全 文 ：• 1696 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2012年6月第27卷第6期 CJTCMP , June 2012, Vol . 27, No. 6
通讯作者：舒琦瑾，浙江省杭州市邮电路54号浙江中医药大学附属第一临床医学院肿瘤科，邮编：310006，电话：0571-87072196
E-mail：shuqjhz@yahoo.com.cn
·研究报告·
南方红豆杉水提物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡
与紫杉醇抑瘤机制不同的研究
徐颖扉1，张晶2，舒琦瑾1
（1浙江中医药大学附属第一临床医学院肿瘤科，杭州 310006；2杭州市萧山中医院肿瘤科，杭州 311201 )
摘要：目的：初步探讨南方红豆杉水提物抗人肺腺癌A549细胞（以下简称“A549细胞”）的作用机制，明确其与
紫杉醇抗肿瘤机制的不同。方法：以流式细胞仪检测南方红豆杉水提物对A549细胞凋亡的影响，以紫杉醇为对照；
以普通光学显微镜观察南方红豆杉水提物和紫杉醇对A549细胞形态的影响；以Western blotting检测细胞凋亡相关蛋
白P-jnk的表达。结果：①流式细胞检测及光镜观察发现南方红豆杉水提物处理后A549细胞呈典型的早期凋亡表现
（P<0.05，P<0.01），而紫杉醇组细胞以坏死及晚期凋亡表现为主（P<0.05，P<0.01），且其比例均呈现一定的剂量-效
应关系；②Western blotting检测发现南方红豆杉水提物处理后A549细胞P38蛋白表达无明显变化、P-jnk蛋白随药物
浓度增加表达减少（P<0.01）。结论：南方红豆杉水提物抗A549细胞的机制与紫杉醇不同，其作用机制主要与诱导肿
瘤细胞凋亡有关。
关键词：南方红豆杉；紫杉醇；肺癌；凋亡
基金资助：浙江省自然基金项目（No.Y2081051），浙江省中医药管理局重点项目（No.2009ZA003）
Study on mechanisms of inducing apoptosis with aqueous extract of Taxus chinensis and
paclitaxel inhibitory effect in human lung carcinoma A549 cells
XU Ying-fei1, ZHANG Jing2, SHU Qi-jin1
( 1Department of Oncology, the First Affi liated Hospital, Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou
310006, China; 2Department of Oncology, Hangzhou Xiaoshan District Hospital of Traditional Chinese Medicine,
Hangzhou 311201, China )
Abstract: Objective: To preliminary study the inhibitory mechanisms of aqueous extract of Taxus chinensis and
differences with paclitaxel in vitro cultured human lung carcinoma A549 cells. Methods: Effects on cell apoptosis was inspected
by fl ow cytometry; morphology of the A549 cell was observed by ordinary optical microscope; expression of apoptosis-related
proteins P-jnk was detected by Western blotting. Results: ①Optical microscope and FCM found typical manifestations of early
stage tumor cell apoptosis in aqueous extract of Taxus chinensis arm(P<0.05, P<0.01), meanwhile, the tumor cells showed
manoifestations by necrosis and later stage apoptosis in paclitaxel arm(P<0.05, P<0.01). And a dose- effect curve were showed
in all arms. ②The results detected by Western blotting showed that P38 protein expression was unchanged, and P-jnk protein
expression was decreased with the increase of drug concentration in aqueous extract of Taxus chinensis arms(P<0.01). Conclusion:
The aqueous extract of Taxus chinensis has different anti-tumor mechanisms with paclitaxel, and these possibly related to inducing
apoptosis of human lung carcinoma A549 cells.
Key words: Taxus chinensis; Paclitaxel; Lung cancer; Apoptosis
Fund assistance: Natural Fund Projects In Zhejiang Province(No.Y2081051), Major Project of Zhejiang Province
Administration of Traditional Chinese Medicine(No.2009ZA003)
南方红豆杉为红豆杉科红豆杉属植物，主要分布在我国长
江流域、南岭山脉等地区的山地或溪谷[1]，是第四纪冰川遗留
下来的古老树种，在地球上已有250万年的历史。南方红豆杉枝
叶中含有紫杉醇、10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ等数种抗肿瘤活性物质，
对肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤具有良好疗效[2-3]。其醇提物紫杉
醇作为最具活性的化疗药物之一在临床得到了广泛的应用。
南方红豆杉性味苦、平，有小毒，归心经。功效消肿散结，
主治：肿瘤、肾病、风湿等，其水煎剂在中医药中早有应用，且
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安全有效。尽管如此，与紫杉醇混淆徒增医患担忧。遗憾的是，笔
者迄今国内外并未见南方红豆杉水提物抑制肿瘤的研究报道。
本研究将应用现代先进实验技术方法，初步探讨南方红豆
杉水提物诱导人肺腺癌A549细胞（以下简称“A549细胞”）凋
亡的机制及与紫杉醇抑瘤机制的不同。
材料
1. 细胞株 A549细胞株购自中国科学院上海细胞生物学
研究所，由浙江省中心实验室培养传代，实验中所用为生长状
况良好的细胞。
2. 药品与试剂 南方红豆杉：购自浙江省中医院中药
房，宁波泰康红豆杉生物工程有限公司生产，规格：8g/袋。紫
杉醇注射液：购自太极集团四川太极制药有限公司，批号：
H19994040，规格：5mL/30mg。Hylcone胎牛血清：美国Thermo
公司。RPMI-1640培养液：吉诺生物医药技术有限公司。凯基
Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒：南京市凯基生物技术
有限公司。P38（批号：0043）、P-jnk（批号：0017）、β-action
一抗（批号：0023）：美国Santa Cruz公司。羊抗鼠二抗（批号：
0011）、羊抗兔二抗（批号：0021）：美国Santa Cruz公司。化学
发光试剂A、B：美国Millipore公司。
3. 仪器 3111型水套式CO2细胞培养箱：美国Thermo公司；
Elx808型酶标仪美国BioTek公司；FACS Calibur流式细胞仪：美
国BD公司；MP4+ChemidocXRS型蛋白印记检测系统 ：美国Bio-Rad
公司；BX20型荧光显微镜摄像机：日本OLYMPUS公司。
方法
1. 细胞培养 实验中所用为生长状况良好的人肺腺癌
A549细胞。细胞培养液均为含10%胎牛血清的RPMI-1640培养
液，培养条件均为37℃、含5%CO2的细胞培养箱内。待细胞长
满瓶底后，弃掉培养液，用１mL胰酶消化1min左右，镜下观察
到细胞分离变圆、细胞间隙增大后，立即停止消化，更换培养
液，分瓶培养，取对数生长期细胞用于实验。
2. 光镜观察细胞形态 取对数生长期A549细胞用0.25%
胰酶-EDTA消化，制成2×105/mL细胞悬液接种于60mm无菌培
养皿中，50×104个/皿。37.5℃、5%CO2培养箱内培养24h贴壁后
弃上清液，空白对照组加入10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，
药物组浓度分别为：南方红豆杉水提物（600、800、1 000μg/
mL），紫杉醇（6、8、10μg/mL）。培养24h后，光镜观察细胞形
态变化。
3. 流式分析细胞凋亡 取对数生长期A549细胞，制
成2×105/mL细胞悬液接种于60mm无菌培养皿中，50×104
个/皿。37.5℃、5%CO2培养箱内培养24h贴壁后弃上清液，用
RPMI-1640培养液稀释药物，南方红豆杉红豆杉水提物浓度分
别为600、800、1 000μg/mL，紫杉醇浓度分别为6、8、10μg/mL，
作用于细胞24h后，用不含EDTA的胰酶消化（防止消化过度引
起假阳性），终止，2 000r/min离心5min，收集细胞，用PBS洗涤
注：A.空白对照组；B.6μg/mL紫杉醇组；C.8μg/mL紫杉醇组；
D.10μg/mL紫杉醇组；E.600μg/mL南方红豆杉组；F.800μg/mL南
方红豆杉组；G.1 000μg/mL南方红豆杉组。图2同。
A B
C D
E F
G
图1 光镜观察南方红豆杉水提物和紫杉醇处理后A549细胞
形态变化（×100）
细胞2次，收集细胞数约3×105个，加入500μL的结合缓冲液Bind
Buffer悬浮细胞，分别加入5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶，
混匀后室温避光孵育15min，上流式细胞仪检测分析，激发波长
为488nm。实验重复3次，并用随机软件进行数据分析。
4. Western blotting检测相关蛋白的影响 冰上操作，每瓶
细胞加250-500μL RIPA裂解液，快速刮下细胞，移至1.5mL
离心管。1 200r/min离心5min，收获蛋白，测定蛋白浓度。用
8%-12％分离胶和5％的浓缩胶SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋
白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭1h，一抗室温孵
育2-3h，二抗室温孵育1h。室温下，ECL混合液滴加在PVDF膜
上，避光反应3-5min，放入蛋白印记检测系统的暗箱内在暗室
中，曝光、显影、定影。将不同时间所拍图片，以β-actin作为内
参进行蛋白灰度分析。
5. 统计学方法 所有数据输入计算机，用SPSS 13.0统计
软件分析处理。统计描述：计量资料数据用x-±s表示。多组间
比较采F检验，以P<0.05为差异有统计意义。
结果
1. 光镜观察南方红豆杉水提物和紫杉醇处理后A549细胞
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组别
空白对照组
6μg/mL紫杉醇组
8μg/mL紫杉醇组
10μg/mL紫杉醇组
600μg/mL南方红豆杉组
800μg/mL南方红豆杉组
1 000μg/mL南方红豆杉组
LL
（正常活细胞）
3.20±2.07
24.37±11.72*
41.07±13.70**
65.03±10.65**
6.17±1.25
9.63±11.36**
10.17±1.63**
LF
（早期凋亡）
9.03±0.59
7.80±2.61
7.90±1.15
13.77±7.42
17.40±6.06*
36.43±1.04**
63.07±3.93**
UF
（坏死+晚期凋亡）
3.20±2.07
24.37±11.72*
41.07±13.70**
65.03±10.65**
6.17±1.25
9.63±11.36
10.17±1.63
表1 南方红豆杉水提物和紫杉醇对A549细胞凋亡的影响
（x- ±s，n=3，%）
注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。下表同。

P-JNK 46/54kD
P38 43kD
β-actin 42kD
1 2 3 4
图3 Western blotting检测南方红豆杉水提物处理A549细胞后
P38、P-JNk的蛋白印迹分析
注：1. 空白对照组；2. 600μg/mL南方红豆杉组；3. 800μg/mL
南方红豆杉组；4. 1 000μg/mL南方红豆杉组。
组别
空白组
600μg/mL南方红豆杉组
800μg/mL南方红豆杉组
1 000μg/mL南方红豆杉组
灰度值（P-jnk/β-actin）
1.274±0.081
1.116±0.049**
0.844±0.016**
0.769±0.044**
表2 南方红豆杉水提物处理A549细胞后P-JNK的蛋白印迹灰
度值分析（x-±s，n=3）
图2 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪分析南方红豆杉水提
物和紫杉醇处理A549细胞凋亡

c a b
d e f
g
A B C
D E F
G
形态变化对比 南方红豆杉水提物（600、800、1 000μg/mL）
和紫杉醇（6、8、10μg/mL）分别处理A549细胞24h后，由图1可
见：与正常细胞相比，随着南方红豆杉水提物剂量增加，A549
细胞增殖受抑制，形态发生明显变化，细胞核固缩，细胞膜出
芽，冒泡但完整性好；而随着紫杉醇剂量的增加，细胞肿胀，出
现无膜性小体，细胞完整性破坏，成片细胞死亡。
2. 南方红豆杉水提物和紫杉醇对人肺腺癌A549细胞凋亡
的影响 见表1、图2。实验结果显示：与空白对照组相比，经南
方红豆杉水提物处理24h后的细胞早期凋亡的比例均有明显升
高（P<0.05，P<0.01），且早期凋亡的比例呈现一定的剂量－效
应关系；而经紫杉醇处理24h后的细胞坏死和晚期凋亡的比例
均有明显升高（P<0.05，P<0.01），且坏死和晚期凋亡的比例呈
现一定的剂量-效应关系。
3. 南方红豆杉水提物对人肺腺癌A549细胞凋亡相关蛋白
的影响 结果见表2、图3。与空白对照组相比，随着南方红豆
杉水提物剂量增加，P38蛋白无明显变化，P-jnk蛋白逐渐减少
（P<0.01）。提示：南方红豆杉水提物通过抑制JNK通路激活诱
导肿瘤细胞凋亡。
讨论
目前，肺癌病因及发病机制尚未完全阐明，但从肿瘤细胞
学来看，肺癌发生的本质在于细胞增殖与凋亡的调节失控。近
年来中药的抗癌机制研究取得了很大进展，尤其是在肺癌细胞
增殖周期的调控与诱导细胞凋亡两方面[4]。
自从1971年美国化学家Wani M C等[5]首次在短叶红豆杉
（Taxus brevifolia）中分离出具有独特结构的二萜类成分——
紫杉醇（taxol）以来，紫杉醇以其独特的抗癌活性引发红豆杉
属植物的研究热潮。南方红豆杉虽然目前研究已经很多，但主
要是对其栽培工艺或其醇提物紫杉醇的研究。南方红豆杉以传
统中药饮片方式临床应用已多年，安全有效。
现代中药药理证实，红豆杉中有40多种有效成分，其中主
要有：紫杉醇、红豆杉多糖、巴卡亭Ⅲ、生物碱、紫杉黄酮、萜
类、小分子类物质（鞣质）等。而临床应用的化疗药物紫杉醇为
红豆杉的有效成分之一，且树皮中紫衫醇的含量仅为0.01%，
提取分离难度颇大。此外水环境中的紫杉醇在低温和中性偏
酸条件相对稳定，温度提高和强碱性下强烈促进紫杉醇的降
解。文献表明，温度60℃以上，即使pH中性的水中紫杉醇也会
迅速降解[6]。
本实验以南方红豆杉水提物为研究对象，以紫杉醇为对
照。结果表明，两组处理A549细胞24h后，均对细胞增殖有明显
的抑制作用，并随着药物浓度的增加而增强，呈明显的剂量－
效应关系。细胞形态学观察研究表明，南方红豆杉水提物处
理后细胞以凋亡为主，而紫杉醇组则以细胞坏死为主。采用流
式细胞仪进一步检测细胞凋亡，结果表明：南方红豆杉组的细
胞早期凋亡比例明显升高（P<0.05，P<0.01），且呈现一定的剂
量－效应关系；紫杉醇组的细胞早期凋亡比例未见明显升高，
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而坏死和晚期凋亡的比例均有明显升高（P<0.05，P<0.01），且
亦呈现一定的剂量-效应关系。
南方红豆杉水提物抑制肿瘤细胞的主要机制是诱导凋亡，
而紫杉醇抑制肿瘤细胞的机制主要为细胞毒作用，二者完全不
同。多项研究[7-8]证实紫杉醇的抗肿瘤机制是通过结合在微管
特定位点上，促进并稳定微管蛋白的聚合，防止解聚，导致染
色体断裂并抑制细胞复制和移行，从而阻滞肿瘤细胞在G2期和
M期，或通过激活宿主细胞的免疫系统，杀灭癌细胞。而本研
究实验结果表明：南方红豆杉水提物抗肿瘤效应主要作用在
G0/G1期，以早期凋亡为主。
丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，
MAPK）信号系统是一组非常保守的丝氨酸（苏氨酸）双重磷
酸化蛋白激酶系统。MAPK家族包括：P38 mAPK、细胞外信号
调节蛋白激酶（ERK）、c-jun N末端激酶（JNK）、ERK3、大丝
裂原活化蛋白激酶21（ERK5/BMK1）、ERK27、NLK和ERK8等
8个亚家族[9]。MAPK通路主要由ERK、JNK和P38亚族分别接
受不同类型的细胞外信号，发挥不同的生物学作用，其中P38、
JNK信号传导通路与细胞凋亡密切相关。JNK通过调节转录因
子AP21、ATF22、ELK21等的活性，对细胞的形态发生、细胞分
化和凋亡的调节等方面均发挥着重要作用[10-11]。
本实验通过Western blotting检测发现与空白对照组相比，
随着南方红豆杉水提物剂量增加，P38蛋白无明显变化，而
P-JNK蛋白逐渐减少（P<0.01），提示南方红豆杉水提物通过抑
制JNK通路激活诱导A549细胞发生凋亡。
综合中药水提物制备的特殊条件及本实验研究结果，可以
得出以下结论：南方红豆杉水提物对肺癌A549细胞的作用机制
主要是诱导其早期凋亡，其可能机制为通过降低P-JNK蛋白表达
诱导细胞凋亡。
参 考 文 献
[1] 中国科学院植物研究所.中国植物志.北京:科学出版社,
2005:437-447
Institute of Botany, the Chinese Academy of Sciences.Flora of
China.Beijing: Science Press,2005:437-447
[2] Dao M N,Aaron G C,R ishindra R,et al.Potentiation of paclitaxel
cytotoxicity in lung and esophageal cancer cells by pharmacologic
inhibition of the phospho inositide 3-kinase /prote in kinase B
(Akt) mediated signaling pathway.The Journal of Thoracic and
Cardiovascular Surgery, 2004,2(127): 365-375
[3] Luisa P M,Francesca G,FabriziaM,et al.Evidence that low doses
of taxol enhance the functional transactivatory properties of p53
on p21 wafpromoter in MCF 7 breast cancer cells.Federation of
European Biochemical Societies,2006,580(9):2371-2380
[4] 柴可群,赵同伟,卢丽琴,等.中药抑肺饮对肺腺癌细胞A549
裸鼠移植瘤的抑瘤作用及相关机制研究.中华中医药杂志,
2010,25(3):442-446
CHAI Ke-qun,ZHAO Tong-wei,LU Li-qin,et al.Investigation
of depressant effect of Yifei Yin on transplantation tumor of
human lung adenocarcinoma A549 cells in nude mice and
its related mechanism.China Journal of TCM and Pharmacy,
2010,25(3):442-446
[5] Wani M C,Tayl or H L,Wall M E,et al.Plant antitumor agent Ⅵ:
The is olati on and structure of taxol,a novel antileukemic and
antitumor agent from Taxus brevifolia.Journal of the American
Chemical Society,1971,93:2325-2327
[6] 于湘莉,苗志奇,李美芽.紫杉醇在水环境中的降解动力学研
究.上海交通大学学报(农业科学版),2009,27(5):520-523
YU Xiang-li,MIAO Zhi-qi,LI Mei-ya.Study on the stability of taxol
in water.Journal of Shanghai Jiaotong University(Agricultural
Science),2009,27(5):520-523
[7] 储天晴,韩宝惠.肺癌紫杉醇耐药与微管蛋白.中国肺癌杂志
2008,4(2):273-275
CHU Tian-qing,HAN Bao-hui.Taxol-resistant non-small
cell lung cancer and microtubulin.Chinese Journal of Lung
Cancer,2008,4(2):273-275
[8] 唐朝晖,钟德玝.紫杉醇抗肿瘤的分子机制.中国临床康复
2006,10(27):125-127
TANG Zhao-hui,ZHONG De-wu.Antitumor mechanism of taxinol.
Chinese Journal of Clinical Rehabilitation,2006,10(27):125-127
[9] Fecher LA,Amar avadi R K,Flaherty K T.The MAPKpathway in
melanoma. CurrOp in Oncol,2008,20(2):183-189
[10] Chen Y R,Tan T H.The c-jun N-Terminal kinase pathway and
apoptotic signaling. In t J Oncol,2000,16(4):651-662
[11] Comalada M,Xau s J,Valledor A F,et al.PKC epsilon is involved
in JNK activation that mediat es LPS-induced TNF-alpha,which
induces apoptosis in macrophages.Am J Ph ysiol Cell Physiol,
2003,285(5):C1235-1245
（收稿日期：2011年11月27日）