全 文 ：山 东 农 业 科 学 2013，45(6):15 ～ 19 Shandong Agricultural Sciences
收稿日期:2013 －03 －19
基金项目:国家自然科学基金(31101553) ;山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2010SW027) ;山东省良种工程项目
(2011lzgcshucaizy;2012lzgcshucaizy)
* 同等第一作者:叶 帅(1981 －) ，男，硕士研究生，研究方向为植物分子遗传学;王凤德(1979 －) ，男，副研究员，研究方向为植物
分子生物学。
＊＊通讯作者，E － mail:jianweigao3@ yahoo. com
小立碗藓 Ran基因的克隆与表达分析
叶 帅1，2* ，王凤德1* ，张一卉1，李景娟1，李化银1，李利斌1，刘立锋1，朱正歌2，高建伟1＊＊
(1. 山东省农业科学院蔬菜研究所 /山东省设施蔬菜生物学重点实验室 /
国家蔬菜改良中心山东分中心，山东 济南 250100;
2. 河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050016)
摘 要:Ran 是一种大量分布于细胞核内的小分子的 GTP 酶，在核质运输过程中具有十分重要的作用，
参与调控细胞分裂及其信号传导。本研究利用基于同源序列的 PCR技术，从小立碗藓(Physcomitrella patens)
中成功克隆了 PpRan基因的开放阅读框(ORF)序列，并对其编码的氨基酸序列进行了相关分析。利用半定
量 PCR技术对 PpRan基因在不同组织中以及受到缺磷胁迫时的表达研究发现，PpRan 基因的表达具有组织
特异性，茎叶体和原丝体中表达量较高，假根中表达量比较低;PpRan 基因受缺磷胁迫诱导表达，随着胁迫时
间的延长表达量越来越高。这些结果表明，PpRan基因可能在小立碗藓响应缺磷胁迫时发挥重要作用。
关键词:小立碗藓;PpRan基因;基因克隆;表达分析
中图分类号:Q78 文献标识号:A 文章编号:1001 －4942(2013)06 －0015 －05
Cloning and Expression Analysis of PpRan Gene
in Physcomitrella patens
Ye Shuai1，2* ，Wang FengDe1* ，Zhang YiHui1，Li JingJuan1，Li HuaYin1，
Li LiBin1，Liu LiFeng1，Zhu ZhengGe2，Gao JianWei1＊＊
(1. Vegetable Research Institute，Shandong Academy of Agricultural Sciences /
Shandong Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables /Shandong Branch of National Vegetable Center，
Jinan 250100，China;2. College of Life Science，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050016，China )
Abstract Ran is a small molecule GTPase widely distributed in nucleus，and plays important roles in
the process of nucleoplasm transport. In addition，Ran has the functions of regulating cell division and related
signal transduction. In this study，the ORF of PpRan was cloned and the sequence of PpRan gene was ana-
lyzed by bioinformatics tools. The expression patterns of PpRan in different tissues and under phosphorus defi-
ciency were studied by semi － quantitative PCR. The results indicated that the expression of PpRan gene
showed a tissue － specific expression pattern with higher expressing level in protonema and cormophyte than in
rhizoids. Additionally，the longer time subjected to phosphorus deficiency，the higher mRNA levels of PpRan
gene was detected in P. patens. These results suggested that PpRan gene might play important roles in re-
sponse to phosphorus deficiency in P. patens.
Key words Physcomitrella patens;PpRan gene;Gene clone;Expression analysis
磷是植物生长所必须的矿质元素，缺磷常导 致植物的分枝比正常植株少，茎、根纤细，植株矮
DOI:10.14083/j.issn.1001-4942.2013.06.001
小，花果容易脱落等。但土壤中的磷一般不能满
足农作物生长发育的需要，必须通过施肥来补充，
这无疑增加了作物种植的成本，也存在破坏生态
环境的风险。因此，如能克隆与缺磷胁迫耐性相
关的基因，并通过基因工程手段改良作物将对农
作物经济效益和生态环境都具有重要的作用。
GTP结合蛋白(GTP － binding protein)也叫 G
蛋白，广泛存在于生物界，在细胞信号传导中起着
极为重要的作用。低分子量 GTP 结合蛋白的相
对分子量通常在 20 ～ 30 kD 之间，根据分子量大
小可以划分为 Ras、Rap、Seg、Arf 等七种不同的亚
类［1］。其中 Ran(Ras － related nuclear)也称为
TC4
［1］，在动物中参与调控细胞周期中各个时期
的生命活动，如:调控核运输、启动细胞分裂、DNA
复制、RNA的转录和加工(或修饰)、有丝分裂和
减数分裂的开始和结束的控制、纺锤体的组装、染
色体的正确分配、核膜破裂和重组等。但到目前
为止，关于 Ran蛋白参与调控植物逆境胁迫反应
的研究鲜有报道，尤其是对缺磷胁迫的耐性。
苔藓植物是自然界的拓荒者之一，能生活于
沙碛、荒漠、冻原地带及裸露的石面或新断裂的岩
层上，这种生活的特性可能与其本身的分子调控
机制相关。因此，本研究以小立碗藓(Physcomi-
trella patens)为材料，对其 Ran基因进行了克隆和
相关表达模式的研究，不仅为了解 Ran 蛋白的生
物学功能奠定了基础，也为植物的抗逆育种提供
了理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
小立碗藓由德国 Ralf Reski 教授惠赠。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 PpRan 基因 cDNA 编码序列的克隆 利
用 Trizol 法提取小立碗藓总 RNA，采用上海申能
博彩生物科技有限公司的反转录试剂盒反转录合
成 cDNA 第一条链。利用 NCBI 上公布的小麦、
水稻及拟南芥 Ran 基因的 EST序列，通过 BLAST
比对找出小立碗藓中同源的 EST 并进行拼接，找
出 PpRan的 ORF，设计特异性引物分别为 PpRan －
F:5 － ATGGCATTGCCCGGGCAGCAGACTCC － 3
和 PpRan － R:5 － CTAGCTGTCAAAGGCGT-
CATCGTCGT － 3。以小立碗藓反转录产物为模
板进行 PCR 扩增。扩增产物连 pGEM － T easy
vector System后测序验证。
1. 2. 2 序列比对和系统进化树分析 利用 DNA-
MAN 软件，对不同物种(小麦:Triticum aestivum，
AAL30396. 1;水稻:Oryza sativa Japanica Group，
NP_ 001043550. 1;拟南芥:Arabidopsis thaliana，
AAN31865. 1;酿酒酵母:Saccharomyces cerevisiae
S228C，NP_014828. 1;果蝇:Drosophila yakuba，XP_
002100902. 1;小家鼠:Mus musculus，NP_033417;
人 Homo sapiens:NP_006316. 1)来源的 Ran 蛋白
进行氨基酸多序列比对分析，采用默认参数设置。
使用MEGA 4. 0 对不同物种中的 Ran蛋白做系统
进化分析，采用 Bootstrap Test － Neighbor Joining
方法，重复 500 次运算。
1. 2. 3 PpRan基因在不同组织中的表达模式分
析 用 Trizol法分别提取小立碗藓茎叶体、假根、
原丝体组织的总 RNA，反转录。分别以茎叶体、
假根、原丝体的反转录产物为模板，利用 PpRan －
F /R引物 PCR扩增 PpRan基因，琼脂糖凝胶电泳
检测不同组织 PpRan 基因的表达水平。以小立
碗藓 Actin基因(AW698983)作为内参，扩增引物
为:PpActin － F:5 － CGGAGAGGAAGTACAGTGT-
GTGGA － 3和 PpActin － R:5 － CTGGGCTCAAT-
TCTAACGGCTGGT －3。
1. 2. 4 小立碗藓受缺磷胁迫时 PpRan 基因的表
达模式分析 将小立碗藓植株在不加入磷元素的
固体培养基(培养基中的 KH2PO4 用等量的 KCl
代替)中培养，进行缺磷处理，以正常培养基培养
的小立碗藓作为对照。在处理后第 1、2、4、7、9 天
取小立碗藓假根，用 Trizol 法提取小立碗藓假根
RNA，反转录成 cDNA。利用 PpRan － F /R 引物
PCR扩增 PpRan基因，琼脂糖凝胶电泳检测不同
处理时期 PpRan 基因的表达水平。并以小立碗
藓 Actin基因作为内参，扩增引物同 1. 2. 3。
2 结果与分析
2. 1 PpRan基因编码区克隆及分析
经 PCR 扩增得到约为 700 bp 的 DNA 片段
(图 1) ，将其命名为 PpRan。经测序，PpRan ORF
大小为 672 bp，预测编码 223 个氨基酸。将预测
61 山 东 农 业 科 学 第 45 卷
的氨基酸序列提交 NCBI 保守域数据库进行比
对，发现有 5 个 Ras类 GTP 结合蛋白共有的保守
区域(图 2) ，这些区域是 GTP 及其辅助因子结合
的区域。其中，“GDGGTGKT”与 GXXXXGK(S /
T)功能区相对应，是磷酸结合位点;“YEP-
TIGVEV”为 Effector Loop 区域;“WDTAGQE”区
域负责结合 GFP 的 τ －磷酸;“NKVD”与 NKXD
功能结构域相对应，对鸟嘌呤有特异的介导作用;
“EISA”与 FMETSA区域相对应，可与 NKXD区域
的 D残基发生相互作用。
M:DL2000;1:PCR扩增产物
图 1 PpRan基因的 PCR扩增
注:方框内为保守结构域。
图 2 PpRan cDNA编码序列及预测的氨基酸序列
同源比对分析结果表明，PpRan 编码的氨基
酸序列与拟南芥、水稻、小麦、酿酒酵母、人的相似
性分别达到了 89%、87%、86%、73%、71% (图
3)。在进化上与植物Ran蛋白具有更高的亲缘
图 3 不同来源的 Ran － like蛋白的氨基酸序列比对
71第 6 期 叶 帅等:小立碗藓 Ran基因的克隆与表达分析
关系(图 4)。在动物中，Ran 蛋白的 C 末端缺乏
一个作为异戊二烯化受体位点的半胱氨酸残基，
拥有一个酸性的 C 末端序列 DEDDDL，而植物中
的 C 末端保守序列为 DDDDDL，小立碗藓是比较
低等的植物，在进化上仅仅高于藻类，低于蕨类植
物，其 C 末端保守序列与高等植物存在差异，为
DDDDDA。
图 4 PpRan与不同来源的 Ran － like蛋白
的聚类分析
2. 2 PpRan基因的表达模式分析
半定量 RT － PCR分析发现，PpRan 基因在茎
叶体中的表达量最高，其次是在原丝体中，在假根
中表达量很低(图 5A)。因此，PpRan基因的表达
具有组织特异性。
由图 5B可以看出，受缺磷胁迫时 PpRan 基
因表达量有所上升，并且随着缺磷胁迫时间的延
长，表达量越来越高，但处理后第 7 天和第 9 天没
有明显变化，说明表达量维持在此水平。
A:PpRan基因在小立碗藓不同组织中的表达模式，其中泳道
1 为假根，泳道 2 为茎叶体，泳道 3 为原丝体;B:PpRan 基因对缺
磷的响应，其中泳道 1 为对照，泳道 2 ～ 6 分别为缺磷处理后 1、2、
4、7、9 天 PpRan的表达
图 5 PpRan基因表达模式分析
3 讨论
本研究克隆了小立碗藓 Ran 基因并对其序
列进行测定，利用分子生物学分析软件和网络资
源对测序结果进行分析，并根据基因序列和结构
对其功能进行了预测。PpRan蛋白与其它植物有
很高的同源性，属于植物 Ran 蛋白家族的一个成
员。Ran是 Ras 蛋白的一个亚类，具有 Ras 蛋白
的共同特点，所有的 Ras 蛋白都有相似的结构
域［2］:N端 1 ～ 165 氨基酸是 Ras 蛋白功能结构
域，负责结合、水解 GTP;不同种类的 Ras 蛋白之
间的差异主要发生在 166 ～ 185 氨基酸残基区域;
Ras蛋白的 C端有 4个氨基酸残基组成的CAAX －
BOX，其中 C为半胱氨酸 Cys，A 代表任何一种脂
族氨基酸，CAAX － BOX 使 Ras 蛋白吸附在膜上，
而与膜结合是 Ras 蛋白实现其生理功能所必须
的。本实验从小立碗藓中克隆得到的编码低分子
量 GTP结合蛋白的 PpRan基因，其编码的氨基酸
序列 C端没有 4 个氨基酸残基组成的 CAAX －
BOX，而是一段呈酸性的序列“PLPDDDDDA”，这
与大多数 Ras蛋白的特点不同，可能是 PpRan 蛋
白为核蛋白，与拟南芥［3］、烟草［4］、马铃薯［5］的
Ran蛋白相同，都是可溶的，存在于细胞质和细胞
核中，不需要锚定在膜上。
本实验对小立碗藓不同组织中的 PpRan 基
因的表达情况做了研究，发现在茎叶体中表达量
最高，在原丝体组织中的表达量次之，假根中表达
量最低，说明 PpRan在小立碗藓中的表达具有组
织特异性。可能茎叶体是小立碗藓最成熟、光合
作用等发生的部分，因此表达量较高;原丝体是二
维状态的小立碗藓组织，只是小立碗藓发育的一
个过渡阶段，因此表达量较茎叶体次之;假根不是
传统意义上的根，可能生活力较弱，表达量最低。
在缺磷条件下，增强低浓度有效磷吸收能力是植
物抵抗非生物胁迫所采取的一种适应机制，而这
一机制的实现需要高亲和力 Pi 转运子的高效表
达。李玉京等［6］认为在缺磷条件下植物对 PO3 －4
吸收能力的增强信号，可能来自于植物体内 PO3 －4
浓度的变化。我们推测 PpRan蛋白也可能参与了
这一信号的传导。Bun － ya 等［7］在酿酒酵母
S. cerevisae中，分离到编码小 G 蛋白的 Gtr1 基因，
该基因不仅参与调控酵母细胞分裂、生长的信号传
导，而且和 PH084 Pi转运子共同参与对 Pi的吸收。
本实验对小立碗藓进行缺磷处理，半定量 PCR 发
现，小立碗藓假根中 PpRan基因的表达量随着磷缺
乏时间的延长而升高，这表明 PpRan基因受缺磷胁
迫的诱导，推测其可能在小立碗藓对缺磷胁迫应激
反应中起着重要的作用。本实验结果与高建伟［8］
81 山 东 农 业 科 学 第 45 卷
对蓝粒小麦 Ta － Ran 1 的磷饥饿胁迫的诱导表达
结果一致。由于小立碗藓在进化上低于小麦，本实
验结果也说明了 Ran － like基因在低等植物里也显
示出在高等植物中相似的功能。
小立碗藓 PpRan 全长 cDNA编码序列的获得
以及该基因在不同组织和在非生物胁迫条件下的
表达特性研究结果，为进一步研究其在非生物胁迫
应答基因网络中的调控模式奠定了基础。PpRan
基因编码蛋白的生物学功能还需进一步的研究。
参 考 文 献:
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