全 文 ：第 16卷第 6期
2009年 6月 　　　　　　　　　　　　　
现代农业科学
ModernAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　　　
Vol.16No.6
Jun.2009
峨眉山车前草﹑水辣蓼及天名精
RAPD遗传多样性分析
熊莉丽 1 ,王万军 1 ,谭睿 1 ,李迪强 2 ,茆灿泉 1
(1.西南交通大学生物工程学院 ,四川成都 610031;2.中国林业科学院森林生态环境
与保护研究所 ,北京 100091)
摘　要:采用 RAPD分子标记技术对峨眉山保护区不同海拔高度的车前草 、水辣蓼 、天名精野生资
源进行遗传多样性分析。从 24条随机引物中分别筛选得到 5条(车前草)、 3条(水辣蓼)、5条(天名
精)能够产生可重复 DNA片段的随机引物 , PCR扩增片段的多态率分别为 45%、 63.9%、 71%;通过遗
传距离的计算和聚类分析 ,结果表明峨眉山不同海拔高度的车前草 、水辣蓼 、天名精在遗传距离上存在
着一定的差异 , 遗传距离最大的是不同海拔之间的天名精 , 其次是水辣蓼 ,最小的是车前草。笔者对峨
眉山车前草等 3种药用植物的鉴定和资源保护 、利用具有一定的指导意义。
关键词:峨眉山;药用植物;RAPD;遗传多样性
中图分类号:Q311+.3 　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-4650(2009)06-0031-03
PlantagoMt.EmeiHotWaterandTheDayswereFinePolygonum
RAPDAnalysisofGeneticDiversity
XIONGLi-li1 , WANGWan-jun1 , TANRui1 , LIDi-qiang2 , MAOCan-quan1
(1.BiologicalEngineeringColegeofSouthwestJiaotongUniversity, Chengdu, 610031, China;2.ForestResearchandthe
protectionofecologicalenvironmentInstituteofChinaSciencesForestryAcademy, Beijing100091, China)
Abstract:TheuseofRAPDmolecularmarkersfordiferentprotectedareasMt.EmeialtitudePlantago, Polygonumhotwater,
daysofwildresourceswererefinedanalysisofgeneticdiversity.From24randomprimerswerescreenedinfive(Plantago), 3 (Polyg-
onumhotwater), 5 (dayofsperm)toproduceDNAfragmentsre-randomprimers, PCRamplifiedfragmentpolymorphismrate
45%, respectively, 63.9%, 71%;throughgeneticdistancecalculationandclusteranalysis, resultsshowedthatthediferentaltitude
Mt.EmeiPlantago, Polygonumhotwater, daysofprecisioninthegeneticdistancethattherearesomedifferences, geneticthelargest
distancebetweenthediferentelevationoffinedays, followedbyhotwaterPolygonum, thesmallestistheplantain.Theauthorofthe
EmeishanPlantagothreekindsofmedicinalplants, suchastheidentificationandresourceconservation, useofacertainsignificance.
Keywords:Emeishan;medicinalplants;RAPD;geneticdiversity
收稿日期:2009-05-08
资助项目:国家科技部自然科技资源平台子项目 “自然保护区生物标本整理 、整合与共享试点 ”(2005DKA21404)资助
作者简介:熊莉丽(1981-),女 ,云南昆明人 ,研究生 ,研究方向:生物化学与分子生物学
通讯作者:茆灿泉 ,男 ,教授 ,主要从事生物文库和分子进化研究
　　分子生物学的迅速发展和中药现代化进程的加速, SSR、
RFLP、RAPD、AFLP等分子标记技术广泛应用于药用植物的鉴
定及遗传多样性等方面的研究。RAPD以其不受物种、环境 、发
育时期及组织器官等外界因素的限制且操作简单 、迅速 、可靠等
特点,现已被广泛用于植物 DNA指纹图谱的构建、物种亲缘关
系的分析、遗传多样性、进化趋势等方面的研究。
峨眉山位于四川省的中南部 ,是世界文化和自然双遗产
名录成员之一 , 处于多种自然要素的交汇地区 , 生物种类极
为丰富 , 稀有物种繁多 ,有高等植物 3 200多种 ,其中仅产于
峨眉山且在峨眉山首次发现 , 并冠以 “峨眉”名称的植物就
达 100余种 ,是研究世界生物区系等科研活动的重要地点。
在基因指纹和化学指纹等分子水平上 ,对处于峨眉山不同保
护区 、海拔 、生理环境等条件下的药用植物进行遗传多样性
分析 ,是对目前药物植物数据的有力补充 , 并且对于峨眉山
药用植物标本的采集 、资源的保护和利用均具有重要的意义
和价值。
车前草﹑水辣蓼 、天名精是我国传统的民族中药资源 ,
它们在峨眉山保护区不同海拔高度均有分布。 车前草为车
前草科车前草属植物 , 是民间常用草药 , 临床上常用来治疗
淋病﹑肺热咳嗽等症;水辣蓼为蓼科蓼属植物 , 常被作为蓼
蓝的伪品 ,给中药鉴定带来不少困难;天名精为菊科植物 ,是
白族﹑苗族﹑土家族等少数民族供药。 文章在国家科技部
自然科技资源基础条件平台 “自然保护区生物标本整理 、整
合与共享试点”子课题 “民族医药植物标本整理 ”的支持下 ,
以峨眉山保护区不同海拔的车前草 、水辣蓼 、天名精为实验
材料 ,采用 RAPD分子标记技术进行其亲缘关系及遗传多样
性的研究工作 , 在基因指纹水平上对其在不同海拔 、生境条
件下进行区别 、鉴定和分析 ,为自然保护区民族医药标本的
整理和保护提供基础数据 , 为进一步的品种选育 、种植技术 、
真伪品鉴定奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
从峨眉山保护区不同海拔高度(498 m﹑ 984 m﹑
1 358 m)的车前草 、水辣蓼 、天名精幼嫩叶片为实验材料提
取基因组 DNA;植物材料由西南交通大学药学院宋良科副
教授鉴定。
1.2　试剂药品
RAPD10-mer随机引物购自上海生物工程有限公司;
λHindⅢ 、DNAMarker购自北京天根生物有限公司;dNTPs、
DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司;Tris、EDTA、
SDS、巯基乙醇为进口分装;其他试剂为国产分析纯。
DNA提取缓冲液:500 mmol/LNaCl, 100 mmol/LTris-
HCl(pH8.0), 50 mmol/LEDTA(pH8.0), 2%巯基乙醇;
1.3　提取方法
1.3.1　提取程序
药用植物样品 DNA的提取参照 “自然保护区民族药用
植物 DNA提取规范”中改良的 SDS-KAC提取方法 。
1.3.2　基因组 DNA鉴定
用 Eppendorf核酸蛋白定量仪测定 DNA样品在 230nm、
260nm、280 nm、320nm波长处的光吸收值 , 根据 A260值计
算 DNA的浓度 , 根据 A260/A280、A260/A230以及 A320值
确定 DNA的纯度 , 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA样品的完整
性 , 以 A260/A280>1.7, A260/A230>2的无降解的 DNA样
品作为后续 PCR反应的模板。
1.4　基因组 DNA的 RAPD-PCR扩增
1.4.1　PCR反应体系及扩增程序
在 25μLPCR反应体系中加入 10×PCRbufer2.5μL;
dNTPs(2.5mmol/Leach)2.5 μL;模板 (10 ng/μL)1 μL;
引物(2 μmol/L)4 μL;MgCL2(25 mmol/L)2.0 μl;rTaq(5
U/μL)0.15μL;加 ddH2O至 25 μL。采用以下程序:94 ℃5
min;94 ℃1 min, 36 ℃1 min, 72 ℃ 1 min, 45个循环 , 72 ℃延
伸 5 min进行 PCR扩增。
1.4.2　PCR扩增产物检测
取 5 μLPCR产物 1.2%琼脂糖凝胶电泳 , 凝胶成像照
相检测基因组的多态性。
1.5　数据统计分析
按琼脂糖凝胶同一位置上 DNA条带的有无进行统计 ,有
带(包括弱带)记为 “1”,无带记为“ 0”。根据公式 D=1-F计算
任意 2个样本之间的遗传距离, 其中 F=2Nxy/(Nx+Ny), Nxy
是样本 X和样本 YPCR扩增后分子量大小相同的 DNA条带
数 , Nx、Ny分别是样本 X、样本 YPCR扩增产物的 DNA条带总
数 ,采用非加权组算术平均法构建亲缘关系的系统发育树。
2　实验结果
2.1　基因组 DNA完整性鉴定
3个物种不同海拔 8个样品的基因组 DNA经琼脂糖凝
胶电泳检测结果(如图 1)所示 , 8个样品的基因组 DNA在高
分子量区均有 1条清晰的条带 , 无拖尾弥散现象 , 表明所提
的 DNA基本无降解;所提 8个样品的基因组 DNAA260/280
均位于 1.7 ～ 2.0;A260/230大于 2.0, 说明所提取的基因组
DNA质量较好 ,可满足后续 RAPD扩增的实验要求。
图 1　8个样品基因组 DNA凝胶电泳图谱
图 2　不同引物和模板的 RAPD指纹图谱
2.2　RAPD引物的筛选
以车前草为模板 ,从 24条随机引物中筛选出 5条能产
生可重复 DNA片段的引物 ,用于对不同海拔高度车前草的
RAPD扩增 , PCR扩增产生的 DNA片段位于 300 ～ 1 000 bp
之间 ,其中 48条带具有多态性 , 占总扩增带数的 45.7%;筛
选出的 3条随机引物对不同海拔高度的水辣蓼进行 RAPD
扩增 ,产生的 DNA片段位于 200 ～ 1 500 bp之间 , 其中 102
条带具有多态性 ,占总扩增带数的 64.2%;筛选出的 5条随
机引物对不同海拔高度的车前草进行 RAPD扩增 , 产生的
DNA片段位于 200 ～ 1 500 bp之间 , 其中 12条带具有多态
性 ,占总扩增带数的 71%(图 2, 表 1)。
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表 1　不同引物在车前草 、水辣蓼 、天名精上的扩增
物种 引物 序列(5-3) 样本数
总扩增
带数
多态性
带数
多态
率 /%
车前草
S252 TCACCAGCCA 3 18.0 9.0 50.0
S101 GGTCGGAGAA 3 9.0 3.0 33.3
S240 CAGCATGGTC 3 36.0 15.0 41.7
S61 TTCGAGCCAG 3 18.0 9.0 50.0
S121 ACGGATCCTG 3 24.0 12.0 50.0
平均 21.0 9.6 45.7
水辣蓼
S121 ACGGATCCTG 3 84.0 51.0 65.4
S20 GGACCCTTAC 3 51.0 39.0 76.5
S139 CCTCTAGACC 3 24.0 12.0 50.0
平均 53.0 34.0 64.2
天名精
S139 CCTCTAGACC 3 42.0 30.0 71.4
S240 CAGCATGGTC 3 24.0 15.0 62.5
S70 TGTCTGGGTG 3 21.0 15.0 71.4
S101 GGTCGGAGAA 3 18.0 15.0 83.3
S217 CCAACGTCGT 3 18.0 12.0 66.7
平均 24.6 17.4 70.7
2.3　不同海拔车前草 、水辣蓼的聚类分析
在构建了不同海拔车前草和水辣蓼的 RAPD指纹图谱
基础上 ,利用 UPGMA统计分析软件将 3份不同海拔高度的
车前草和水辣蓼的 RAPD标记进行聚类分析(图 3), 参照
(表 2)列出的不同海拔车前草之间的遗传距离可看出 , 位
于海拔高度 984与 1 358 m的车前草的遗传距离最近为 0.
14,其次是海拔 498与 984, 它们之间的遗传距离都在种内遗
传距离范围之内(<0.2);而由水辣蓼不同海拔样本的聚类
分析图可以看出不同海拔之间的水辣蓼之间的遗传距离已经
超过0.2,达到了种间的遗传距离 ,说明峨嵋山自然保护区不
同海拔高度所分布的部分药用植物在遗传背景存在着较大的
差异。
表 2　车前草 、水辣蓼 、天名精各海拔遗传距离
车前草(海拔 /m) 498 984 1358 水辣蓼(海拔 /m) 498 984 1358 天名精(海拔 /m) 498 1358
498 0.00 498 0.00 498 0.00
984 0.15 0.00 984 0.48 0.00 1358 0.52 0.00
1358 0.20 0.14 0.00 1358 0.50 0.58 0.00
图 3　不同海拔高度车前草 、水辣蓼的 RAPD聚类图
3　讨论
高质量的 DNA模板是构建稳定 RAPD反应体系的首要
条件 , 是保证 RAPD反应稳定性和重现性的重要因素之一 ,
本文中的 8个样本的 DNA样品的制备是采用 “自然保护区
民族药用植物 DNA提取规范”中改良的 SDS-KAC提取方
法 , 提取获得的基因组 DNA较为纯净 , 无降解 , 可以满足
RAPD遗传图谱的构建。
遗传距离是评价品种间近缘关系的良好指标 ,本文利用
RAPD分子标记手段对车前草 、水辣蓼 、天名精的 3个不同
海拔高度的样本进行 RAPD分析以便对其亲缘关系进行比
较 , 并结合其形态特征与生理生化指标进行分析。 Thorp认
为不同物种种间的遗传距离 D=0.2 ～ 0.8, 同物种种群间
的遗传距离 D=0.03 ～ 0.2[ 7] 。本文 RAPD分析结果表明 , 3
种不同海拔高度车前草之间的遗传距离位于 0.1 ～ 0.2之
间 , 这符合同物种种群间的遗传距离;但不同海拔高度的水
辣蓼 、天名精之间的遗传距离都已达到种间的遗传距离 , 这
可能与这 2种药用植物在峨嵋山野生资源丰富 ,品种繁多具
有一定的关系 , 它们长期生长在不同的地理区域 ,在逐渐生
长适应各自所处生理环境的过程中 ,遗传物质发生了变化 ,
从而形成了具有不同遗传特点的类型。 由此可以看出植物
的道地性与植物的地理环境存在一定的联系。 聚类分析结
果表明 ,不同海拔高度的车前草 、水辣蓼 、天名精药用资源通
过 RAPD分子标记技术证实其在分析水平上确实存在着一
定的差异 ,这为自然保护区民族医药标本的整理和保护提供
了 RAPD基因指纹关键信息的有效补充。
致谢
感谢本项目受中国林业科学院森林生态环境与保护研
究所肖文发 ,李迪强研究员主持的项目资助。
参考文献
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33　第 6期　　　　　　　　　　　　峨眉山车前草﹑水辣蓼及天名精 RAPD遗传多样性分析