全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2007, 19:741-744
文章编号:1001-6880(2007)05-0741-04
　
　
　收稿日期:2006-03-29　　　接受日期:2006-05-08
　基金项目:国家自然科学基金项目(20262004, 20562008);江西省
教育厅资助项目(赣财教 [ 2003] 73号)
＊通讯作者 Tel:86-791-3969514;E-mail:cswyyy@nc.jx.cn
丰城鸡血藤黄酮提取物清除自由基活性研究
余燕影 1＊ ,章丽华 1 ,曹树稳 2
1南昌大学化学系 ,南昌 330047;2南昌大学食品科学教育部重点实验室 ,南昌 330047
摘　要:本文考察了丰城鸡血藤不同提取物对· DPPH、O2-·和· OH清除活性 ,分别采用紫外可见分光光度法 、
邻苯三酚自氧化法和 Fenton反应-邻菲罗啉显色法 , 测定受试物对 · DPPH、O2-· 和· OH的清除活性 。实验结
果表明受试物对· DPPH清除活性较强 ,对 O2-·的清除活性次之 , 对· OH的清除活性较弱。丰城鸡血藤不同
提取物黄酮组成和含量存在差异 ,其自由基清除活性也有所不同 ,提示它们的自由基清除作用机制和生物活性
可能存在差异 。
关键词:丰城鸡血藤;黄酮;自由基清除
中图分类号:Q949.751.9;R285.5 文献标识码:A
InvestigationonFreeRadicalScavengingActivityof
FlavonoidExtractsfromMiletlanitidaBenth.var.hirsutissimaZ.Wei
YUYan-ying1＊ , ZHANGLi-hua1 , CAOShu-wen2
1DepartmentofChemistry, NanchangUniversity, Nanchang330047 , China;
2KeyLaboratoryofFoodScienceofMinistryofEducation, NanchangUniversity, Nanchang330047 , China
Abstract:TheactivityofflavonoidextractsfromMiletlanitidaBenth.var.hirsutisimaZ.Weiinfreeradicalscavenging
of· DPPH, O2-· and· OHwasinvestigated.Theactivityofthetestedcompoundsinfreeradicalscavengingof· DP-
PH, O2-· and· OHwasdeterminedbyUV-visspectrophotometry, pyrogalolautoxidationmethodandFentonreaction
witho-phenanthrolinechromogenicreaction, respectively.Theresultshowedthattheactivityofthetestedcompoundsfor
freeradicalscavengingof· DPPHwasstrongerthanthatforO2-· and· OH, theactivityinfreeradicalscavengingof
· OHwastheweakest.Theactivityinfreeradicalscavengingwaschangedwiththeextractscontainingdiferentfla-
vonoidsorflavonoidswithdiferentcontentssuggestingthattheirmechanismoffreeradicalscavengingandbioactivity
maybediferent.
Keywords:MilletlanitidaBenth.var.hirsutissimaZ.Wei;flavonoid;freeradicalscavenging
　　丰城鸡血藤 , 又名香花崖豆藤 Miletilanitida
var.Benth.var.hirsutissimaZ.Wei,是一味传统中药 ,
入药历史悠久。中医认为其有补血活血 、舒经活络
之功效 ,用于治疗月经不调 、血虚萎黄 、麻木瘫痪 、风
湿痹痛等症 [ 1] 。研究表明 ,丰城鸡血藤主要含黄酮
类化合物 ,且多为异黄酮甙元 [ 2, 3] 。一般来说 ,黄酮
类化合物具有较好的自由基清除活性 ,且其清除活
性与黄酮的种类和含量有一定的关系 。目前 ,对丰
城鸡血藤的研究仅见少量关于其化学组成[ 3]和促
进肝细胞 DNA复制的有关药理作用报道[ 4] ,而关于
其清除自由基活性研究则未见报道。
本文通过比较丰城鸡血藤几种黄酮提取物对自
由基清除活性的差异 ,探讨提取物活性成分组成与
清除自由基活性之间的关系 ,为进一步研究丰城鸡
血藤黄酮提取方法及生物活性或药用价值奠定基
础。
1　仪器和试剂
　　UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津)。
大豆黄素 、美皂异黄酮(美国 Sigma公司产品),
葛根素 、木犀草素 、染料木素 、芹菜素 、刺芒柄花素
(≥98%, HPLC测定 ,陕西慧科植物开发有限公
司), 1, 1-二苯基苦基苯肼 (1, 1-Diphenyl-2-picryl-
hydrazyl, DPPH)(美国 Sigma公司产品), Tris试剂
(进口分装),二丁基羟基甲苯(BHT)、邻苯三酚 、硫
酸亚铁 、邻菲罗啉 、过氧化氢等试剂均为国产分析
纯 ,所用水为二次蒸馏水。
AB-8和 S-8为南开大学化工厂产品。
丰城鸡血藤采自江西丰城市罗山乡 ,采集时间
2002年 10月 21日 ,经南昌大学生物系杨柏云教授
鉴定为丰城鸡血藤 ,其藤茎经干燥 、粉碎后密封包装
储藏于 南昌大 学化 学系实 验室 , 标本 号为
20021021。
2　方法
2.1　丰城鸡血藤黄酮提取物的制备
丰城鸡血藤藤茎干料用 90%乙醇和 2%HCl回
流提取 ,过滤 ,滤液用 NaHCO3中和后(pH5.2)再
过滤 ,滤液减压蒸除乙醇 ,得提取物。取提取物用乙
酸乙酯回流提取 ,分液漏斗分离 ,减压蒸除有机溶
剂 ,得乙酸乙酯可溶部分;另取提取物分别用 AB-8
和 S-8两种大孔吸附树脂吸附 ,依次用水和 70%乙
醇洗脱 ,将 70%醇洗脱液减压蒸干 ,得对应的大孔
树脂纯化产物。分别取一定量真空干燥后的上述各
种提取物用 70%乙醇配制成所需浓度的待测试液 。
2.2　总黄酮含量测定
按文献 [ 5]方法以染料木素为对照品紫外光度
法测定 。
2.3　样品黄酮组成及含量 HPLC分析
HPLC系统:Agilent1100高效液相色谱仪
(G2180AA色谱工作站 ), 二极管阵列检测器 ,
SpherisordODS柱(250 mm×4 mm, 5 μm);流动相:
0.1%磷酸(A)-乙腈(B);梯度条件:0 ～ 10 min100
～ 90% A, 10 ～ 16min90 ～ 85%A, 16 ～ 21min85%
A, 21 ～ 32 min85 ～ 80% A, 32 ～ 42 min80 ～ 75%
A, 42 ～ 43 min75 ～ 70% A, 43 ～ 48 min70% A, 48
～ 58min55%A, 58 ～ 64min40%A, 64 ～ 70min40
～ 100% A;流速:0.8 mL/min;检测波长:260 nm;
G1313A自动进样器 ,进样量:10μL。
单一黄酮含量测定采用外标法峰面积定量。
2.4　清除自由基能力试验
2.4.1　DPPH自由基清除能力试验
按文献[ 6]方法采用紫外可见分光光度法定量
测定 。
2.4.2　超氧自由基清除能力试验
采用邻苯三酚自氧化法 [ 7]进行测定 。
2.4.3　羟基自由基清除能力试验
参考文献 [ 8]方法并略加改进:配制含有邻菲罗
啉 0.375mmol、硫酸亚铁 0.375mmol、Tris-HCl缓冲
溶液(pH为 6)0.04 mol、过氧化氢 0.1%和不同浓
度的待测试液的 5 mL70%乙醇溶液 , 37 ℃超级恒
温水浴中反应 60min, 在 53 6nm处测量吸光值 A,
图 1　丰城鸡血藤提取物的 HPLC图谱
Fig.1　HPLCchromatogramofextractsfromMilletlanitidaBenth.var.hirsutissimaZ.Wei
　　a.对照品 Standardsamples;b.乙酸乙酯可溶部分 Ethylacetatefraction;c.AB-8树脂纯化产物 ExtractpurifiedbyAB-8;d.S-8树脂
纯化产物 ExtractpurifiedbyS-8
1.对羟基苯甲酸 p-Hydroxybenzoicacid;2.葛根素 Puerarin;3.大豆黄素 Daidzein;4.木犀草素 Luteolin;5.染料木素 Genistein;6.芹
菜素 Apigenin;7.刺芒柄花素 Formononetin;8.美皂异黄酮BiochaninA
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表 1　丰城鸡血藤提取物中各黄酮的含量(mg/g,干基计)
Table1　ContentsofflavonoidextractsfromMilettlanitidaBenth.var.hirsutissimaZ.Wei(mg/g, drywt)
样品
Sample
葛根素
Puerarin
大豆黄素
Daidzein
木犀草素
Luteolin
染料木素
Genistein
芹菜素
Apigenin
刺芒柄花素
Formononetin
美皂异黄酮
BiochaninA
总黄酮
Totalflavonoids
乙酸乙酯可溶部分 0.171 1.986 1.379 1.943 1.338 9.504 0.452 48.261
AB-8纯化产物 2.610 1.017 1.635 1.477 - 0.565 - 50.212
S-8纯化产物 1.283 2.097 3.471 7.342 - 3.729 - 89.634
按下式计算清除率:
清除率(%)=(A加药 -A样品)-A损伤A未损 -A损伤 ×100
　　式中 , A未损不加 H2O2和待测试液 , A损伤加 H2O2
不加待测试液 , A加药加 H2O2和待测试液 , A样品待测
试液空白。
3　结果与讨论
3.1　提取物黄酮含量及组成 HPLC分析
丰城鸡血藤几种提取物的 HPLC分析结果见图
1,各组成含量和总黄酮含量见表 1。
3.2　清除自由基活性
按测定方法测定丰城鸡血藤提取物及对照品
(BHT)清除自由基的最大活性(逐渐增加样品浓度
至自由基清除率不再提高为止 ,此时样品自由基清
除率即为其清除自由基的最大活性)和半数清除浓
度(SC50 ,清除率达到 50%时受试样品的浓度),结
果见图 2及表 2。
　　一般来说 ,样品的 SC50值越小 ,其清除自由基活
性便越强。由实验结果可见 ,同种提取物清除自由
基活性为:清除· DPPH自由基活性 >清除 O2-·自
由基活性 >清除 · OH自由基活性。不同提取物清
除自由基活性为:S-8树脂提纯物清除三种自由基
图 2　丰城鸡血藤提取物清除自由基活性
Fig.2　Freeradicalscavengingactivityofextractsfrom
MiletlanitidaBenth.var.hirsutisimaZ.Wei
1.乙酸乙酯可溶部分 Ethylacetatefraction;2.AB-8纯化产物
ExtractpurifiedbyAB-8;3.S-8纯化产物 ExtractpurifiedbyS-
8;4.二丁基羟基甲苯 (BHT)
表 2　受试样品清除自由基的半数浓度
Table2　SC50 valueofsamplesonfreeradical
受试样品 Sample SC50(mg/mL)DPPH· O2-· OH·
乙酸乙酯可溶部分 0.177(0.854×10-2)
4.324
(0.209) -
AB-8纯化产物 0.167(0.840×10-2)
3.446
(0.173) -
S-8纯化产物 0.143(1.279×10-2)
1.952
(0.175) 19.814
二丁基羟基甲苯 0.187 0.235 -
　　括号内数据为清除率达 50%时 ,受试样品中总黄酮含量。
Valuesinbracketsarethecontentsoftotalflavonoidsofsamplesat
SC50.
活性最大 ,均强于乙酸乙酯可溶部分和 AB-8树脂
提纯物 ,这可能与 S-8树脂提纯物中黄酮含量有关 ,
因为 S-8树脂提纯物黄酮总量是三种提取物中含量
最大者 ,且 AB-8树脂提纯物与 S-8树脂提纯物虽说
黄酮组成基本相同 ,但各组分含量却不相同 ,即 S-8
树脂提纯物各组分含量均大于 AB-8树脂提纯物;
乙酸乙酯可溶部分和 AB-8树脂提纯物虽然总黄酮
含量相近 ,但黄酮组成和含量却有所不同 ,因而清除
自由基活性有所差异 ,即清除 O2-·自由基活性乙酸
乙酯可溶部分弱于 AB-8树脂提取物 ,而清除 DPPH·
自由基和 · OH自由基活性两者却相似。由 HPLC
图谱分析可知 ,乙酸乙酯可溶部分主要成分的出峰
时间在 37 min之后 , AB-8树脂提纯物主要成分的
出峰时间在 40 min之前 ,两种提取物的主要成分有
较大差异 ,这结果预示着清除 DPPH·自由基 、O2-·
自由基和 · OH自由基作用的物质基础和 /或作用
机理可能有所不同 。
此外 ,丰城鸡血藤提取物对羟基自由基清除活
性很弱 ,这与通常文献报道的黄酮类化合物具有较
强的羟基自由基清除活性有一定的出入 ,这一结果
可能与丰城鸡血藤提取物中所含的黄酮类化合物的
种类和含量有关。文献报道 ,黄酮类化合物 B环上
带有两个邻位羟基时 ,其自由基清除活性较强 ,且 B
743Vol.19 余燕影等:丰城鸡血藤黄酮提取物清除自由基活性研究
环上羟基活性大于 A环上羟基活性[ 9] 。由提取物
中黄酮组成 HPLC分析结果可知 ,检测到的黄酮类
化合物大豆黄素 、染料木素和芹菜素等 B环上只带
有一个羟基 ,而刺芒柄花素和美皂异黄酮 B环上的
羟基则被甲基化 ,因而 ,它们对羟基自由基清除活性
便较弱 。
再者 ,几种提取物清除自由基活性与阳性对照
品 BHT相比 , S-8树脂提纯物清除自由基活性均比
BHT要强;AB-8树脂提纯物和乙酸乙酯可溶部分虽
然清除 O2-· 自由基活性比 BHT要弱 ,但清除 DPPH·
自由基活性比 BHT强 , 清除 · OH自由基活性与
BHT相近。由此可见 ,丰城鸡血藤黄酮提取物具有
较强的自由基清除活性。
4　结论
　　不同方法制备的丰城鸡血藤提取物黄酮组成和
自由基清除活性存在着差异 ,提示它们的生物活性
和药效作用亦有可能存在差异 ,这对丰城鸡血藤活
性成分及药用价值的研究具有一定的意义 ,值得进
一步研究。
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