全 文 ：［收稿日期］ 20110526(004)
［基金项目］ 北京市教育委员会科技计划面上项目(KM200810025008)
［第一作者］ 林燕，硕士，研究实习员，从事中药药理，Tel:010-52176669，E-mail:linyan18@ sina． com
［通讯作者］ * 王笑民，博士，主任医师，从事肿瘤的中西医结合治疗及基础研究，Tel:010-52176508，E-mail:ntxm100@ sina． com
鸡血藤黄酮类有效部位对人肺腺癌 A549细胞氧化应激的影响
林燕1，李萍1，王燕1，解欣然1，张蕾1，何薇1，杨国旺2，王笑民2*
(1. 北京市中医研究所，北京 100010;2. 首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010)
［摘要］ 目的:探讨鸡血藤黄酮类有效部位(SSCE) 对人肺腺癌A549 细胞的杀伤活性与氧化应激反应的相关性。方法:
实验分为 SSCE 高、中、低剂量组和正常对照组，各组分别加入不同浓度的 SSCE( 正常组用培养基代替) 作用人肺腺癌A549 细
胞24 h后，采用脂质过氧化物(MDA)、谷胱甘肽(GSH) 试剂盒检测A549 细胞 MDA，GSH 的含量; 以2，7-二氯荧光素二乙酸
酯(DCFH-DA) 为荧光探针，用荧光酶标法和共聚焦荧光显微镜法检测活性氧(ROS) ; 选择加入SSCE 高浓度组同时加入抗氧
化剂维生素 C(Vit C) ，维生素E(Vit E) ，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx) ，过氧化氢酶(CAT) 作用细胞24 h 后，采用 CCK-8 法检测
A549 细胞增殖情况及荧光酶标仪法检测 ROS。结果:加入 SSCE 后，SSCE 各组细胞 MDA 均含量上升(P ＜ 0. 01)、高浓度组
GSH 含量下降(P ＜ 0. 01) ;高、中浓度组细胞 ROS 含量上升(P ＜ 0. 01) ;共聚焦显示SSCE 各组均有绿色荧光，其中高、中浓度
组荧光较强;加入抗氧化剂后，各组细胞抑制率均降低(P ＜ 0. 05) ，ROS 含量均下降(P ＜ 0. 01)。结论:SSCE 可以改变 A549
细胞 MDA，GSH，ROS 水平，其抗肿瘤作用可能是通过诱导肿瘤细胞氧化应激反应而实现的。
［关键词］ 鸡血藤黄酮类有效部位;活性氧;氧化应激;A549 细胞
［中图分类号］ R285． 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)04-0190-04
Effect of Active Part of Spatholobus Suberectus Flavonoid on
Oxidative Stress of Human Pulmonary Adenocarcinoma Cell A549
LIN Yan1，LI Ping1，WANG Yan1，XIE Xin-ran1，ZHANG Lei1，HE Wei1，YANG Guo-wang2，WANG Xiao-min2*
(1. Beijing Institute of Chinese Medicine，Beijing 100010，China;
2. Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Capital University of Medical Sciences，Beijing 100010，China)
［Abstract］ Objective:To investigate the effect of active part of spatholobus suberectus flavonoid (SSCE)
on oxidative stress in human pulmonary adenocarcinoma cell A549. Method:Cells were divided into a high-dose
group，a moderate-dose，a low-dose group and a normal control group． Cell A549 were interfered with different
dosages of SSCE active part for 24 h (normal group with DMEM) level of malonic dialde hyde(MDA) and
glutathione(GSH) ;reactive oxygen speiesROS was detected using fluorescence microplate reader and confocal
fluorescence microscope，and using DCFH-DA as fluorescent probe;Antioxidant was added，CCK-8 was employed
to detect cell proliferation of A549 and ROS was detected by fluorescence microplate reader． Result:After the
addition of SSCE，MDA content in each group increased (P ＜ 0. 01) and GSH content in high density group
decreased (P ＜ 0. 01) ;Cell ROS content in high and middle density groups increased (P ＜ 0. 01) ;Each group
showed green fluorescence under confocal microscope，in which the high and middle density group showed higher;
Addition of antioxidant made decrease of cell inhibition (P ＜ 0. 05)and ROS content (P ＜ 0. 01)． Conclusion:
SSCE can change the level of A549 MDA，GSH and ROS，and its mechanism of antitumor might be inducing
oxidative stress reaction of tumor cells．
［Key words］ spatholobus suberectus flavonoids (SSCE) ;reactive oxygen speies; oxidative stress;
A549 cell
·091·
第 18 卷第 4 期
2012 年 2 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 4
Feb．，2012
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.04.061
鸡血藤 Spatholobus suberctus Dun 是豆科崖豆藤
属的植物，是常用的养血活血药物，可用于肿瘤中晚
期病人血瘀证的治疗。以前的研究发现，鸡血藤提
取物在体内外均具有确切的抗肿瘤疗效［1-3］，醇提
取的黄酮类有效部位 SSCE 抗肿瘤活性最强，可抑
制人肺腺癌 A549 细胞的增殖，引起细胞周期阻滞，
诱导细胞凋亡［4］。根据前期研究，选用鸡血藤体外
抗肿瘤活性最强的黄酮类有效部位 SSCE 和较为敏
感的肺癌细胞系 A549 作为研究对象，从药物作用
前后细胞活性氧(ROS)、脂质过氧化物(MDA)、谷
胱甘肽(GSH) 水平及加入抗氧化剂后细胞增殖、细
胞 ROS 水平等方面评价细胞的氧化损伤程度，探讨
SSCE 对 A549 细胞的杀伤活性与癌细胞内氧化应
激反应之间的相关性，为进一步确定鸡血藤抗肿瘤
靶点提供依据。
1 材料
1. 1 细胞株 人肺腺癌细胞株 A549 购自北京协
和细胞中心。
1. 2 试剂 鸡血藤黄酮类化合物(SSCE) 由北京市
中医研究所药理研究室提供，为粉末剂型。CCK-8
试剂盒由日本同仁化学研究所提供。MDA 试剂盒、
GSH 试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。2，
7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、Vit C、谷胱甘
肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT) 由Sigma
公司提供。Vit E 由 MERCK 公司提供。
1. 3 仪 器 SA1000 型 酶 标 仪 ( 奥 地 利
ASYSHITECH 公司) ，FV500 型共聚焦扫描荧光显
微镜( 日本Olympus 公司) ，SpectraMax GeminiEM 型
荧光酶标仪 SpectraMax GeminiEM(MD 公司)。
2 方法
2. 1 细胞分组 ①对照组: 人肺腺癌A549 细胞 +
完全 F12 培养液;②低剂量组: 人肺腺癌A549 细
胞 + 40 mg·L － 1 SSCE;③中剂量组: 人肺腺癌A549
细胞 + 80 mg·L － 1 SSCE;④高剂量组: 人肺腺癌
A549 细胞 + 160 mg·L － 1 SSCE。
2. 2 SSCE 对人肺腺癌 A549 MDA，GSH 水平的影
响 将人肺腺癌 A549 细胞以 1 × 105 /mL密度接种
于 12 孔板中，每孔 1 mL，细胞贴壁 24 h 后，各实验
组分别加入不同剂量的 SSCE，每孔 1 mL，对照组加
入完全 F12 培养液 1 mL，放入 37 ℃ CO2 培养箱中
分别培养 24 h 后，收集细胞，用 MDA 试剂盒、GSH
试剂盒进行检测。每次试验各实验组设 6 个复孔，
实验重复 3 次。
2. 3 SSCE 对 A549 细胞 ROS 水平的影响 DCFH-
DA 可被细胞内 ROS 氧化为发荧光的 DCF，采用荧
光酶标仪和共聚焦荧光显微镜测定 DCF 荧光强度
即代表细胞的 ROS 水平。
2. 3. 1 荧光酶标仪法检测 ROS 将 A549 细胞以
2 × 105 /mL密度接种于 96 孔板中，每孔 100 μL，细
胞贴壁生长 24 h 后，各实验组分别加入不同剂量的
SSCE，每孔 100 μL，对照组加入完全 F12 培养液
100 μL，37 ℃ CO2 培养箱中培养 24 h 后，加入
DCFH-DA 荧光探针至终浓度 5 μmol·L － 1，37 ℃
CO2 培养箱中避光孵育 15 min，放入荧光酶标仪检
测，检测条件为激发波长 497 nm，发射波长 512 nm。
每次试验各实验组设 6 个复孔，实验重复 3 次。
2. 3. 2 共聚焦荧光显微镜检测 ROS 将 A549 细
胞以 1 × 104 /mL 密度接种于共聚焦小皿中，待细胞
贴壁生长 24 h 后弃培养液，对照组加入完全 F12 培
养液 1 mL，实验组加入质量浓度为 160 mg·L － 1
SSCE 4 mL，6 h 后吸出液体，PBS 洗 1 遍，加入 200
μL DCFH-DA(20 μmol·L － 1) ，放入37 ℃ CO2 培养箱
中避光孵育 15 min，再用 PBS清洗 3 遍，用共聚焦进行
检测，检测条件为激发波长 497 nm，发射波长 512 nm。
2. 4 加入抗氧化剂后 SSCE 对 A549 细胞增殖及
ROS 的影响 实验设正常对照组、模型组(SSCE 终
质量浓度为 160 mg·L － 1)、Vit C 组(Vit C 250 μmol·
L － 1 + SSCE 160 mg·L － 1)、Vit E 组 (Vit E 250
μmol·L － 1 + SSCE 160 mg·L － 1)、GPx 组(GPx 0. 5 U·
L － 1 + SSCE 160 mg·L － 1)、CAT 组(CAT 1 U·L － 1 +
SSCE 160 mg·L － 1)。细胞 96 孔板贴壁生长 24 h 后，
按实验组分别加入不同剂量的药物，每孔 100 μL，对
照组加入完全 F12 培养液 100 μL，37 ℃ CO2 培养箱
中培养 24 h。
2. 4. 1 加入抗氧化剂后 SSCE 对 A549 细胞增殖的
影响 检测前 4 h，每孔加入 CCK-8 各 10 μL，酶标
仪 450 nm 处检测吸光度(A)。每次试验各组设 6
个复孔，实验重复 3 次。
2. 4. 2 加入抗氧化剂后观察 SSCE 对 A549 细胞
ROS 的影响 用荧光酶标仪法检测 ROS，每次试验
各组设 6 个复孔，实验重复 3 次。
2. 5 统计学方法 应用 SPSS 15. 0 软件进行统计
分析，计量资料以 珋x ± s 表示。采用单因素方差分析
(One-way ANOVA) ，以P ＜ 0. 05 为差异有统计学
意义。
3 结果
3. 1 SSCE 对人肺腺癌 A549 细胞 MDA，GSH 水平
的影响 MDA 为过氧化脂质的代谢产物，其含量间
·191·
林燕，等:鸡血藤黄酮类有效部位对人肺腺癌A549 细胞氧化应激的影响
接证明细胞氧化损伤的水平。GSH 为体内重要的
抗氧化剂和自由基清除剂，其含量可间接反映细胞
抗氧化损伤的能力。结果显示，加入 SSCE 后，细胞
产生 MDA 显著增加，与正常组相比 SSCE 各组 MDA
含量均显著升高(P ＜ 0. 01) ，高浓度组GSH 含量显
著减少(P ＜ 0. 01)。见表 1。
3. 2 荧光酶标仪法检测 ROS 与正常组相比，
SSCE 各组均可使细胞 ROS 水平上升，其中高、中浓
度组差异显著(P ＜ 0. 01)。见表 1。
3. 3 共聚焦荧光显微镜检测 ROS 加入 SSCE 后，
细胞内荧光强度增大，说明细胞内产生大量 ROS，
其中高、中浓度组 ROS 增加较低浓度组更为明显。
见图 1。
表 1 SSCE 作用前后 A549 细胞 MDA、
GSH，ROS 水平(珋x ± s，n = 6)
组别
剂量
/mg·L － 1
MDA
/nmol·L － 1
GSH
/kU·L － 1
荧光强度
对照 4. 86 ± 3. 25 6. 53 ± 1. 35 124. 52 ± 24. 05
SSCE 160 37. 71 ± 9. 762) 4. 28 ± 2. 092) 251. 66 ± 56. 372)
80 33. 01 ± 9. 092) 5. 31 ± 1. 01 246. 25 ± 55. 062)
40 21. 72 ± 3. 082) 7. 53 ± 2. 17 147. 57 ± 47. 99
注:与正常组比较1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01。
3. 4 加入抗氧化剂后 SSCE 对 A549 细胞增殖的影
响 加入抗氧化剂后，与 SSCE 组比较细胞抑制率
显著降低(P ＜ 0. 05)。见表 2。
A．正常组;B． SSCE 160 mg·L － 1组;C． SSCE 80 mg·L － 1组;D． SSCE 40 mg·L － 1组
图 1 DCFH-DA 荧光标记共聚焦检测 A549 细胞 ROS( 每组2 张照片，黑色背景的为荧光特征，另一张为明场，× 600)
3. 5 加入抗氧化剂后 SSCE 对 A549 细胞 ROS 的影
响 加入抗氧化剂后，各组 ROS 含量明显下降(P ＜
0. 01) ，提示细胞抗氧化能力增强。见表 2。
表 2 加入抗氧化剂后 SSCE 对 A549 细胞抑制率
及 ROS 的影响(珋x ± s，n = 6)
组别 剂量 抑制率 /% 荧光强度
正常 － － 120. 69 ± 30. 782)
SSCE 对照 160 mg·L － 1 37. 69 ± 6. 78 280. 28 ± 23. 52
SSCE + VC3) 250 μmol·L － 1 20. 66 ± 5. 691) 180. 66 ± 35. 692)
SSCE + VE3) 250 μmol·L － 1 23. 83 ± 4. 931) 187. 83 ± 41. 932)
SSCE + GPx3) 0. 5 U·L － 1 24. 75 ± 5. 871) 193. 75 ± 45. 872)
SSCE + CAT3) 1 U·L － 1 26. 38 ± 6. 571) 120. 69 ± 30. 782)
注: 与SSCE 对照组比较1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01;3)SSCE 终浓度
为 160 mg·L － 1。
4 讨论
通常认为黄酮类化合物是天然的高效抗氧化
剂，它能防止氧化应激产生的高浓度活性氧(ROS)
对核酸、膜质和蛋白质等大分子的损害，起到防止细
胞突变和癌变的功效［5-6］。然而近年来的实验发
现，黄酮类化合物浓度的高低对肿瘤细胞内氧化还
原稳态会产生截然不同的影响，低浓度时有利于清
除活性氧，而高浓度则诱导肿瘤细胞产生 ROS，从
而引起 DNA 损伤，诱导细胞凋亡［7-8］。Chen YC 等
发现，某些黄酮类化合物在体外都能诱导癌细胞凋
亡，同时发现细胞内过氧化氢水平增高，而应用过氧
化氢酶(CAT) 等抗氧化剂能够抑制黄酮对肿瘤细胞
凋亡的诱导作用［9］。黄酮类化合物的促氧化作用
可能与其在细胞内的代谢产物以及肿瘤细胞内的氧
化还原水平有关。某些黄酮类物质，可通过氧化还
·291·
第 18 卷第 4 期
2012 年 2 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 4
Feb．，2012
原反应生成 ROS，还能大量消耗了细胞内的 GSH，
导致细胞抗氧化能力下降［10］。有报道，肿瘤细胞与
正常细胞的氧化还原水平不同。例如: 正常表皮细
胞和口腔癌细胞的内生过氧化氢酶活性不同，黄酮
类化合物( 儿茶素) 能诱导癌细胞产生氧化应激，而
正常细胞则能将活性氧调至正常水平［8］。这也许
是黄酮类化合物具有选择性杀伤作用的原因。
首都医科大学附属北京中医医院肿瘤科从临床
有确切疗效的方药“固本抑瘤Ⅱ号”( 为 本 院 内 部
制 剂，批 准 文 号 京 药 制 字 Z20053351) 中，经逐
步拆方筛选，发现养血活血中药-鸡血藤具有抑制肿
瘤活性，并成功分离纯化出富含黄酮类化合物的有
效组分 SSCE。前期研究结果显示，鸡血藤黄酮类组
分具有确切的直接抗肿瘤作用，SSCE 可抑制 A549
细胞增殖且抑制作用呈剂量依赖性，引起细胞周期
阻滞，诱导细胞凋亡。
本研究旨在探讨 SSCE 对 A549 细胞的杀伤活
性与肿瘤细胞内氧化应激反应之间的相关性。本实
验结果提示 SSCE 可能通过消耗 A549 细胞的 GSH，
降低其抗氧化能力，诱导 A549 细胞发生氧化应激
反应产生大量的 ROS，导致细胞 MDA 含量增加，从
而抑制 A549 细胞增殖。说明 SSCE 对 A549 细胞的
杀伤活性与其细胞内氧化应激反应之间有一定的相
关性，为进一步研究鸡血藤黄酮类有效部位 SSCE
抗肿瘤作用靶点，确定 SSCE 抗肿瘤的作用机制提
供了依据。
［参考文献］
［1］ 唐勇，王笑民，何薇，等 ． 鸡血藤提取物体外抗肿瘤实
验研究［J］． 中国中医基础医学杂志，2007，13
(4) :15．
［2］ 唐勇，何薇，王玉芝，等 ． 鸡血藤黄酮类组分抗肿瘤活
性研 究［J］． 中 国 实 验 方 剂 学 杂 志， 2007， 13
(2) :51．
［3］ 唐勇，富琦，何薇，等 ． 鸡血藤抗肿瘤有效部位诱导
A549 肺癌细胞非凋亡性程序化死亡的研究［J］． 中
国中药杂志，2008，33(16) :2040．
［4］ 高珊，杨国旺，富琦，等 ． 鸡血藤黄酮类有效部位
SSCE 对人肺腺癌细胞 A549 细胞周期调控的分子机
制［J］．中国中医基础医学杂志，2010，16(3) :247．
［5］ Valko M，Leibfritz D，Moncol J，et al． Free radicals and
antioxidants in normal physiological functions and human
disease［J］． Int J Biochem Cell Biol，2007，39(1) :44．
［6］ Frei B，Higdon J V． Antioxidant activity of tea
polyphenols in vivo:evidence from animal studies［J］． J
Nutr，2003，133(10) :3275S．
［7］ Watjen W， Michels G， Steffan B， et al． Low
concentrations of flavonoids are protective in rat H4IIE
cells whereas high concentrations cause DNA damage
and apoptosis． J Nutr［J］． 2005，135(3) :525．
［8］ Yamamoto，S． Hsu，J． Lewis，et al． Green tea polyphenol
causes differential oxidative environments in tumor
versus normal epithelial cells［J］． J Pharmacol Exp
Ther，2003，307:230．
［9］ Chen Y C， Shen S C， Chow J M，et al． Flavone
inhibition of tumor growth via apoptosis in vitro and in
vivo［J］． Int J Oncol，2004，25(3) :661.
［10］ Spencer J P，Abd-el-Mohsen M M，Rice-Evans C，et al．
Cellular uptake and metabolism of flavonoids and their
metabolites:implications for their bioactivity［J］． Arch
Biochem Biophys． 2004，423(1) :148．
［责任编辑 聂淑琴］
·391·
林燕，等:鸡血藤黄酮类有效部位对人肺腺癌A549 细胞氧化应激的影响