 1.52 2.07 2.14
3 mg/ LNAA+0.1 mg/ LKT1.41 1.41 1.90 0.98 1.43 1.34
长量相对应 ,如幼茎皮愈伤组织在 2 mg/L 2 ,4-D和
3 mg/L NAA+0.1 mg/L KT 两个组合下的生长量均
较低 ,其愈伤组织的颜色均为深褐色 ,其它几种也是
一样 ,凡褐色 、深褐色愈伤组织的生长量均较低 ,但
少数浅褐色愈伤组织的生长量较高(表 8)。进入增
殖继代培养第 2个月后 ,所采用植物生长调节剂各
组合对各愈伤组织作用间的差异性出现显著缩小的
趋势(表 7)。如幼茎皮愈伤组织 ,最高与最低之间
由原来的10倍降到了 2倍多一点 ,顶端分生组织由
18倍也降到了 2倍多 ,原 2倍者则已几乎没有了差
异 。愈伤组织的生长状态更是如此 ,经第 2 个月培
养后 ,颜色均接近黄绿色 ,且生长均较疏散 。这与所
采用植物生长调节剂组合均参考各文献的优化组合
有关 ,说明对南方红豆杉愈伤组织培养有利的植物
生长调节剂组合可能有多种 。
表 8　植物生长调节物质对生产培养基中各愈伤组织生长状态的影响(第 1 月)
Table 8　Influence of plant growth regulators on growth state of various callus on production medium(the first month)
培养基Medium
愈伤组织颜色 Colour of various callus
愈伤组织种类 Callus
Stems Bark Cambium Needle Apical meristem
C1 黄绿 Olivine 深褐Thick brown 深褐 Thick brown 浅褐Thin brown 深褐 Thick brown
C2 黄绿 Olivine 黄绿Olivine 黄绿 Olivine 黄绿Olivine 黄绿 Olivine
C3 黄绿 Olivine 浅褐Thin brown 浅褐 Thin brown 褐　Brown 深褐 Thick brown
C4 黄绿 Olivine 黄绿Olivine 黄绿 Olivine 黄绿Olivine 黄绿 Olivine
C5 黄绿 Olivine 黄绿Olivine 黄绿 Olivine 褐　Brown 浅褐 Thin brown
C6 黄绿 Olivine 浅褐Thin brown 浅褐 Thin brown 褐　Brown 浅褐 Thin brown
C7 黄绿 Olivine 黄绿Olivine 黄绿 Olivine 浅褐Thin brown 黄绿 Olivine
C8 黄绿 Olivine 褐　Brown 深褐 Thick brown 浅褐Thin brown 浅褐 Thin brown
2.2.2　植物生长调节物质对南方红豆杉各愈伤组
织紫杉醇合成量的影响(表 9)
HPLC检测(图 1)结果(表 9)显示 ,植物生长调
节物质对南方红豆杉各外植体来源愈伤组织紫杉醇
合成量的影响 ,即存在不同调节剂组合对同一种愈
伤组织紫杉醇合成水平的影响差异(表 9纵行中的
差异),也存在同一调节剂组合对不同种愈伤组织作
用效果的差异(表 9横行中的差异),且两方面的差
异都极显著。根据检测图谱(图 1),分离效果较好 ,
结果完全可以作为依据。
　　2 mg/L 2 ,4-D仅对幼茎愈伤组织合成紫杉醇有
利 ,其愈伤组织中紫杉醇积累达到了 0.026%,其它
愈伤组织中的紫杉醇合成似乎受到了抑制 ,几乎未
检测出含量 。
2 mg/L 2 , 4-D+0.5 mg/L KT 仅对叶愈伤组织
有利 ,测得紫杉醇含量达为 0.027%(图 1A),与茎的
相接近 。
2 mg/L 2 ,4-D+1 mg/L KT +0.5 mg/L GA对幼
茎也较有利 ,其作用下愈伤组织中紫杉醇含量达
0.023%(图 1C),且对顶端分生组织愈伤组织也有
一定作用 ,其中检测到了 0.005%的紫杉醇含量 。
表 9　各愈伤组织培养物中紫杉醇的含量
Table 9　Taxol cotent in various callus cultures on subcultural-medium
培养基中植物生长调节剂的组合与水平
Concentration of plant growth regulators in medium
Taxol content in various callus cultures(%, dry weight)
Young stems Young stem bark Callus cambium Immature needle Apical meristem
C1:2 mg/ L 2 , 4-D 0.026 0.000 - 0.000 0.001
C2:2 mg/ L 2 , 4-D+0.1mg/L6-BA 0.006 0.004 0.002 0.009 0.000
574 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.18
C3:2 mg/L2, 4-D+0.5 mg/ LNAA 0.004 0.000 0.000 0.002 0.002
C4:2 mg/ L2 , 4-D+0.5 mg/ LKT 0.002 0.004 - 0.027 0.004
C5:0.5mg/L2 , 4-D+1 mg/ LNAA+0.5 mg/ LKT 0.001 0.000 - 0.027 0.004
C6:2 mg/ L 2 , 4-D +1 mg/ LKT +0.5 mg/ LGA3 0.023 0.004 - 0.000 0.005
C7:1.5 mg/L2 , 4-D+0.5mg/ LKT 0.001 0.000 - 0.012 0.009
C8:3mg/LNAA+0.1mg/LKT 0.000 0.000 - 0.000 0.004
　　注:表中数据均为 3次测定的平均值。
Note:Taxol content in various callus were average value from 3 times determinations by HPLC.
　　1.5 mg/L 2 , 4-D+0.5 mg/L KT 组合对南方红
豆杉愈伤组织紫杉醇的合成也较有利 ,在其作用下 ,
幼叶和顶端分生组织的愈伤组织中分别检测到了
0.012%和 0.009%的紫杉醇含量 。
2 mg/L 2 ,4-D+0.1mg/L 6-BA对顶端分生组织
愈伤组织紫杉醇的合成表现出抑制作用 ,对其他则
是否影响不大。但对愈伤组织生长最有利 ,该组合
培养基上愈伤组织的月平均生长量最高 。
2 mg/L 2 , 4-D+0.5 mg/L NAA 、0.5 mg/L 2 ,4-D
+1 mg/L NAA +0.5 mg/L KT 、3 mg/L NAA +0.1
mg/L KT 3 个组合作用下 ,各愈伤组织中均未检测
出或检出很低紫杉醇的含量。且对生长的作用也不
是太显著 。
由此认为 ,适当水平(2 mg/L)的 2 ,4-D单用 ,或
增补适当水平的 KT 、KT+GA 、6-BA配合使用 ,均较
有利于南方红豆杉愈伤组织紫杉醇的生物合成 ,而
NAA则似乎不太有利于其紫杉醇的合成 。C2 、C4 、
C7的结果是否与所加入CH 、Coconut Water天然复合
物有关 ,还有待实验验证。
3　讨论
本实验所采用植物生长调节剂种类和水平的各
个组合均根据苏应娟 、赵芳等[ 10-14]文献所报道的最
优组合设计而成。结果表明 ,在诱导初期NAA较2 ,
4-D要好 ,且表现出较强依赖调节剂组合的差异性 ,
但随培养时间的加长 ,植物生长调节剂作用的差异
性更多受愈伤组织植物组织细胞学起源差异性的影
响 。经过几代培养后 ,愈伤组织生长相关各方面的
差异性均迅速缩小 ,直至无显著性差异。由此认为 ,
南方红豆杉愈伤组织培养存在多个植物生长调节剂
的优化组合 ,本实验中所应用 8 种诱导培养基和 8
种生产培养基 ,除个别(如 MS7等)应加以改进外 ,
其余均可作为南方红豆杉愈伤组织培养的优化培养
基 ,并可根据初期的差异表现结合紫杉醇生产对其
实施进一步优化改进。
图 1　紫杉醇含量的HPLC 分析
Fig.1　HPLC chromatographic analysis of taxol content
A.Sample number 21;B.Taxol;C.Sample number 27
　　根据结果 ,南方红豆杉愈伤组织合成紫杉醇即
受植物生长调节剂的调控影响 ,又存在着愈伤组织
不同外植体起源间的差异 。2 ,4-D对南方红豆杉愈
伤组织紫杉醇的合成有促进作用 ,而 NAA 则似乎不
太有利 ,这可能与 2 , 4-D作为除草剂的独特作用机
理有关 ,有逆境调控概念。文中有多个处理均未能
检测出紫杉醇的含量 ,可能与所用 HPLC 法有关技
术参数 、分离柱 、检测器灵敏度等有关 ,不能认为其
中紫杉醇的含量为零 ,只能代表其中含量很低。
南方红豆杉愈伤组织和细胞悬浮培养 ,已有众
多成功的实验研究报道[ 2-12] ,但同时用 5种外植体 、
8种诱导培养基和 8种增殖培养基进行完全区组实
575Vol.18 杜亚填等:植物生长调节剂对南方红豆杉愈伤组织培养和紫杉醇合成的影响 　
验来全面验证多种植物生长调节物质不同组合和水
平的协同作用 ,尤其是南方红豆杉顶端分生组织愈
伤组织诱导 、培养及其生物合成紫杉醇的调控研究 ,
在国内外均还未见类似的报道 。
参考文献
1　 Pharmacopoeia Committee of the Ministry of Health PR China
(中华人民共和国药典委员会).China Pharmacopoeia , The
First Copy(中华药典 , 第 1 卷).Beijing:People s Medical
Publishing House , 1977.79.
2　 Su YJ(苏应娟), Wang T(王艇), Li XY(李雪雁), et al.
Analysis on the amounts of taxol in different location of Taxus
chinensis var.mairei.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开
发), 2000 , 13(2):19-20.
3　 Wang L(王丽), Qiu Y(仇燕),Wang G(王刚).Kinetic study
on suspension cultures of Taxus chinensis var.mairei.J Hebei
Normal Univ , Nat Sci(河北师范大学学报 ,自科版), 2003 ,
27:81-83.
4　 Su YJ(苏应娟),Wang T(王艇), Li XY(李雪雁), et al.Two
factors in effect cell growth of Taxus chinensis var.mairei and
taxol content.Ecologic Sci(生态科学), 2001 , 20(4):12-15 .
5　 Qiu Y(仇燕), Jia N(贾宁),Wang L(王丽), et al.Effects of
subculture time on the growth and taxol production in Taxus
chinensis var.mairei cell.J Hebei Normal Univ , Nat Sci(河北
师范大学学报 , 自科版), 2002 , 26:301-304.
6　 Wang YD(王艳东),Ma ZY(马振毅), Yuan YJ(元英进).
Studies on apoptosis and apoptotic kinetics in Taxus chinensis
var.mairei cells of suspension culture treated with taxol.Chem
Engin(化学工程), 2002 , 30(5):53-57.
7　 Yuan YJ , Li C ,Hu ZD, et al.A double oxidative burst for taxol
production in suspension cultures of Taxus chinensis var.mairei
induced by oligosaccharide from Fusarium oxysprum.Enzyme
and Microbial Technology , 2002 , 30:774-778.
8　 Yuan YJ , Li C , Hu ZD, et al.Fungal elicitor-induced cell
apoptosis in suspension cultures of Taxus chinensis var.mairei
for taxol production.Process Biochemistry , 2002 , 38:193-198.
9　 Zhang ZQ(张宗勤), Yang JY(杨建英), Wu YW(吴耀武).
Taxol production in tissue culture of Taxus chinensis var.
mairei.Acta Bot Boreal Occident Sin(西北植物学报), 1998 ,
18:488-492.
10　Su YJ(苏应娟),Wang T(王艇), Yang LX(杨礼香), et al.
Induction and culture on callus of Taus chinensis var.marirei
bud.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)2001 , 32:637-639.
11　Zhao F(赵芳), Ni L(倪良), Geng Z(耿征), et al.Studies on
the tissue culture of Maire Yew (Taxus chinensis var.mairei)
Ⅰ .Callus inducement and optimization of the culturing meth-
ods.Chin Tradit Herb Drugs(中草药), 1999 , 30:213-215.
12　Yang LX(杨礼香), Zhou SY(周诗毅).The tissue culture and
the determination of taxol content in callus of Taxus chinensis
var.mairei.J Central Chin Normal Univ , Nat Sci(华中师范
大学学报 ,自科版), 2001 , 35:453-455.
13　Luo JP(罗建平), Niu BT(牛炳韬), Jia JF(贾敬芬).Estab-
lishment of tissue culture from Taxus yunnanensis.Chin J
Biotech(生物工程学报), 1997 , 13:326-330.
14　Sun BX(孙彬贤), Zhang GY(章国瑛), Liu D(刘涤), et al.
Comparison of growth and paclitaxel content in 4 Taxus cell
suspensions.Plant Physiol Commun(植物生理学通讯),
1999 , 35:279-280.
15　Zhao F(赵芳), Geng Z(耿征), Liu QG(刘谦光), et al.De-
termination of taxol in tissue culture of Taxus mairei by re-
versed phase high performance liquid chromatography.Chin J
Anal Chem(分析化学), 1997 , 25:941-943.
16　Zhang ZQ(张志强), Wang YS(王云山), Su ZG(苏志国).
The purification of taxol with reversed phase chromatography at
normal pressure.Chem J Chin Univ(高校化学学报), 2001 ,
15:56-60.
17　Xu XZ(许学哲).Study on extraction and sepration of taxol.J
Yanbian Univ , Nat Sci(延边大学学报 ,自科版), 1998 , 24:
42-44.
18　Zhang S(张姝), Yu F(余斐),Wang CG(王传贵), et al.The
effect of ultrasound on the cell growth and release of taxol.
Biotech(生物技术), 2001 , 11(2):14-17.
19　Chen HT(陈海涛), Wei ZJ(未作君), Yuan YJ(元英进).
Basic study on taxol separation from the organic solvents in
two-liquid phase cultures of Taxus cells.Chem Indus Engin
(化学工业与工程), 2001 , 18(2):99-103.
576 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.18