全 文 ：收稿日期:2012-04-19; 修订日期:2012-06-25
基金项目:国家自然科学基金(No． 81072613)
作者简介:韩 霖(1988-) ，女(汉族) ，辽宁抚顺人，现为广西医科大学在
读硕士研究生，主要从事药物分析研究工作．
* 通讯作者简介:黄荣清(1965-) ，男(汉族) ，江西南昌人，现任军事医学
科学院教授，硕士学位，主要从事药物分析研究工作．
贯叶连翘提取物中金丝桃苷含量的
RP － HPLC法测定
韩 霖1，2，刘妍如2，3，杨建云2，肖炳坤2，黄荣清2*
(1．广西医科大学药学院，广西 南宁 530021;
2．军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850;
3．沈阳药科大学制药工程学院，辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的 建立测定贯叶连翘提取物中金丝桃苷含量的高效液相色谱法。方法 采用 Agilent ZORBAX SB － C18(250 mm
×4． 6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈 － 0． 1%磷酸溶液(15∶ 85)为流动相，流速 1． 2 ml /min，检测波长 256 nm;柱温为 35℃。
结果 金丝桃苷检测浓度在 11． 4 ～ 91． 2 μg /ml范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系(r = 0． 999 9) ;平均回收率为
100． 7%，RSD为 1． 37%。结论 该法快速、简便、准确，重复性好，可用于贯叶连翘提取物中金丝桃苷的含量测定。
关键词:贯叶连翘; 金丝桃苷; 反相高效液相色谱; 含量测定
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 10． 021
中图分类号:R284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)10-2432-02
Determination of Hyperin in Hypericum perforatum L． Extract by RP －HPLC
HAN Lin1，2，LIU Yan-ru2，3，YANG Jian-yun2，XIAO Bing-kun2，HUANG Rong-qing2*
(1． School of Pharmacological Sciences，Guangxi Medical University，Nanning530021，China;2． Institute of
Radiation Hedicine，Academy of Hilitary Hedical Sciences，Beijing 100850，China;3． School of Pharmaceuti-
cal Engineering，Shenyang Pharmacological University，Shenyang 110016，China)
Abstract:Objective To develop an RP － HPLC method for the determination of hyperin in Hypericum perforatum L． extracts．
Methods The RP － HPLC system consisting of Agilent ZORBAX SB － C18(250 mm × 4． 6 mm，5 μm)column was adopted and
the mobile phase was acetonitrile － 0． 1% phosophoric acid(15∶ 85)at the flow rate of 1． 2 ml /min;the detection wavelength
was 256 nm and the column temperature was 35℃ ． Results The linear range for hyperin was 11． 4 ～ 91． 2 μg /ml (r = 0． 999 9)．
The average recovery was 100． 7% (RSD = 1． 37%)． Conclusion This method is simple，rapid，accurate，and it can be used for
the quality control of the Hypericum perforatum L． extract．
Key words:Hypericum perforatun L; Hyperin; RP － HPLC; Assay
贯叶连翘为藤黄科植物贯叶金丝桃 Hypericum performatum
L．的干燥地上部分，性辛、寒，可疏肝解郁、清热利湿，临床用于治
疗肝气郁结，情志不畅，心胸郁闷，关节肿痛等症状［1］。近年来，
国内外对其研究不断增多，国外在治疗抑郁症方面已有历史［2］，
与此同时其抗病毒、抗癌［3，4］等方面的作用也不断被挖掘。文献
报道其主要成分包括黄酮类化合物(如芦丁、金丝桃苷等) ，苯并
二蒽酮类化合物(如金丝桃素、伪金丝桃素等) ，间苯三酚类化合
物(如贯叶金丝桃素、加贯叶金丝桃素)以及挥发油(如蒎烯、倍
半萜烯)等，根据现代植物化学和药理学研究以及《中国药典》
(2010 版)规定，贯叶金丝桃中的主要有效成分(质控指标)为金
丝桃苷。金丝桃苷具有凉血止血、活血祛瘀、清热解毒、镇痛解
痉，对脑缺血损伤的保护作用［5，6］，还对治疗肿瘤有防治作
用［7，8］。本文采用 RP － HPLC 等度洗脱方法测定金丝桃苷的含
量，相比其他梯度洗脱方法［9，10］和薄层 －紫外分光光度法［11］时
间长、回收率较低的不足，实现了省时、简便的特点，方法灵敏、精
密度高，易于推广。
本文参考《中国药典》(2010 版)收载方法，再进行实验摸索
后，检测器在 200 ～ 800 nm范围内扫描，发现在 256 nm处有最大
吸收，干扰少，对比药典所选 360 nm，我们选择 256 nm 作为检测
波长，如图 1。另外，本方法也将流速作了调整，设为 1． 2 ml /
min，对比《中国药典》中的 1． 0 ml /min，增大了柱效，峰形较好。
使用有机滤膜替代普通尼龙滤膜，吸附减少。《中国药典》所述
对于供试溶液的制备，采用的是 60%乙醇回流 1h 提取，操作繁
琐，重复性较低，本文中所用超声方法也可用来处理样品，在保证
了提取率的前提下，操作简便、省时，除了可以处理提取物，也可
应用于原药材的金丝桃苷的提取。
图 1 紫外检测图
1 仪器与试剂
1． 1 仪器 Waters Alliance 2695 /2996 高效液相色谱仪(美国) ;
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 10
SARTORIUS BP211D 型天平(德国) ;KQ － 100DE 型超声波清洗
器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)。
1． 2 试剂与试药 金丝桃苷对照品(批号 MUST － 10051101)购
自成都曼斯特生物科技有限公司;贯叶连翘提取物;乙腈、甲醇
(HPLC色谱纯，山东禹王实业有限公司) ，水为纯化水(娃哈哈有
限公司) ，磷酸(分析纯，T20100519，国药集团化学试剂) ;PTFE
滤膜(Polytetrafluoroethylene，聚四氟乙烯，上海兴亚净化材料厂)。
2 方法
2． 1 溶液的制备
2． 1． 1 对照品储备液 精密称取金丝桃苷对照品 5． 7 mg，置于
25 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释得到 228 μg /ml溶液。
2． 1． 2 供试品溶液 取贯叶连翘提取物粉末，研细，取约 2 g，置
10 ml棕色容量瓶中加甲醇适量，超声 30 min，加甲醇至刻度，振
摇 20 次，以 12 000 r /min 转速离心 10 min 后，取上清液用 PTFE
滤膜过滤，收集续滤液以备进样。
2． 2 色谱条件 色谱柱为 Agilent ZORBAX SB － C18(250 mm ×
4． 6 mm，5 μm) ;流动相乙腈 － 0． 1%磷酸溶液(15 ∶ 85) ，流速
1． 2 ml /min，检测波长 256 nm，柱温 35℃，进样量 20 μl。在该色
谱条件下，理论板数按金丝桃苷峰计算不低于 3 000，分离度大于
1． 5。色谱图见图 2。
a －空白溶液、b －对照品溶液、c －供试品溶液
图 2 HPLC色谱图
2． 3 方法学考察
2． 3． 1 线性范围 分别精密量取对照品储备液 0． 5，1，2，2． 5，3，4
ml置 10 ml 棕色容量瓶中，用甲醇定容，配成浓度分别为 11． 4，
22． 8，45． 6，57． 0，68． 4，91． 2 μg /ml的对照品溶液，按上述色谱条
件，进样 20 μl。以对照品的浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵
坐标绘制标准曲线得回归方程为 Y = 38 118X + 11 499，r =
0． 999 9，见图 3。结果表明，金丝桃苷对照品的检测浓度在 11． 4
～ 91． 2 μg /ml范围内，与峰面积积分值呈良好的线性关系。结
果见表 1。
表 1 线性范围实验结果
浓度 C /μg·ml －1 峰面积
11． 4 436 177
22． 8 872 939
45． 6 1 776 735
57． 0 2 190 622
68． 4 2 612 431
91． 2 3 478 165
2． 3． 2 精密度实验 取“2． 3． 1”项下 22． 8 μg /ml 浓度的对照品
溶液，进样 20 μl，测定峰面积，结果 RSD为 0． 10% ＜ 2%(n = 6) ，
表明仪器精密度良好。
2． 3． 3 重复性实验 取贯叶连翘提取物粉末，按“2． 1． 2”项下方
法平行制备 6 份，照 3 项下色谱条件进行测定，记录金丝桃苷色
谱峰的峰面积代入“2． 3． 1”项下回归方程计算含量，结果贯叶连
翘提取物中金丝桃苷含量平均值为 0． 012%，RSD = 0． 41% ＜ 2%
(n = 6) ，说明该方法重复性良好。
图 3 标准曲线图
2． 3． 4 稳定性实验 取同一份供试品溶液，按“2． 2”项下色谱条
件在 25，30，35，40℃不同柱温条件下分别进样测定，结果 RSD ＞
2%，表明金丝桃苷受温度影响较大，稳定性欠佳。
2． 3． 5 回收率实验 采用加样回收测定法。取已测知金丝桃苷
含量的贯叶连翘提取物粉末，研细，称取约 1 g，平行制备 6 份，置
10 ml棕色容量瓶中，精密加入对照品储备液 1 ml，按“2． 1． 2”项
下从“加甲醇适量”开始重复操作，计算回收率，结果回收率在
98% ～ 102%之间，RSD = 1． 37% ＜ 2%，说明该方法准确度好。
见表 2。
表 2 回收率考察结果
编
号
取样量
m /g
样品中含量
m /μg
加入量
m /μg
实测总量
m /μg
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
1 1． 0129 122 228 347 98． 68
2 1． 0100 121 228 353 101． 8
3 1． 0074 121 228 347 99． 12
4 1． 0009 120 228 352 101． 8 100． 7 1． 37
5 1． 0048 121 228 352 101． 3
6 1． 0025 120 228 351 101． 3
2． 4 样品测定 按“2． 2”项下供试品溶液制备方法，平行制备 3
份，按“2． 2”项下色谱条件测定，代入“2． 3． 1”项下建立的回归方
程，计算贯叶连翘提取物中金丝桃苷的含量为 0． 012%，RSD =
0． 13 ＜ 2%。
3 讨论
3． 1 流动相比例及检测波长的选择 文献报道金丝桃苷的含量
测定法以高效液相色谱法的应用最为广泛，且所用流动相也较广
泛，有乙腈 － 0． 1%磷酸溶液(16 ∶ 84) ，甲醇 － 0． 5%磷酸溶液
(45∶ 55，V /V，用三乙胺调 pH至 3． 0) ，乙腈 －磷酸盐缓冲液(70
∶ 30)等［12 ～ 14］。本文参考药典收载方法，再进行实验摸索后，检
测器在 200 ～ 800 nm范围内扫描，发现在 256 nm处有最大吸收，
干扰少，对比药典所选 360nm，我们选择 256 nm 作为检测波长，
乙腈 － 0． 1%磷酸(15∶ 85)为流动相，在此条件下金丝桃苷与其
它组分分离效果最好。
3． 2 柱温的选择 分别采用 25℃，30℃，35℃，40℃的柱温对供试
品进行分析。随温度的升高，保留时间缩短，柱效增加，分离效果
更好，由于金丝桃苷稳定性欠佳，采用 35℃作为柱温，就能得到
较好的结果。
3． 3 制备供试品方法的确定 比较了以甲醇为溶媒的超声 30
min和以 60%乙醇回流 1 h的处理方法，两种方法的金丝桃苷提
取率相当，最后确定以甲醇超声 30 min，操作方便，节能省时。
3． 4 滤膜的选择 张俊松等［12］发现普通尼龙滤膜对伪金丝桃素
的吸附作用非常强，在提取过滤中我们发现普通尼龙微孔滤膜对
金丝桃苷也有明显的吸附作用，改用 PTFE滤膜过滤，吸附较小。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 10 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 10 期
由于我国贯叶连翘资源丰富，做好药材及提取物的质量控制
尤其重要，本文建立了一种简便、快速、准确的贯叶连翘提取物中
金丝桃苷的含量测定方法，为进一步探寻贯叶连翘在复方制剂中
的配伍规律和应用提供了可靠的方法依据。
参考文献:
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收稿日期:2012-04-17; 修订日期:2012-07-22
基金项目:山东省自然科学基金(No． Y2008C24)
作者简介:李 洁(1973-) ，女(汉族) ，山东德州人，现任山东中医药大学
副教授，博士学位，主要从事中药质量控制与药理研究工作．
白花蛇舌草抗肝癌 H22小鼠血道转移的实验研究
李 洁，孙 静，宋 健
(山东中医药大学，山东 济南 250355)
摘要:目的 观察白花蛇舌草对小鼠肝癌血道转移的影响。方法 在小鼠尾静脉接种腹水型肝癌 H22瘤株，复制血道转移
模型，观察小鼠体质量、免疫器官、肺部转移率等指标变化。结果 白花蛇舌草作用组的小鼠，肺重量和肺部转移结节数
较造模组明显减少，体质量和免疫器官重量有较明显增加。结论 白花蛇舌草对 H22肝癌血道转移有一定的抑制作用。
关键词:白花蛇舌草; H22; 抗肿瘤; 血道转移
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 10． 022
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)10-2434-02
Experimental Research on Effect of Hedyotis diffusa Willd on Blood Metastasis in H22
mice
LI Jie，SUN Jing，SONG Jian
(Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)
Abstract:Objective To observe the effects of Hedyotis diffusa Willd on blood metastasis in mice．Methods The blood metasta-
sis model was established by subcutaneous injection of H22 cells into the mouse tail vein and the changes of mouse weight，the
weight of immune organ，lung metastasis． Results The body weight and the weight of immune organs increased，lung nodules and
lung metastasis tumor growth index decreased in Hedgotis diffusa willd group as compared to model group． Conclusion Hedyotis
diffusa has inhibitory effect on the metastasis of hepatocarcinoma blood．
Key words:Hedyotis diffusa Willd; H22; Anti － tumor; Blood metastasis
肿瘤细胞转移是恶性肿瘤治疗的难点，血道转移是肿瘤细胞
转移过程中主要途径，研究抗肿瘤转移药物对临床治疗肿瘤有重
大意义。白花蛇舌草 Hedyotis diffusa Wilid 为茜草科一年生草本
植物白花蛇舌草的全草，该药味甘、苦，性寒，入心、肝、肺经，具有
清热解毒、利湿除尿、抗癌等功效，临床上常与其他中药联合治疗
多种肿瘤，如胃癌、直肠癌、宫颈癌［1］等。目前尚未发现有白花
蛇舌草抗肿瘤转移的研究报道。为探索其抗肿瘤转移的作用机
制，本文通过对腹水型 H22肝癌小鼠血道转移的抑制作用进行研
究观察，以便为白花蛇舌草抗肿瘤新药的研发提供依据。
1 材料与仪器
1． 1 药材 白花蛇舌草 Hedyotis diffusa Willd 购自济南市建联中
药饮片厂(批号:20100202) ，经山东中医药大学药学院专家鉴定
质量符合实验要求。
1． 2 动物及瘤株 昆明种小鼠 60 只，雄性，体质量(20 ± 2)g，由
山东中医药大学实验动物中心提供。小鼠腹水型 H22肝癌瘤株，
由山东省医学科学院药物所肿瘤室提供。
1． 3 仪器与试剂 超净工作台(北京半导体设备厂) ;FA2004 型
电子天平(上海天平仪器厂) ;环磷酰胺(CTX，规格:200 mg /支，
产品批号:11013121) (江苏恒瑞医药股份有限公司)。
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 10