全 文 ：收稿日期: 2001-02-20.
作者简介: 杨礼香 ( 1979- ) ,女 ,湖北潜江市人 ,博士研究生 , 主要从事植物组织培养方面的研究 .
　文章编号: 1000-1190( 2001) 04-0453-03
南方红豆杉组织培养和紫杉醇含量测定
杨礼香 , 周诗毅
(华中师范大学 生命科学学院 , 武汉 430079)
摘　要: 比较了从南方红豆杉的芽及幼茎诱导愈伤组织的情况 ,并对愈伤组织的增殖条件进行了
研究 ,利用 HPLC方法测定了愈伤组织合成紫杉醇的能力 ,结果表明以芽作为外植体在附加
2. 0 mg /L 2, 4-D和 0. 5 mg /L NAA的 M S培养基上 ,产生愈伤组织的速度较快 ,诱导效果最好 ,
第 5天即有愈伤组织发生 ,且诱导率可达 100% .附加 0. 5 mg / L 2, 4-D, 1. 0 mg /L NAA和
0. 5 mg /L KT的 B5培养基较适合愈伤组织的增殖 ,生长率达 7. 74 g /L ,紫杉醇含量达干重的
0. 0098% .
关键词: 南方红豆杉 ; 组织培养 ; 紫杉醇
中图分类号: Q949 文献标识码: A
　　红豆杉植物体内所含的紫杉醇 ( Taxol )作为一
种作用机理独特、高效、低毒的抗癌新药已引起了
世界各地的普遍关注 .目前 ,紫杉醇是治疗卵巢癌、
乳腺癌、肺癌的重要药物 .但是 ,由于其天然资源的
限制 ,造成了供远小于求的局面 ,从而也促进了寻
找及扩大紫杉醇药源途径的研究 .通过细胞培养生
产紫杉醇是一条较为有效的途径 .本文报道以南方
红豆杉 [ Taxus. Chinensis var. mairei ( Lemee et
Level ) cheng et L. K. Fu ]为材料 ,对愈伤组织的
诱导和驯化及紫杉醇的生产进行了研究 .
1 材料和方法
1. 1 材料
南方红豆杉的外植体采自广东省连州市高山
镇 .于夏、秋季取当年生的嫩茎和芽 ,于春季取刚萌
发的新枝 .
1. 2 方法
1. 2. 1 　愈伤组织的诱导　取芽和茎段 ,洗衣粉
清洗干净 ,再用清水冲洗约 2小时 ,用 70%的乙醇
浸一下后 ,放入 0. 2%升汞溶液中轻摇 12 min,无
菌水冲洗 5～ 6次 .叶片尖端剪去二分之一后 ,将茎
切成 1～ 1. 5 cm长的茎段 ,插入培养基中 .芽则去
除少部外鳞后 ,接入培养基 , 25℃ ,黑暗培养 .观察
各种 MS培养基中外植体产生愈伤组织的时间以
及愈伤组织的长势 , 30 d后统计各培养基中出现
的愈伤组织块数 ,计算愈伤组织的诱导率 (诱导率
= 愈伤组织的块数 /接种的芽数 ) .
1. 2. 2 愈伤组织的增殖　由于不同的激素配比对
南方红豆杉愈伤组织的生长和紫杉醇的积累都会
有影响 ,本实验在 B5培养基上附加不同配比的激
素 ,以选取较适合芽来源的愈伤组织生长的培养条
件 .从诱导的愈伤组织中筛选疏松 ,浅绿色或白色
的愈伤组织在含有不同激素种类和浓度的培养基
上继代培养 ,试验激素对愈伤组织增殖的效应 .芽
来源的愈伤组织可以直接转入增殖培养基中进一
步扩大培养 .茎段来源的愈伤组织则保留在外植体
上继代 2～ 3次 ,让其充分愈伤组织化后 ,再挑选色
浅的进行增殖 .增殖基本培养基为 B5培养基 .
1. 2. 3 紫杉醇的 HPLC分析　收取南方红豆杉愈
伤组织的培养物 ,在 40℃烘干至恒重 ,研碎后 ,将
样品精确称重 ,然后用索氏提取器提取 ,加入 150
mL氯仿 , 80℃水浴加热提取 4 h,然后用旋转蒸发
器回收氯仿 ,用甲醇将剩余残渣定容至 10 mL.滤
膜 (孔径 0. 45μm)过滤后备用 .
HP1100高效液相色谱系统 ,浙大智能 N2000
工作站 ,紫外检测器 ( 227 nm ) ,色谱柱为 kr100型 ,
RP- C18 ( 4. 6× 25 mm)柱 .柱温 40℃ ,流动相为甲
醇 /水 ( 55∶ 45) ,流速 1 mL /min ,衰减 500 mAU.
1. 2. 4 测定方法　南方红豆杉细胞生长量:液体
培养物过滤、洗涤 , 40℃烘干至恒重并称量干重 ,减
去接种细胞干重 ,然后换算成每升培养基增加的细
胞干重克数 ,即 g /L,表示细胞生长量 .
第 35卷第 4期 华中师范大学学报 (自然科学版 ) Vo l. 35 No. 4
2001年 12月 JOURN AL O F CEN TRAL CHIN A NORM AL UNIV ERSITY( Nat. Sci. ) Dec. 2001
紫杉醇的含量以百分率 (% )表示 .采用外标
法 ,计算培养细胞中紫杉醇的含量 .实验重复不少
于 3次 ,结果取平均值 .
2 结果与分析
2. 1 不同激素对愈伤组织诱导的影响
目前已有一些关于红豆杉属植物组织和细胞
培养的文献报道 [1～ 4 ] ,综合来看 ,主要采用茎段作
为外植体诱导愈伤组织 ,继代培养以后 ,建立细胞
系 .愈伤组织的诱导是最基础的一步 ,但是在以茎
段作为外植体诱导愈伤组织时 ,材料的污染率很高
甚至达 100% ,给诱导工作带来很大困难 .据有关
资料 ,目前从短叶红豆杉中至少已分离到 300多种
内生真菌 .因此 ,外植体特别是老的外植体受到这
类真菌的污染是经常会出现的 .在实验中 ,我们发
现以芽作为外植体 ,可以解决这个问题 ,而且由芽
来源的愈伤组织生长速度较快 .我们同时以幼嫩茎
段、芽作为外植体 ,对其诱导、愈伤组织的生长情况
作了较详细的对比 .结果如表 1.
表 1　不同植物激素组合对愈伤组织的诱导效应
培养基 激素的种类和浓度 /
( mg· L- 1)
出愈时间 /d
茎段 芽
诱导率 /%
茎段 芽
M S1 2, 4-D2. 0 10 7 88 97. 6
M S2 2, 4-D2. 0+ NAA0. 5 9 5 97 100
M S3 2, 4-D2. 0+ NAA0. 5+ K T0. 2 12 7 82. 7 43
M S4 2, 4-D2. 0+ NAA0. 5+ K T0. 5 25 - 74 0
M S5 N AA3. 0 9 8 93. 3 100
M S6 N AA3. 0+ 2, 4-D0. 5 9 9 92 100
M S7 N AA3. 0+ 2, 4-D0. 5+ K T0. 2 12 - 81 0
M S8 N AA3. 0+ 2, 4-D0. 5+ K T0. 5 27 - 77 0
观察结果表明 ,芽的污染率很低 ,几乎为零 ;
而茎段虽然是春季刚抽出来的 ,但其污染率仍为
25%左右 .从表 1中可以看出 ,不同的激素种类和
浓度对愈伤组织的诱导有较大差别 .对茎段而言 ,
2, 4-D的组合和 NAA的组合对茎段愈伤组织的
诱导时间和诱导率的效应相似 ,都可以在 2周内产
生愈伤组织 .茎段愈伤组织的产生先是茎两端膨
大 ,叶柄处产生愈伤组织团 ,然后整个茎膨大 ,叶片
也愈伤组织化 ,最后整个外植体可以全部转为愈伤
组织 .这与前人报道的一致 [5 ] . KT延迟了茎段愈
伤组织的产生 ,且降低了诱导率 .但低浓度的 KT
对愈伤组织的质地有改善作用 ,对茎段诱导的较好
培养基为 MS3.对芽来说 , 2, 4-D组合的效果比
NAA的稍好 . K T对芽愈伤组织的诱导有很大影
响 .在 M S4、 MS7、 MS8这 3种有 K T组合中 ,芽根
本无法产生愈伤组织 ,大约四周后 ,芽渐渐变成褐
色而死亡 .在 MS3中虽然有愈伤组织产生 ,但很快
褐化 ,生长极为缓慢 .芽诱导的最适培养基为 MS2 .
茎段和芽相比 ,芽的产生愈伤组织的时间早 ,诱导
率高 ,而且愈伤组织的生长速度快 .这可能是由于
芽的组织分化程度低 ,细胞分裂旺盛的原因 .芽和
茎段对 K T的反应不同 ,可能是两者内源激素水平
不同所致 .
紫杉醇含量测定色谱图见图 1、图 2.
图 1　紫杉醇标样色谱图
图 2　培养细胞中紫杉醇色谱图
2. 2 愈伤组织的增殖和驯化
在愈伤组织的增殖和驯化过程中 ,不同激素组
合均有不同程度的褐化现象 ,即使频繁继代 ,效果
也不理想 ,其中以 B5 ( 1)分泌褐色物较早、较多 .在
培养基中加入适量抗坏血酸、吸附剂可以减轻褐
化 . 32 d后收获 ,愈伤组织的生长量和紫杉醇的含
量见表 2.
从表 2中可以看出 ,由芽来源的愈伤组织在不同激
素作用下生长和紫杉醇积累差别较大 ,且愈伤组织
的生长与紫杉醇的积累呈负相关关系 .这可能与紫
杉醇的性质有关 ,紫杉醇本身是一种细胞分裂的抑
制剂 ,其积累愈多 ,对细胞增殖的抑制愈强 .总的来
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华中师范大学学报 (自然科学版 ) 第 35卷
看 B5 ( 5)较好 ,在 B5 ( 5)上的愈伤组织生长较快且
紫杉醇的积累较多 ,在 B5 ( 5)上多次继代后 ,形成
较为均一、稳定的无性系 .
表 2　南方红豆杉愈伤组织生长及紫杉醇含量测定结果
培养基 激素的种类和浓度 / ( mg· L- 1)
生长量 /
( g· L- 1 )
紫杉醇的
含量 /%
B5 ( 1) 2, 4-D2. 0+ NAA0. 5 9. 27 0. 0041
B5 ( 2) 2, 4-D2. 0+ NAA0. 5+ K T0. 2 7. 83 0. 0084
B5 ( 3) N AA3. 0+ 2, 4-D0. 5+ K T0. 2 8. 16 0. 007
B5 ( 4) 2, 4-D0. 5+ NAA1. 5+ K T0. 2 7. 52 0. 0098
B5 ( 5) 2, 4-D0. 5+ NAA1. 0+ K T0. 5 7. 74 0. 013
B5 ( 6) N AA0. 5+ KT1. 0 6. 81 0. 015
图 3　南方红豆杉愈伤组织的生长周期
2. 3 愈伤组织的生长周期
从图 3可以看出 ,南方红豆杉芽的愈伤组织的
生长呈“ S”形曲线 ,与一般植物愈伤组织的生长曲
线相似 .其生长周期为 32 d左右 ,延滞期较长 ,约
16 d,第 16～ 28天 ,为指数生长期和对数生长期 ,
此后进入稳定期 ,大约第 40 d后 ,愈伤组织开始衰
老、变黑 .紫杉醇含量变化曲线基本与愈伤组织生
长曲线相似 .因此 ,第 32 d为比较合适的采收
时间 .
参考文献:
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The tissue culture and the determination of taxol content
in callus of Taxus. Chinensis var. mairei
YANG Li-xon, ZHOU Shi-yi
( Co lleg e o f Life Science, Centra l China No rmal Unive rsity , Wuhan 430079)
Abstract: This paper makes an analysis on the Callus induction o f Taxus. Chinensis var .
mairei ( Lemee et Level ) cheng et L. K. Fu from bud to stem, the g row th and taxo l con-
tent o f Callus of bud, which indicates that buds a re easier than young stems for ini tiat-
ing Cal lus. The callus could be induced from bud af ter 5 days on M S medium supple-
mented w ith 2. 0 mg /L 2, 4-D and 0. 5 mg /L N AA. The ra te of callus induction f rom
bud is as high as 100% . The superio r medium fo r the callus g row th is B5 medium sup-
plemented wi th 0. 5 mg /L 2, 4-D、 1. 0 mg /L N AA and 0. 5 mg /L KT. Its g row th rate
and taxol content are 7. 74 g /L and 0. 0098% respectively.
Key words: Taxus. Chinensis var . mairei; tissue culture; tax ol
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第 4期 杨礼香等: 南方红豆杉组织培养和紫杉醇含量测定