全 文 ：菌 物 学 报 24（3）：457~461, 2005
Mycosystema
南方红豆杉内生真菌产油及降解纤维素的研究
彭小伟 陈洪章*
（中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室 北京 100080）
摘 要：从油脂植物南方红豆杉 Taxus mairei茎中分离到 26株内生真菌，用形态学方法鉴定表
明，交链孢霉属 Alternaria、无孢菌群Mycelia Sterilia 和硬内囊霉属 Sclerocystis为优势类群；
用苏丹黑染液对这 26株内生真菌菌丝染色后，在光学显微镜下观察，发现其中 14株内生真菌
菌丝中有明显的油滴存在，选出其中油滴较大较多的 7株在 PDA液体培养基中培养 6d后提取
油脂，结果它们的油脂含量为细胞干重的 13.2％~29.5％；这 26株内生真菌在以微晶纤维为唯
一碳源的液体培养基中培养 8d 后，测定发酵液的滤纸酶活，发现酶活为 6.5~17.8µg 葡萄糖
/mL·min。 研究结果表明南方红豆杉内生真菌中存在大量产油菌株，且它们有以纤维素为碳
源生长的潜力。本研究为筛选能以秸秆中纤维素为碳源积累油脂的菌株打下基础。
关键词：油脂，纤维素酶活，生物柴油，秸秆
中图分类号：Q939.97 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2005）03-0457-0461

植物内生真菌是指生活在植物体内或生活史的一定阶段处于植物体内的真菌，它的涵
盖面相当广，包括菌根真菌和植物病原菌 (Lu et al., 2000；Service, 2000)。也有人认为内
生真菌是指存在于健康植物的茎叶中，不形成明显病症的真菌(Lu et al., 2000；Service,
2000)。大量研究表明，植物内生真菌能产生与其宿主相同的代谢产物，其机理有人提出假
说：具有相同次生代谢产物的生物合成途径有可能是由于相关基因的直接传递，这种传递
可发生在寄生生物与寄主或共生生物与寄主之间的相互作用过程中；或者更直接地在共同
生活的环境中，经长期相处直接接触而传递遗传物质(谷苏等，2000)。基于此，我们有了
从油脂植物内生真菌中筛选产油菌株的思路。
本文以油脂植物南方红豆杉 Taxus mairei为研究对象，分离其内生真菌，用形态学方
法初步鉴定到属，并进行产油菌株的筛选。另外，内生真菌长期生活在植物体内，与木质
纤维紧密接触，在缺乏葡萄糖等可溶性糖条件下，它们是否能利用纤维素作为碳源生长，
本文进行了一些探索。

基金项目：国家重点基础研究计划（973计划）（项目编号：2004CB719700）、国家“863”计划(课题号:2001AA514023)
和中国科学院知识创新工程重要方向项目（项目编号：kjcx2-sw-206）
*通信作者：e-mail: hzchen@home.ipe.ac.cn
收原稿日期：2005-01-24，收修改稿日期：2005-04-15
DOI:10.13346/j.mycosystema.2005.03.023
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1 材料与方法
1.1 植物样品来源
南方红豆杉样品采自云南大学校园，树龄 8~10年。
1.2内生真菌的分离
内生真菌的分离参见文献（彭小伟等，2003）。
1.3 内生真菌的分类鉴定
内生真菌的分类鉴定参见文献（魏景超，1979；Barnett & Hunter，1987）。
1.4 产油脂菌株的初步筛选
苏丹黑染液配制（诸葛健和王正祥，1994）：苏丹黑 B（Sudan black B）0.3 克溶于
100毫升 70％乙醇液，混合后用力振荡，放置过夜备用。真菌油脂含量的初步检测（刘吉
华等，1998）：取振荡培养的菌丝少许，置 10m1 的小烧杯中，吸干液体培养基，加入苏
丹黑染液 1~2mL 于室温染色 5min，取出菌丝于水中洗涤 5min，挑取菌丝制作临时装片,
镜检观察菌丝内脂肪滴的数量和大小。
1.5 油脂含量测定
菌种在 PDA培养基试管斜面上，27℃培养 4d后转接到 PDA液体培养基，再经 6d振
荡培养，收集菌体用水充分洗涤后，80℃烘干，称重。干菌体用氯仿－甲醇（v/v=2/1）混
合溶剂在索氏抽提器中 80℃回流 6h,用旋转蒸发仪减压去除溶剂得粗油脂，再用石油醚充
分溶解粗油脂后，过滤去除杂质，减压蒸馏去除石油醚即得油脂，称重。油脂重量与干菌
体的重量之比即为油脂含量。
1.6 内生真菌在以微晶纤维为碳源的培养基中生长情况
培养基：微晶纤维 20g，硝酸钠 3g，七水硫酸镁 0.5g，氯化钾 0.5g，七水硫酸亚铁
0.01g，三水磷酸氢二钾 1g，(琼脂 15g), 蒸馏水 1000mL，pH自然。
用点植法将内生真菌接入上述固体培养基平板上培养，观察它们的生长情况，测定菌
落直径。
将内生真菌接入上述液体培养基振荡培养，观察它们的生长情况，并测定发酵液的滤
纸酶活。
1.7 滤纸酶活测定
1.7.1 内生真菌发酵液的制备：内生真菌菌种转接到上述液体培养基中振荡培养 8d, 取发
酵液 4000r/min离心 10min,上清液用于滤纸酶活测定。
1.7.2 滤纸酶活测定：参照文献（诸葛健和王正祥，1994），取 0.5mL待测液加 2mL 0.1mol/L,
pH4.8的醋酸缓冲液，预热到 50℃，加入 1条 1×6cm新华滤纸(50±1mg)，50℃保温 1h．取
出，加入 DNS显色试剂沸水浴 5min，冷却至室温，用紫外分光光度计测 OD值，再计算
出各菌株的酶活力。
2 结果与讨论
2.1 内生真菌的种群组成
经形态学方法鉴定，26株内生真菌的种群组成为：交链孢属 Alternaria Nees ex Warllr.
3期 彭小伟等：南方红豆杉内生真菌产油及降解纤维素的研究 459
9株，无孢菌群Mycelia Sterilia 8株，硬内囊霉属 Sclerocystis Berk. et Broome. 5株，曲霉
属 Aspergillus Link 2株，拟茎点霉属 Phomopsis Sacc. 2株。可以看出，交链孢属、无孢菌
群、硬内囊霉属为南方红豆杉的优势类群。鉴定结果见表 1。
2.2 产油菌株的初步筛选及部分菌株的油脂含量
用苏丹黑染液对这 26株内生真菌菌丝染色，发现其中 14株内生真菌菌丝中有明显的
油滴存在，它们分别为：硬内囊霉属 Sclerocystis 5株，拟茎点霉属 Phomopsis 2株，交链
孢属 Alternaria 3株，无孢菌群Mycelia Sterilia 4株，经初步判断选出其中油滴较大较多的
7 株，在 PDA 液体培养基中培养 6d 后提取油脂，结果它们的油脂含量为细胞干重的
13.2%~29.5%。产油的属及部分菌株的油脂含量见表 1。从表 1 可以看出，除曲霉属
Aspergillus 外其余各属都有能在细胞内积累油脂的菌株，其中硬内囊霉属 Sclerocystis 所
有菌株都能积累油脂且油脂含量较高，有的高达 29.5%。
2.3 菌株在以微晶纤维为碳源的培养基中生长情况及滤纸酶活
在以微晶纤维为碳源的固体培养基平板培养时，菌株都能生长，但生长缓慢，菌落较
薄，菌丝稀疏，培养 4d 时菌落直径为 0.8~4cm 之间，这说明它们有利用纤维素为碳源的
能力。在液体培养基中振荡培养时，在摇瓶内壁与液面接触的部位有膏状物沉积，表明微
晶纤维已部分降解，培养 8d 后，测定其发酵液滤纸酶活，滤纸酶活为 6.5~17.8µg 葡萄糖
/ml·min，结果见表 1。
微生物资源的开发利用已产生了重大的社会和经济效益，但对微生物资源的认识远远
不及对动植物资源那样普及,不断地开发微生物资源为生产和生活服务是人类长期的任务。
目前，植物内生真菌代谢产物的研究主要集中在寻找新的药物资源上（邹文欣和谭仁祥，
2001），从内生真菌中寻找产油菌株的研究未见报道，本文首次从微生物油脂角度研究内
生真菌，研究结果表明，油脂植物南方红豆杉内生真菌中存在大量产油菌株，从油脂植物
内生真菌中寻找产油菌株是一条可行的途径。
内生真菌生长在植物内部，其侵染植物的过程本身就是水解木质素、纤维素的过程，
内生真菌能够顺利地在宿主内生长，其利用木质素、纤维素的能力非常重要（Osono &
Takeda,1999）,因此内生菌提供了一个筛选降解秸秆菌种的范围，已报道内生真菌有降解
木质素（Osono & Takeda,1999）和木聚糖（Suto et al.,2002）能力，也有用内生真菌强化
还田秸秆的研究报道（史 央等，2004），而本研究结果表明，植物内生真菌有降解纤维
素的能力。
近年来，石油资源的日益枯竭和人们环保意识的提高，大大促进了世界各国加快石油
替代燃料的开发步伐，其中生物柴油以其优越的环保性能受到了各国的重视。生产的生物
柴油主要成分是高级脂肪酸甲（乙）酯，目前生物柴油主要是用化学法将动物和植物油脂
和甲醇或乙醇等低碳醇在酸或者碱性催化剂和高温下进行转酯化反应生产。就我国而言,
人均耕地少，不可能大面积种植油料作物来生产生物柴油，动物油脂产量更加有限，从长
远来看，油脂来源不足是制约我国生物柴油生产的瓶颈问题，然而我国是个农业大国，秸
秆资源十分丰富且长期以来得不到充分利用，因此，利用微生物转化秸秆生产油脂是解决
这一瓶颈问题的最好办法。当然，要实现秸秆与微生物油脂之间的转化，就必须找到能以
秸秆有机成分（纤维素、木质素和半纤维素）为碳源大量积累油脂的菌株，本实验结果为
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我们寻找该菌株奠定了基础，我们将对其他油脂植物内生真菌中进行更广泛的筛选，并进
行更加深入的研究。
表 1 26株内生真菌产油情况及滤纸酶活
Table1 The lipid content and FPA of the endophytic fungi
菌号
Strains
种
Species
油脂含量 (油脂重量/菌丝干重)
Lipid content （ weight of
lipid/weitht of dry mycelia）
滤纸酶活(µg葡萄糖/ml·min)
FPA (µg glucose/ml·min)
1 Alternaria sp. 7.4
4 Alternaria sp. ＋ 13.8
9 Alternaria sp. 7.4
10 Alternaria sp. ＋ 16.8
15 Alternaria sp. 9.3
17 Alternernia sp. 13.2％ 11.6
18 Alternaria sp. 17.3
19 Alternaria sp. ＋ 9.8
24 Alternaria sp. ＋ 12.5
2 Sclerocystis sp. 21.4％ 12.7
6 Sclerocystis sp. ＋ 12.5
8 Sclerocystis sp. 29.5％ 14.5
16 Sclerocystis sp. 28.1％ 6.5
23 Sclerocystis sp. 24％ 14.4
3 Aspergillus sp. 9.4
25 Spergillus sp. 7.4
7 Phomopsis sp. 15.3％ 16.1
14 Phomopsis sp. 16.7％ 16.6
5 Mycelia Sterilia 10.9
11 Mycelia Sterilia 17.8
12 Mycelia Sterilia 6.7
13 Mycelia Sterilia 7.8
20 Mycelia Sterilia ＋ 7.3
21 Mycelia Sterilia ＋ 12.3
22 Mycelia Sterilia ＋ 7.8
26 Mycelia Sterilia ＋ 14.2
＋表示菌丝内有油滴存在 （+ Lipid bodies present in the hyphae）
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LIPID ACCUMULATION AND CELLULOSE DECOMPOSITION OF
ENDOPHYTIC FUNGI ISOLATED FROM TAXUS MAIREI
PENG Xiao-Wei CHEN Hong-Zhang
(State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080)
ABSTRACT:Twenty-six isolates of endophytic fungi were obtained from the stems of Taxus mairei. It is shown
that species of Alternaria,Mycelia Sterilia and Sclerocystis were dominant. The hyphae of these endophytic fungi
was stained with Sudan black B and the lipid bodies could be clearly seen in the cells of fourteen isolates. Seven
isolates which had bigger and more lipid bodies in their hyphae were cultured in liquid PDA medium and their
lipid were extracted. As a result, the lipid contents were 13.2%~29.5% of dry cell weights. All these isolates
were cultured for 8d in the liquid medium with microcrystalline cellulose as exclusive carbon source.The
fermented broths’ FPA were measured as 6.5~17.8µg glucose/ml·min. These research results showed that most
of the endophytic fungi isolated from Taxus mairei could accumulate lipid and they had potential ability of
assimilating cellulose.This research is the foundation for finding those strains which can accumulate lipid and
simultaneously assimilate the cellulose in straw.
KEY WORDS: Lipid body, cellulase activity, biodiesel, straw