全 文 ：2016年第 07期
学术 专业 人文 茶趣
白兰（Michelia alba DC.）属木兰科（Magnoliaceae）含笑属（Miche－
lia L.）常绿乔木，别称白玉兰、白兰花、白缅花、缅桂花，其花香浓郁持
久。白兰花是茶用香花，可用于窨制白兰花茶，也可以作为配料加工
茉莉花茶，以加重底香、增强鲜灵度[1]。前人已对白兰花香气成分进行
了研究，表明白兰花挥发性成分中含量较高的有芳樟醇、甲基异丁子
香酚、顺-罗勒烯、9，12，15-三烯十八醇、亚油酸甲醋、苯乙醇等化合
物[2]，其中主要为萜类物质，目前已从白兰花中共鉴定出 31种萜类化
合物[3]。白兰花具有止咳、化浊等药理功能，这可能与芳樟醇抗菌等功
能有关[4]。萜类代谢途径包括甲羟戊酸途径（MVA）和 2-甲基-D-赤藓
糖醇-4-磷酸途径（MEP）。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶
（HMGR）是甲羟戊酸途径中第一个限速酶，对于白兰花香气物质的形
成具有重要的作用[5]。已在巴西橡胶、马铃薯、铁皮石斛、茶树、茉莉花
等植物中分离得到 HMGR基因[6-10]。
目前从分子生物学角度对白兰花香气形成机理的研究尚未见报
道，本研究采用 RT-PCR技术成功克隆得到白兰花香气形成的萜类
代谢途径上 HMGR基因的保守区序列，命名为 McHMGR，并采用实
时荧光定量 PCR技术分析 McHMGR在白兰花不同开放时期的相对
表达量变化。拟通过本研究，为 McHMGR基因全长 cDNA的获得及
其功能验证奠定基础，阐明白兰花香气形成的分子机制，以期为生产
上白兰花茶的窨制和白兰花打底窨制茉莉花茶时间的合理运用提供
理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本实验以白兰花花瓣为供试材料，取自福建农林大学主干道旁
白兰树。于 2015年 7月下旬起，根据花被片张开程度将分 4个发育
时期（花芽期：花蕾绿色，苞片未张开；大花蕾期：花蕾白色，苞片已脱
落，花瓣与花柱夹角呈 0°；初花期：花被片微微张开，花瓣与花柱夹角
呈 30°；盛花期：白兰花全面盛开，花瓣与花柱夹角呈 90°，花被片遇触
碰脱落）采摘花瓣，称取 0.1g，用锡箔纸包裹后放入液氮速冻，于-80
℃冰箱保存备用。
1.2 白兰花花瓣总 RNA 的提取
采用多糖多酚植物总 RNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限
公司）提取白兰花总 RNA，并通过 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA质
量。
1.3 McHMGR 保守区的克隆
参照郑鸿昌[11]合成和纯化 cDNA第一链。从 GenBank下载已登录
的不同植物的 HMGR基因序列，根据已报道的人参（Panax ginseng）、
荔枝（Litchi chinensis）、茉莉花（Jasminum sambac（L.）Ait）等植物的
HMGR基因序列，使用 primer primer5软件根据比对序列的保守区设
计引物 McHMGR-F、McHMGR-R（表 1）。PCR 扩增采用 TransTaq
DNA Polymerase HiFi Fidelity（北京全式金生物技术有限公司）体系，
参照试剂盒说明书；程序为 95℃预变性 3 min；95℃变性 30 s，55℃退
火 30 s，72℃延伸 1 min，35个循环；72℃延伸 10min。PCR产物纯化回
收参照 TIANgel Midi Purification Kit试剂盒（北京天根生化科技有限
公司）说明书进行，连接克隆载体 pMD18-T，16℃连接过夜，转化大肠
杆菌 T1 感受态细胞，挑取单菌落进行验证，测序（上海铂尚生物技术
有限公司）。
表 1 引物序列
1.4 McHMGR 保守区的生物信息学分析
利用 BLAST（http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行氨基酸序
列同源性比对；利用 MEGA5.2软件构建 NJ系统进化树。
1.5 McHMGR 实时荧光定量 PCR 表达分析
分别提取处于花芽期、大花蕾期、初花期、盛花期四个时期的白
兰花瓣总 RNA，按照 TransScript Reverse Transcriptase 试剂盒（北京全
式金生物技术有限公司）说明书合成白兰花第一链 cDNA。根据
McHMGR 保守区序列设计荧光定量 PCR 引物 McHMGR-RT-F，
McHMGR-RT-R（表 1），以白兰花 18s-rRNA基因为内参，设置 3个生
物学重复，采用 GoTaq誖 qPCR Master Mix（北京普洛麦格生物技术有
限公司）进行 McHMGR荧光定量 PCR分析（BIO-RAD icycler real-
time quantity PCR仪）。试验数据釆用 2-△△Ct法进行定量分析。
2 结果与分析
2.1 McHMGR 保守区序列的克隆以及生物信息学分析
通过 RT-PCR技术获得白兰花 HMGR基因的保守区序列，该序
列长为 421bp，编码 128个氨基酸。通过与 NCBI数据库 BLAST比对，
结果表明，该序列推导出该基因编码的氨基酸序列与乐昌含笑
（Michelia chapensis）相似性达 99%，与野生大豆（G.sija Sleb.et Zucc.）、
鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb.）、小羊蒜（Paris fargesii）相似性分别
为 91%、89%、88%。初步判断该序列为白兰花 HMGR基因的保守区
片段，将该基因命名为 McHMGR。
利用 MEGA5.2 软件对 McHMGR 氨基酸序列构建系统进化树
（图 1），构建方法为邻近连接法（Neighbor-Joining,NJ）。系统进化树结
果显示，所获得到的 McHMGR 与同为木兰科含笑属乐昌含笑
（Michelia chapensis）的 HMGR基因属于同一分支，进一步确定该序列
为白兰花的 HMGR基因片段。
2.2 McHMGR 实时荧光定量 PCR 表达分析
采用实时荧光定量 PCR技术，以白兰花的 18s-rRNA为内参基因
白兰花萜类合成酶基因 McHMGR保守区的克隆及其表达分析
林 浥，俞 滢，陈 丹，陈 静，姚雪倩，陈桂信，叶乃兴 *
（福建农林大学园艺学院/福州茉莉花茶科技与全球重要农业文化遗产联合研究中心，福建 福州 350002）
摘 要：以白兰（Michelia alba DC.）花瓣为材料，采用 RT-PCR方法，克隆得到白兰花萜类代谢途径中 3-羟基-3-甲
基戊二酰辅酶 A 还原酶基因（McHMGR）的保守区，该 cDNA保守区长为 421bp，编码 128个氨基酸。序列分析结果表明，
该基因编码的氨基酸序列与同属植物乐昌含笑的 HMGR具有 99%的同源性。采用实时荧光定量 PCR 技术检测 McHMGR
在白兰开花过程中四个时期的的表达量变化，结果表明，表达量在盛花期最高，花芽期最低。
关键词：白兰；香气；3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶；实时荧光定量 PCR
基金项目：福建省自然科学基金（2016J01110）；福州市科技计划项目（2015-PT-93）
作者简介：林 浥（1996-），女，本科生，主要从事茶树遗传育种与生物技术研究。
*通讯作者：叶乃兴（1963-），男，教授，主要从事茶学与茉莉资源利用研究。E-mail：ynxtea@126.com。


 5’-3’
McHM GR-F TCCATCAT(A/G)GT(A/G)AT(A/G)CA(G/A)TGAGA
McHMGR-R GA(T/C)GC(A/C)ATGG(G/A)(G/A)ATGAA(C/T)ATGGT
18s-rRNA-F TTAACGAGGATCCATTGGAGGGCA
18s -rRNA-R ACCCAACCCAAAGTCCAACTACGA
McHMGR-RT-F GAAGGGCGTGGTAAA
McHMGR-RT-R GCATTGAAGCCTCCC
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检测 McHMGR在白兰花发育 4个时期的表达量变化情况。结果表明
（图 1），该基因在花芽期表达量最低，随着白兰花的开放程度的增加呈
上调趋势，在大花蕾期间表达量迅速上调，盛花期时达到最高水平。
图 1 McHMGR核酸序列及其推导的氨基酸序列
图 2 McHMGR氨基酸序列的 NJ系统进化树
图 3 白兰花开放过程中 McHMGR基因表达分析
3 讨 论
植物花朵的香气成分是一类具有较低分子量的挥发性分子，主
要由萜类、苯类/苯丙素类、脂肪酸衍生物和一些含氮或硫化合物等组
成[12，13]。植物类异戊二烯包括单萜、倍半萜、二萜等，是一组结构迥异
的化合物家族[14]。HMGR是 MAV途径中第一个关键限速酶。本实验
从白兰花花瓣中克隆得到 McHMGR保守区 cDNA 421bp，编码 128
个氨基酸。McHMGR推导出的氨基酸序列与其同属植物乐昌含笑
（Michelia chapensis）的相似度最高，达 99%，与野生大豆（G.sija Sleb.
et Zucc.）、鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb.）、小羊蒜（Paris fargesii）
相似性分别为 91%、89%、88%。初步判定其为白兰花的 HMGR基因。
通过系统进化树分析表明，其与同属的植物乐昌含笑的 HMGR属于
同一分支，进一步证明该片段为白兰花 HMGR基因的片段。
萜类物质的代谢和植物的生长发育以及形态发生存在一定的相
关性。陈大华认为，特异的 HMGR编码基因成员的表达参与花的发育
[15]。白兰花为“体质花”，在开花前就已经积累了大量的香气前体物质，
在整个开放过程中香气含量都很高且变化幅度很小[16]，本实验通过实
时荧光定量 PCR技术对 McHMGR基因在白兰花开放过程中的相对
表达量动态进行分析，结果表明，该基因在花芽期表达量最低，盛花期
表达量达到最高，随着白兰花的开放程度总体呈上调趋势，但花芽期
与大花蕾期间上调最快，大花蕾期与初花期间基因表达量趋于稳定，
初花期与盛花期间上调幅度较小。这与前人的研究结果一致，证明白
兰花开放的过程中香气的释放和 McHMGR表达量存在一定程度的关
联。McHMGR的基因表达特异性为白兰花窨茶或打底熏制茉莉花茶
不用“养花”提供了分子机制研究依据。郭素枝[17，18]等研究表明，白兰花
初花期香气成分含量最高；而荧光定量结果显示，McHMGR在盛花期
相对表达量最高，在大花蕾期之后持续高表达，这可能与下游的调控
基因萜类合成酶基因的表达量有关，需进一步研究。
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试 验 研 究
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