全 文 ：基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划 2003AA2Z3524)
作者简介:彭金咏 ,男 ,博士　　＊通讯作者:范国荣 ,男 ,副教授 ,硕士生导师　　Tel:021-25070388　　E-mail:Guorfan@yahoo.com.cn
白花败酱草黄酮类成分的高速逆流色谱快速制备
彭金咏 ,范国荣＊ ,吴玉田(第二军医大学药学院 ,上海 200433)
摘要:目的　应用高速逆流色谱分离纯化白花败酱草化学成分。方法　利用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶0.6∶0.6∶1)为两相
溶剂系统 ,主机转速 800 r·min-1 ,上相为固定相 , 下相为流动相 ,流速 2.0 mL·min-1 , 检测波长 254 nm , 所得产物经高效液相色
谱法检测 ,结构经 MS 、1H-NMR和13C-NMR鉴定。结果　6 h 内经一步洗脱从 400 mg白花败酱草乙酸乙酯萃取物中分离得到纯
度高于 98%的木犀草素 26 mg , 5-羟基-7 , 4′-二甲氧基黄酮 15 mg和 5-羟基-7 , 3′, 4′-三甲氧基黄酮 21 mg。 结论　3 个化合物均
为首次从败酱属植物中分离得到 ,该分离制备法简便 、快速 、产物纯度高。
关键词:白花败酱草;黄酮;制备色谱;逆流色谱
中图分类号:R284　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2006)13-0977-03
Isolation and Separation of Flavones from Patrinia villosa by High-Speed Counter-Current Chromatography
PENG Jin-yong , FAN Guo-rong＊ , WU Yu-tian(College of Pharmacy , Second Military Medical University , Shanghai 200433 , Chi-
na)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To develop a preparative high-speed counter-current chromatography(HSCCC)for isolating the chemical con-
stituents from Patrinia villosa Juss.METHODS　A two-phase solvent system composed of n-hexane:ethyl acetate:methanol:water (1∶
0.6∶0.6∶1)was used.at a flow rate of 2.0 mL·min-1 , while the apparatus rotated at 800 r·min-1 and the effluent was detected at 254 nm.
The obtained fractions were analyzed by HPLC and identified by MS , 1H-NMR and 13C-NMR.RESULTS　26 mg luteolin , 15 mg 5-hydroxyl-
7 , 4′-dimethoxy flavone and 21 mg 5-hydroxyl-7 , 3′, 4′-trimethoxy flavone with purities of over 98%were obtained from 400 mg crude extract
in one-step elution and less than 6 hours.CONCLUSION　Three kinds of flavones are all discovered from the plant of Patrinia genius for the
first time.The results indicate that HSCCC is a powerful technique of purification for natural products.
KEY WORDS:Patrinia villosa Juss;flavone;preparative chromatography;counter-current chromatography
　　白花败酱草(Patrinia villosa Juss)又名苦菜 、苦
斋 、鹿肠 ,系败酱科多年生草本植物 ,分布于我国华
东 、华中 、华南及西南各地 。因其含有多种氨基酸 、
维生素和矿物质等有益成分而被人们广泛食用[ 1] ,
它也是一种常用中药 ,始载于《神农本草经》 , 曾被
《中国药典》(1977年版)收载 ,具有清热利湿 、解毒
排脓 、活血化瘀 、清心安神 、促进肝细胞再生 、改善肝
功能 、增强抑菌和抗病毒等作用 ,临床上常用于治疗
阑尾炎 、痢疾 、肝炎 、扁桃体炎 、流行性腮腺炎 、痈肿
等症[ 1-2] 。有关白花败酱草化学成分研究报道的较
少 ,仅涉及几种环烯醚萜类化合物[ 3] 。因此 ,进一步
研究白花败酱草的化学成分 ,对阐明其药效物质基
础 、质量控制 、开发现代中药新药和充分利用我国的
药材资源等具有意义 。
采用柱色谱法和重结晶等传统的分离制备方法
分离植物中的有效单体 ,不仅费时费力 、污染环境 ,
而且所用固定相对样品有不可逆性吸附作用。高速
逆流色谱(HSCCC)是一种较新型的液液分配色谱技
术 ,它不用任何固体支撑体或载体而克服了传统分
离方法对样品的不可逆性吸附作用 ,因而样品回收
率高 ,同时还具有应用范围广 、仪器操作简单 、分离
量大等优点[ 4-5] 。
本研究中采用溶剂提取和萃取法得到粗提物 ,
以此粗提物直接进行高速逆流色谱分离纯化 ,经一
步洗脱分离得到纯度高于 98%的木犀草素 、5-羟基-
7 ,4′-二甲氧基黄酮和 5-羟基-7 , 3′, 4′-三甲氧基黄
酮 ,3者均为首次从败酱属植物中发现。该法操作
简单 、产物纯度高。目前 ,尚未见快速 、简便从白花
败酱草中分离多种成分的报道。
1　仪器与材料
TBE-300A高速逆流色谱仪(深圳同田生化技
术有限公司)。聚四氟乙烯管缠绕在 3个水平轴上
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形成螺旋管(管直径 2.6 mm ,分离体积 300 mL),20
mL 进样圈 。该HSCCC 还配备了柱塞式泵(S 系列 ,
北京圣益通技术开发有限公司), UV-Ⅱ型检测器
(中国科学院上海生物化学所),N2010色谱工作站
(浙江大学智能信息工程研究所)。Waters 高效液相
色谱仪 , 包括 515 泵 , 2487 检测器 , 20 μL 定量圈 ,
N2000色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究
所)。
白花败酱草购自上海童涵春中药饮片厂 ,经第
二军医大学生药学教研室秦路平博士鉴定 ,实验中
所用石油醚 、乙酸乙酯 、甲醇 、正己烷 、冰醋酸均为分
析纯(中国医药集团上海化学试剂公司),乙腈为色
谱纯(默克),水为自制重蒸馏水 ,并经微孔滤膜过
滤。
2　提取分离
2.1 　白花败酱草粗提物制备
将药材适当粉粹 ,称取粗粉 3.0 kg ,加 8倍量体
积分数为 70%乙醇 ,回流提取 2次 ,每次 2.0 h。过
滤 ,合并滤液 ,减压回收乙醇 ,得浸膏 。取浸膏加适
量水混悬后 ,依次用石油醚和乙酸乙酯萃取 ,乙酸乙
酯萃取物减压浓缩后真空干燥得浅黄色粉末 46.5 g
(提取率为 1.55%),置冰箱保存 ,备用。精密称取
400 mg 进行高速逆流色谱分离制备。
2.2　高效液相色谱分析条件
色谱柱:Lichrospher C18(6.0 mm×150mm ,5μm)
(汉邦科技有限公司),流动相为乙腈-水-冰醋酸=
60∶40∶2 ,流速 1.0 mL·min-1 ,检测波长 254 nm ,柱温
为室温 ,进样量 20μL。在此条件下乙酸乙酯萃取物
色谱图见图 1-A ,峰 1 ,2 ,3分别为木犀草素 、5-羟基-
7 ,4′-二甲氧基黄酮 、5-羟基-7 ,3′,4′-三甲氧基黄酮 。
2.3　高速逆流色谱分离制备
在逆流色谱中 ,一个好的溶剂系统应满足下列
要求[ 6] :①固定相要有较高的保留率;②两相溶剂系
统的分层时间短于 30 s;③分配系数(K)应当接近
1;④两色谱峰的分离度(α)大于 1.5。分配系数太
大或太小都不利于分离 ,分离度太小则容易造成峰
重叠 ,太大则易引起色谱峰扩宽 。溶剂体系的选择
对分离效果至关重要 ,本研究中 ,根据所分离化合物
特性 ,考察了正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水这一溶剂体
系在不同配比条件下目标成分的分配情况 ,并根据
文献[ 6]来计算分配系数与分离度值 ,即分配系数
K =Auppe r/A lower ,分离度 α=K2/K1 ,K2>K1 ,结果见
表1。由此选择正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=1∶0.6∶
0.6∶1 为分离木犀草素 、5-羟基-7 , 4′-二甲氧基黄酮
　　
图 1　HPLC 色谱图
A-粗提物;B-逆流色谱流分Ⅰ ;C-逆流色谱流分 Ⅱ;D-逆流色谱流分Ⅲ;
1-木犀草素;2-5-羟基-7 , 4′-二甲氧基黄酮;3-5-羟基-7 ,3′,4′-三甲氧基黄酮
Fig 1　HPLC chromatogram
A-crude extract;B-fractionⅠ ;C-fractionⅡ;D-fraction Ⅲ;1-luteolin;2-5-
hydroxy l-7 ,4′-dimethoxy flavone;3-5 hydroxyl-7 , 3′,4′-trimethoxy flavone
与 5-羟基-7 ,3′,4′-三甲氧基黄酮所用的两相溶剂系
统 。在分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=
1∶0.6∶0.6∶1两相溶剂体系 ,充分振摇后静止 ,使用
前分取上下相 ,超声脱气后泵入逆流色谱仪 。先将
HSCCC分离管中充满上相 ,调整主机转速为 800 r·
min-1 ,再以 2.0 mL·min-1流速泵入下相 ,待流动相
从柱出口流出 ,表明两相在分离管中建立了动态平
衡 ,由进样阀进样 ,流出液用紫外检测器在 254 nm
处进行检测 ,同时记录色谱图 ,根据色谱图接收目标
成分。结果在6 h内共分离得到 3个流分 ,即“ Ⅰ” 、
“ Ⅱ”和“ Ⅲ” ,逆流色谱图见图 2。
表 1　不同溶剂体系中分离化合物的分配系数与分离度值
Tab 1　Partition coefficient(K)and separation factor(α)of the
target compounds
Solvent system Compound 1 Compound 2 Compound 3
n-Hexane:ethy l ac-
etate:methanol:water K1 α1 K2 α2 K3
1∶0.2∶0.2∶1 0.012 2.83 0.034 1.47 0.084
1∶0.4∶0.4∶1 0.087 1.38 0.12 2.67 0.32
1∶0.6∶0.6∶1 0.25 2.44 0.61 1.80 1.10
1∶0.8∶0.8∶1 0.78 1.86 1.45 1.37 1.98
1∶1∶1∶1 1.12 1.54 1.72 1.31 2.25
1∶1.2∶1.2∶1 1.45 1.37 1.98 1.45 2.87
注:化合物 1 , 2 ,3分别为木犀草素 、5-羟基-7 ,4′-二甲氧基黄酮与 5-羟基-7 ,3′,
4′-三甲氧基黄酮;α1=K2/K1 , α2=K3/K 2
Note:Compounds 1 , 2 ,3 are respective luteolin , 5-hydroxy l-7 ,4′-dimethoxy flavone , 5-
hydroxy l-7 ,3′,4′-trimethoxy flavone ,α1=K2/K1 ,α2=K3/K2
3　产物纯度检测及结构鉴定
所得流分经 HPLC 分析表明 Ⅰ , Ⅱ和 Ⅲ均为单
一色谱峰色谱图见图 1-B , C , D , 峰纯度分别为
98.8%,98.2%和 99.1%(峰面积归一化法)。各流
分减压回收溶剂后真空干燥得 26 mg 化合物 Ⅰ , 15
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图 2　粗提物逆流色谱图。 Ⅰ , Ⅱ , Ⅲ -接收流分
Fig 2　HSCCC chromatogram of the crude extract.Ⅰ , Ⅱ , Ⅲ -
collected fractions
mg化合物 Ⅱ和 21 mg 化合物Ⅲ ,3者均为浅黄色粉
末。
流分Ⅰ :浅黄色粉末 ,mp 235 ～ 238 ℃,UVλnm:
358 , 259 , 270 (MeOH)。TOF-MS:285 [ M-H] - , 571
[ 2M-H] -。1H-NMR (500 MHz , DMSO-d6)δ:13.02
(1H ,br s ,5-OH), 7.45 (1H , dd , J =2.5 , 8.5 Hz , 6′-
H),7.40(1H , d , J =2.5 Hz ,2′-H),6.91(1H , d , J =
8.5 Hz , 5′-H), 6.71 (1H , s , 3-H), 6.47 (1H , d , J =
2.0 Hz , 6-H), 6.59 (1H , d , J = 1.6 Hz , H-8)。13C-
NMR(125MHz ,DMSO-d6)δ:163.8(C-2),103.3(C-
3),181.4(C-4),161.4(C-5),99.0(C-6), 164.9(C-
7),93.9(C-8), 157.3(C-9),103.9(C-10),118.8(C-
1′),113.1(C-2′), 145.9(C-3′),149.9(C-4′), 116.0
(C-5′),121.7 (C-6′)。以上数据与文献[ 7] 对照一
致 ,可以断定Ⅰ为木犀草素。
流分 Ⅱ:浅黄色粉末 ,mp 143 ～ 145 ℃,盐酸镁
粉反应呈阳性 。ESI-MS m/z :321 [M +Na] +。1H-
NMR(500 MHz , DMSO-d6)δ:6.41 (1H , d , J =2.0
Hz , 6-H), 6.83(1H ,d , J =2.0 Hz ,8-H),6.98(1H , s ,
3-H),7.12(2H , d , J =9.0 Hz ,3′,5′-H),8.10(2H ,d ,
J =9.0 Hz , 2′, 6′-H), 12.95 (1H , s , 5-OH)。13C-NMR
(125 MHz , DMSO-d6)δ:163.8 (C-2), 103.8(C-3),
182.2(C-4), 161.4(C-5), 98.2 (C-6), 165.4(C-7),
92.9(C-8), 104.4(C-10), 157.4(C-9), 122.9(C-1′),
128.6(C-2′, C-6′), 114.8(C-3′, C-5′), 162.6(C-4′),
55.8(4′-OCH3),56.3(7-OCH3)。以上数据与文献[ 8]
对照一致 ,可以确认 Ⅱ为 5-羟基-7 , 4′-二甲氧基黄
酮。
流分 Ⅲ:浅黄色粉末 ,mp 167 ～ 169 ℃,盐酸镁
粉反应呈阳性 。ESI-MS m/z :351 [M +Na] +;1H-
NMR(500 MHz , DMSO-d6)δ:3.91 (9H , s , OCH3 ×
　　
3),6.42(1H ,d , J =2.0 Hz ,6-H),6.82(1H , d , J =
2.0Hz ,8-H),7.09(1H , s ,3-H), 7.15(1H , d , J =8.5
Hz ,5′-H), 7.60(1H , d , J =2.0 Hz ,2′-H),7.73(1H ,
dd , J =2.0 ,8.5 Hz ,6′-H), 12.91(1H , s , 5-OH)。13C-
NMR(125 MHz ,DMSO-d6)δ:161.3(C-2 ,C-5),104.2
(C-3 ,C-10), 182.3 (C-4),98.3 (C-6), 165.4 (C-7),
92.9 (C-8), 157.5 (C-9), 122.9 (C-1′), 109.7 (C-
2′),149.2(C-3′),152.4(C-4′), 111.9(C-5′),120.4
(C-6′),55.7 (7-OCH3), 56.1 (4′- OCH3), 56.3 (3′-
OCH3)。以上数据与文献[ 9]对照一致 ,可以确认 Ⅲ
为 5-羟基-7 ,3′,4′-三甲氧基黄酮。
4　讨　论
本实验采用高速逆流色谱法从白花败酱草乙酸
乙酯萃取物中直接分离得到 3个纯度高于 98%的
黄酮 ,简便 、快速 。在逆流色谱分离过程中 ,进样量
为 400 mg ,分离得到的化合物总量为 62 mg ,其余部
分主要是最易溶于流动相和固定相的化合物 ,分别
为最早出峰(第一个平头峰)和最迟出峰(保留在固
定相中),除此之外还有部分没有吸收的化合物 。这
样就将目标成分与杂质分开 ,达到分离的目的。
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(收稿日期:2005-05-26)
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