全 文 ：收稿日期:2009-10-23;　修订日期:2010-03-28
基金项目:国家科技部 “十一五 ”支撑项目(No.2007BAI48B04-3)
作者简介:薄彧坤(1982-),女(汉族),内蒙古包头人, 现任包头医学院助
教 ,硕士学位 ,主要从事药物分析方面的工作.
＊通讯作者简介:王玉华(1959-),女(蒙古族),内蒙古赤峰人,现任内蒙古
医学院教授 ,硕士生导师 ,博士学位 ,主要从事中蒙药活性成分的提取分离
和质量控制研究工作.
瑞香狼毒药材中蛋白质部位的体外活性研究
薄彧坤 1 ,周　燕 1 ,王　伟2 ,王玉华 1＊
(1.内蒙古医学院·药学院 ,内蒙古 呼和浩特　010110;　
2.内蒙古食品药品检验所 ,内蒙古 呼和浩特　010020)
摘要:目的 建立瑞香狼毒药材蛋白质部位体外活性研究的方法。方法 琼脂糖扩散法测定总蛋白的抑菌活性;MTT细
胞培养法测定总蛋白及分离得到的 6个分子量蛋白对肝癌细胞生长的抑制作用及对正常细胞的毒性作用。结果 体外
活性研究结果表明 , 总蛋白没有抑菌活性但具有抗肿瘤活性和细胞毒性;分离得到的 6个分子量的蛋白中 2、3、4、6对肿
瘤细胞有抑制作用 , 1、3、4对正常细胞有毒性作用。结论 实验方法可作为瑞香狼毒药材中蛋白质生物活性研究的方法 ,
为瑞香狼毒蛋白质部位的毒性蛋白及活性蛋白的研究提供了方法依据。
关键词:瑞香狼毒;　蛋白质;　体外活性
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.09.064
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)09-2262-02
StudyoninvitroActivityofProteinSitefromStellerachamaejasmeL.
BOYu-kun1 , ZHOUYan1 , WANGWei2 ,WANGYu-hua1＊
(1.InnerMongolianMedicalColege, InnerMongolia, Hohhot010110, China;2.InnerMongolianInstitutefor
FoodandDrugControl, Hohhot, InnerMongolia010030, China)
Abstract:ObjectiveTosetupthemethodofdetectinginvitroactivityofproteinsitefrom StelerachamaejasmeL.
MethodsThemethodofagardiffusionwasusedantibacterialactivityoftotalprotein;MTTcellculturaltechniquewasadoptedto
measurethecelactivityoftotalproteinandthesixmolecularweightproteinsisolatedfromtotalprotein.ResultsThestudyofin
vitroactivityindicatedthatthetotalproteinwaslackofantibacterialactivitybuthadthefunctionofanti-tumorandtheactivityof
toxicity;theproteinsof2, 3, 4, 6hadthefunctionofanti-tumorandthe1, 3, 4 havethetoxicefecttonormalcels.Conclusion
Inthispaper, themethodcanbeusedtostudythebiologicalammityoftheproteinofStelerachamaejasmeL.
Keywords:StelerachamaejasmeL.;　Protein;　Invitroactivity
　　瑞香狼毒为瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒 Stellerachamaejasme
L.的干燥根 ,又名断肠草 、红狼毒 、火柴头花等 [ 1] , 它广泛分布在
我国西北 、西南 、东北及河北等地。瑞香狼毒始载于《神农本草
经》 ,历代本草均有记载;其味苦 、辛 , 性平 、有毒 , 入肺 、脾 、肝经 ,
功能与主治为逐水祛痰 、破积杀虫。瑞香狼毒是蒙医药常用的药
材 , 作为主成分制成的蒙成药多用于治疗乳腺炎和腮腺炎。瑞香
狼毒毒性大 , 经炮制后才入药。误食或过量 ,会刺激口腔 、咽喉 ,
并可见恶心 、呕吐 、腹痛 、腹泻 、头晕头痛 、疲乏无力 , 严重者会出
现狂躁和痉挛 [ 2] 。瑞香狼毒主要化学成分有香豆素 、黄酮 、二萜
原酸酯 、木脂素类化合物 、多糖等 [ 3] 。近年来的研究显示 [ 4 , 5] ,瑞
香狼毒具有抗肿瘤 、抗病毒 、抗 HIV病毒 、抑菌 、抗癫痫 、抗惊厥
等作用;瑞香狼毒作为生物杀虫剂使用 , 原理是利用其药材的毒
性作用。瑞香狼毒药材中毒性成分以及活性成分的研究对确定
瑞香狼毒的炮制方法 ,从而确保安全 、合理的使用瑞香狼毒药材
具有重要意义。本文就蛋白质部分的体外活性进行了研究。
1　材料与仪器
1.1 　材料 瑞香狼毒药材(经内蒙古食品药品检验所康双龙主
任药师鉴定);细胞株(体外培养人肝癌细胞株 HepG-2, 狗肾细
胞株);MTT(德国 simga公司);RPMl-l640(美国 GIBCO公司 ,
批号:60P8244);胎牛血清(FBSMdgenicsInc., 批号:CCS0011 -
100);青霉素 、链霉素(华北制药股份公司);胰蛋白酶(上海化学
试剂厂 ,批号:82-04-12);MEM(美国);二甲基亚砜(DMSO天
津汇英化学试剂有限公司);碳酸氢钠(开原化学试剂厂)。
1.2 　仪器 ThennoFomra型 CO2培养箱(池本梨花工业株式会
社);Clympus型倒置显微镜(日本);DG3022A型酶标仪(国营华
东电子管厂);FA1104型电子天平(上海精科天平);培养瓶(日
本);3072型 96孔板(丹麦);3001型培养皿(美国);JJT-2型超
净工作台(北京半导体设备一厂);YXQG02型电热式蒸气消毒器
(山东新华医疗器械股份有限公司)。
2　方法与结果
2.1 　蛋白质的提取分离 本实验通过水提 、盐沉 、透析的提取过
程 , SephadexG-150、SephadexG-100、SephadexG-50凝胶柱多
次分离过程 , SDS-聚丙烯酰胺蛋白质电泳鉴别过程 , 共得到 6
个分子量的蛋白质 。它们的分子量分别为:14.4, 35.0, 28.0,
23.0, 10.0, 94.0 kDa。为了进一步确定瑞香狼毒的活性部位 , 本
实验对瑞香狼毒中的总蛋白及其分离得到的不同分子量的蛋白
进行了体外活性研究。
2.2　瑞香狼毒总蛋白的体外活性研究
2.2.1　总蛋白的毒性实验 [ 6] 取对数生长期狗肾细胞 , 用胰蛋白
酶消化后充分吹打成单细胞悬液 , 计数后稀释成 1 ×104 cll/ml
(MEM培养基培养),接种于 96孔培养板中 , 100 μl/孔。然后在
实验孔中加入 100 μl样品的培养基 , 每一浓度级别平行 3孔。
对照组加入等体积溶剂。将 96孔培养板置于 37℃、5%CO
2
饱和
湿度培养箱中培养 72 h后 , 弃去培养液 , 每孔加入新鲜配置的含
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0.20 mg· ml-1MTT的无血清培养基 20 μl, 37℃下继续培养 4 h
后 , 除去上清液。每孔加入 150 μlDMSO溶解 formazan沉淀 ,置
微量震荡器上振荡 5 min使其充分溶解。在 DG3022A型酶标仪
上测定 490 nm处的 A(吸收度)值。结果见表 1。
总蛋白的毒性研究和对肝癌细胞的研究使用的样品均为:将
总蛋白分别制成浓度为 0.49, 1.02, 2.09, 4.11, 6.06, 8.07 mg/ml
的溶液 , 并分别编号为 1, 2, 3, 4, 5, 6。
从表 1可以看出 , 当蛋白溶液浓度增至 4.11 mg· ml-1时 , A
值低于空白溶液的 A值 ,出现细胞毒性作用 , 随着浓度的增大 ,对
细胞生长的抑制率增大 ,毒性作用不断加强。
表 1　瑞香狼毒中总蛋白质对正常细胞的毒性研究结果
样品编号 浓度C/mg· ml-1
平均
A值
抑制率
(%)
对照 ─ 0.20 ─
1 0.49 0.62 -210
2 1.02 0.46 -130
3 2.09 0.31 -55
4 4.11 0.17 15
5 6.06 0.09 55
6 8.07 0.033 83.5
　　细胞生长抑制率(%)=(l-实验组平均 A值 /对照组平均 A值)×
100%
2.2.2　总蛋白对肿瘤细胞的活性实验 [ 6] 取对数生长期的肝癌
细胞 HepG-2,用胰蛋白酶消化后充分吹打成单细胞悬液 , 计数
后稀释成 1 ×104 /ml, 接种于 96孔培养板中 , 100 μl/孔。 加入
100μlRPMI-1640培养液 , 然后在实验孔中加入 100μl样品溶
液 , 每一浓度级别平行 3孔 。同时设立空白对照 , 并用抗癌药物
环磷酰胺(CPM)做阳性对照。将 96孔培养板置于 37℃, 5%CO2
饱和湿度培养箱中培养 96h后 , 弃去培养液 , 每孔加入新鲜配置
的含 0.20mg· ml-1MTT的无血清培养基 20 μl, 37℃下继续培养
4 h后 ,除去上清液。每孔加入 150μlDMSO溶解 formazan沉淀 ,
置微量震荡器上振荡 5 min使其充分溶解。在 DG3022A型酶标
仪上测定 490 nm处的 OD(吸收度)值。瑞香狼毒总蛋白对肝癌
细胞生长抑制结果见表 2。
表 2　瑞香狼毒中总蛋白质对肝癌细胞生长抑制率结果
总蛋白浓度
C/mg·ml-1
对照组 OD
平均值
实验组 OD
平均值
抑制率
(%)
0.49 0.47 0.93 -97.9
1.02 0.47 0.77 -63.8
2.09 0.47 0.46 2.13
4.11 0.47 0.25 46.8
6.06 0.47 0.13 72.3
8.07 0.47 0.04 91.5
　　细胞生长抑制率(%)=(l-实验组平均 OD值 /对照组平均 OD值)
×100%
从表 2可以看出 , 总蛋白溶液从浓度为 2.09 mg· ml-1开始
出现抑制肝癌细胞生长的现象 ,并随浓度增加抑制肝癌细胞生长
的强度越大。
2.2.3　总蛋白的抑菌实验 [ 7, 8]
菌株的培养:在无菌操作条件下 , 用接种环取金黄色葡萄球
菌菌株一环 , 用划线法接种在制作好的培养基中 , 然后用不同接
种环分别以同样方法对铜绿假单胞菌进行接种。 把各菌种置
37℃恒温培养箱中培养 24h,然后取出放入 4℃冰箱中保存备用。
供试品溶液的制备:精密称取瑞香狼毒总蛋白样品 85.2mg,
加入 4 ml蒸馏水溶解即得。
样品灭菌:将盛有总蛋白样品溶液的小瓶在水浴中煮沸 10
min。然后将样品溶液转移至灭菌的试管中 , 再煮沸 10min灭菌
即可。
将每个涂布菌液的培养皿上 , 均匀的放置 6个钢管 , 每个钢
管中滴加一个样品。在滴加过样品的培养皿上盖上陶瓦盖将其
密封 , 于 37℃恒温培养箱中培养 24h后取出观察样品的抑菌圈。
实验结果显示 , 瑞香狼毒总蛋白溶液对金黄色葡萄球菌和铜绿假
单胞菌均没有抑菌圈出现 ,说明瑞香狼毒中蛋白质部位对这两种
菌的生长没有抑制作用。
2.3 　瑞香狼毒分离得到的各分子量蛋白的细胞实验 从总蛋白
的体外活性研究实验结果可以看出 ,瑞香狼毒中的蛋白质对细菌
生长没有抑制作用 , 但对肿瘤细胞和正常细胞有抑制和毒性作
用。为了进一步确定它的抗肿瘤活性和毒性作用 ,本实验对从总
蛋白分离得到的 6个分子量的蛋白质分别进行了细胞活性研究。
2.3.1　供试品溶液的配制 精密称取蛋白质 1 ～ 6的粉末 , 用一
级纯化水制成约 10 mg· ml-1的溶液 , 在无菌操作下用 0.45μm
高压灭菌后的滤膜过滤即得。
2.3.2　抗肿瘤活性的实验 按 “ 2.2.2”项下方法测定各分子量
蛋白对肝癌细胞的作用。结果见表 3。
表 3　瑞香狼毒中 6个不同分子量蛋白质对肝癌细胞生长作用结果
分子量
/kDa
对照组OD
平均值
实验组 OD
平均值
抑制率
(%)
14.4 0.38 0.50 -31.6
35.0 0.38 0.16 57.9
28.0 0.38 0.16 57.9
23.0 0.38 0.05 86.8
10.0 0.38 1.07 -181.6
94.0 0.38 0.12 68.4
　　细胞生长抑制率(%)=(l-实验组平均 OD值 /对照组平均 OD值)
×100%
表 3结果显示 , 有 4个分子量的蛋白对肝癌细胞的生长有抑
制作用 。它们分别是:分子量为 35.0 kDa, 肝癌细胞抑制率
57.9%;分子量约 28.0 kDa, 肝癌细胞抑制率 57.9%;分子量约
23.0kDa, 肝癌细胞抑制率 86.8%;分子量 94.0 kDa, 肝癌细胞抑
制率 68.4%。
2.3.3　对正常细胞的毒性实验 按 “ 2.2.1”项下方法测定瑞香
狼毒中 6个不同分子量蛋白对正常细胞毒性作用。结果见表 4。
表 4　瑞香狼毒中 6个不同分子量蛋白质对正常细胞作用结果
分子量
/KDa
对照组OD
平均值
实验组 OD
平均值
抑制率
(%)
14.4 0.08 0.07 12.5
35.0 0.08 0.36 -350
28.0 0.08 0.06 25.0
23.0 0.08 0.04 50.0
10.0 0.08 0.69 -763
94.0 0.08 0.62 -765
　　细胞生长抑制率(%)=(l-实验组平均 OD值 /对照组平均 OD值)
×100%
细胞毒性实验中 , 若蛋白质样品的 OD值小于空白溶液的
OD值 ,则说明该分子量的蛋白质对细胞有毒性作用。表 4显示 ,
OD值小于空白溶液 OD值(0.08)的蛋白质有 3个 , 说明这 3个
蛋白质对细胞有毒性作用。它们的分子量分别是:14.4 kDa;约
28.0 kDa;约 23.0 kDa。
瑞香狼毒总蛋白质的抑菌实验和细胞活性研究结果表明 , 瑞
香狼毒药材中蛋白质部位对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌没
有抑菌作用 , 但有对肿瘤细胞生长的抑制作用和对正常细胞的毒
性作用 。
各分子量蛋白的体外活性的研究表明 ,分子量约为 28.0kDa
和 23.0kDa的两个蛋白同时具有对肿瘤细胞生长的抑制作用和
对正常细胞的毒性作用;分子量为 35.0 kDa和 94.0 kDa的蛋白
只有对肿瘤细胞的抑制作用;分子量为 14.4 kDa的蛋白只有对
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正常细胞的毒性作用 。
3　讨论
瑞香狼毒药材作为常用的蒙药材 ,具有重要的药用价值。总
蛋白的抑菌结果显示 ,瑞香狼毒蛋白质溶液对这两种菌落的生长
均没有抑菌环出现 , 说明瑞香狼毒中的蛋白质部位对瑞香狼毒药
材的抑菌活性没有贡献 , 不能作为抑菌药物使用。在总蛋白质的
体外活性实验中 , 我们还就其对正常细胞的毒性作用和对肿瘤细
胞的抑制作用进行了研究。研究结果显示 ,瑞香狼毒中的蛋白质
部位对正常细胞有毒性作用 ,同时对肿瘤细胞的生长也有抑制作
用 , 作用强度随着浓度的增加而增强。
由于瑞香狼毒中总蛋白质部位有抗肿瘤活性和毒性作用 ,为
了确定它的这些功能是由哪些分子量的蛋白质引起的 ,我们对其
分离得到的 6个分子量的蛋白质进行了进一步的细胞活性研究。
研究表明 , 6个分子量的蛋白质中有 3个对正常细胞有毒性作
用 , 有 4个对肿瘤细胞有抑制作用。其中有抗肿瘤活性而没有毒
性的有两个 , 它们的分子量为 35.0 kDa和 94.0 kDa。
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收稿日期:2009-11-30;　修订日期:2010-03-16
基金项目:国家科技支撑计划(No.2008BAI68B02);
国家自然科学基金(No.30660060)
作者简介:曹　明(1985-),男(汉族),江西赣州人 ,在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事心脏电生理研究工作.
＊通讯作者简介:葛郁芝(1950-),男(汉族),江西高安人 ,现任江西省心血管病研究所教授 ,博士研究生导师 ,博士学位 ,主要从事心律失常与心内电
生理研究工作.
中药甘松挥发油对大鼠心室肌
细胞膜 L型钙通道的影响
曹　明 , 葛郁芝＊ , 罗　骏 , 王云霞 , 张淑华 , 吴志婷
(江西省人民医院·江西省心血管病研究所 ,江西 南昌　330006)
摘要:目的 研究甘松挥发油对大鼠心室肌细胞膜 L型钙通道的影响 , 探讨甘松挥发油在离子通道水平抗心律失常的作
用机制。方法 用急性酶解法分离大鼠心室肌细胞 , 采用全细胞膜片钳记录技术 ,观察不同浓度的甘松挥发油对 L型钙
通道的影响。结果 浓度为 3, 5, 10, 20, 50 μg/g甘松挥发油可浓度依赖性地抑制 L型钙电流 ,在浓度为 10μg/g时 ,给药
后电流密度抑制约为(45.7±3.5)%(n=5, P<0.01), 可使心肌细胞 L型钙电流 -电压曲线上移 , 但激活电位 、峰电位
及反转电位无改变;使激活曲线向正电位方向变化 , V1 /2从(-5.47±0.50)mV右移至(-2.77±0.49)mV(n=5, P<
0.05);使失活曲线向负电位方向变化 , V1/2从(-20.82±0.48)mV左移至(-29.44±1.03)mV(n=5, P<0.05)。结论
甘松挥发油可通过浓度依赖性地抑制大鼠心肌细胞膜 L型钙通道电流 , 使 I-V曲线上移;使激活曲线右移 , 使失活曲线
左移。
关键词:甘松;　膜片钳;　L型钙通道;　心室肌细胞
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.09.065
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)09-2264-03
EffectsoftheVolatileOilofNardostachyschinensisonL-TypeCalciumChannelinIso-
latedVentricularMyocytesinRats
CAOMing, GEYu-zhi＊ , LUOJun, WANGYun-xia, ZHANGShu-hua, WUZhi-ting
(DepartmentofCardiology, JiangxiProvincialPeople sHospital, Nanchang330006 China)
Abstract:ObjectiveToobservetheefectsofthevolatileoilofNardostachyschinensisonL-TypeCalciumchannelinisolated
ventricularmyocytesofrats.MethodsSingleventricularmyocytesofratwereobtainedbyenzymaticdissociationmethod.The
whole—cellpatchclamprecordingtechniquewasusedtorecordthechangeofL-TypeCalciumchannelcurrentbydiferentdos-
ageofthevolatileoilofNardostachyschinensisfrom3to50ppm.ResultsThevolatileoilofNardostachyschinensisdecreasedL-
typecalciumchannelcurrentinadose—dependentmanner.ThevolatileoilofNardostachyschinensis(10μg/g)decreasedthe
curentdensityby45.7% (n=5, P<0.01), thecurrent—voltagecurvewasmovedupandactivepotential, peakpotentialandre-
versepotentialhadnochange.Theactivationcurvewasmovedtomorepositivepotentialandtheinactivationcurvemovedtomore
negativepotential.ConclusionThevolatileoilofNardostachyschinensisdecreasestheL-TypeCalciumchannelcurrentina
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 9期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.9