全 文 ：第 29 卷第 4 期 齐 齐 哈 尔 大 学 学 报 Vol.29,No.4
2013 年 7 月 Journal of Qiqihar University July,2013
毛尖紫萼藓 1-半胱氨酸过氧化物酶基因 GpPER1
的克隆、表达载体构建及序列分析
安洪雪，沙伟，张梅娟，刘博，宋璐
（齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

摘要：从本实验室已成功构建的毛尖紫萼藓干旱 cDNA 文库中获得一条与抗旱相关的基因，即 1-半胱氨酸过氧化
物酶（1-Cys peroxiredoxins）基因，简称 GpPER1，GenBank 登录号为 GU989314，该基因全长 1 040 bp，开放阅读
框（ORF）为 666 bp，编码 221 个氨基酸。根据 GpPER1 基因的开放阅读框设计特异性引物，通过 RT-PCR 技术
扩增得到 GpPER1 基因片段，并成功构建了表达载体 pRI 101-GpPER1，为进一步在分子水平上研究毛尖紫萼藓
的耐旱机制，发现并利用植物的抗逆基因奠定了基础。
关键词：毛尖紫萼藓；半胱氨酸过氧化物酶（PER1）基因；抗氧化蛋白；植物表达载体
中图分类号：Q343.1 文献标志码：A 文章编号：1007-984X(2013)04-0001-04

抗氧化蛋白（Peroxiredoxins，Prx）是一类过氧化物酶，属于抗氧化蛋白超家族，广泛存在于动物、植
物、微生物中。高等真核生物的同源基因在低等真核生物中仍具有功能，这显示该家族基因在进化上的保
守性[1]。与其它的过氧化物酶不同，它缺少催化反应通常所需的含金属离子的辅基，而具有 1，2 个保守的
Cys 可以替代金属离子辅基的功能，参与体内各种过氧化物的清除反应，以提高植物的抗逆性。有研究表
明，Prx 不仅具有清除活性氧族（ROS）的功能，可能也参与细胞增殖、凋亡和细胞内信号转导等过程[2]。
该家族包括 6 个成员：PrxⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ。Prx 家族所有蛋白均在 N 端具有保守的 Cys 残基，而
有的蛋白在 C 端也具有保守的 Cys 残基[3]，根据其 Cys 残基数目的不同，可将其分为 2 个亚家族，即 1-Cys
Prx 和 2-Cys Prx。1-Cys Prx 是 Prx Ⅵ，它只有一个高度保守的半胱氨酸残基，其中间的电子供体可能是
小分子物质，如二硫苏糖醇[4]。
毛尖紫萼藓（Grimmia pilifera）属于苔藓植物门（Bryophyta）藓纲（Musci），紫萼藓科（Grimmiaceae）
紫萼藓属（Grimmia），植物体多深绿色或者紫黑色，生长于干旱的岩石表面，久旱而不丧失活力，毛尖紫
萼藓是广泛分布于我国南北各省的耐旱藓类，在群落、形态结构和生理上都具有明显适应干早生态环境的
特征，是研究藓类植物耐旱生理和耐旱分子机制的最好材料。
1 材料与方法
1.1 实验材料与处理
毛尖紫萼藓采集于五大连池石龙地区，挑取长势较好的毛尖紫萼藓，用自来水清洗干净，对其进行复
水培养 1~2 周，趋于正常生长状态后停止浇水，待完全干旱，取其茎尖部位液氮速冻并立即放入-80℃保
存备用。
1.2 菌株、载体及主要试剂
Taq酶、限制性内切酶购自promega公司；pMD 18-T Simple Vector、DNA Marker购自大连宝生物；M-MLV
逆转录酶、dNTP、购自 Invitrogen 公司；Amp、IPTG、X-Gal 购自上海生工；大肠杆菌 DH5α、农杆菌 EHA105、
植物表达载体 pRI 101-AN 均为本实验室保存。

收稿日期：2013-03-15
基金项目：国家自然科学基金资助（31070180，31270254）
作者简介：安洪雪（1986），女，吉林省德惠人，在读硕士研究生，主要从事苔藓植物遗传学和分子生物学研究，swx0414ahx@126.com。

·2· 齐 齐 哈 尔 大 学 学 报 2013 年
1.3 总 RNA的提取和纯化及反转录 cDNA的获得
采用改良的 SDS 法[5]提取毛尖紫萼藓总 RNA，用 1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，用 RNase-Free
Dnase 去除 RNA 中的 DNA 模板，根据 M-MLV 逆转录酶说明书进行 cDNA 第一链的合成。
1.4 GpPER1 基因的克隆
以通过 RACE 获得的 GpPER1 基因全长序列为模板，用 Primer 5.0 软件对其开放阅读框设计引物，上
游引物：5′-GCGTCGACGAAGCGTTTGAGGAAGGTTAG-3′（下划线表示加入酶切位点 SalⅠ），下游引物：
5′-CGCGGATCCGCCTAATCCACGAAGGTCAT-3′（下划线表示加入酶切位点 BamHⅠ），以反转录 cDNA 为
模板，进行 PCR 扩增。反应程序为：94℃ 5 min，94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ l min，35 个循环，72℃ 10 min。
经 1％琼脂糖凝胶电泳检测产物大小，利用胶回收试剂盒将 PCR 产物进行回收，并将回收产物与 pMD 18-T
Simple Vector 16℃连接过夜，获得重组载体 pMD-GpPER1。将重组质粒转化到大肠杆菌 DH5α 中，利用蓝
白斑筛选挑取阳性克隆进行摇菌，将菌液送至北京六合华大基因测序。
1.5 pRI 101- GpPER1 重组表达载体构建
采用碱裂解法提取 pMD-GpPER1 和 pRI 101-AN 质粒，用限制性内切酶 SalⅠ和 BamHⅠ分别对两种质
粒进行双酶切，回收 PER1 目的片段和 pRI 101-AN 载体大片段，然后利用 T4 DNA 连接酶连接，连接产物
转化大肠杆菌 DH5α 感受态，转化产物提取质粒，采用双酶切和 PCR 进行重组质粒鉴定。
1.6 pRI 101- GpPER1 重组表达载体转化根癌农杆菌
提取质粒，冻融法转化根癌农杆菌 EHA105，为通过叶盘转化法将 pRI 101- GpPER1 重组表达载体导
入烟草叶片做好准备。
1.7 GpPER1 基因的生物信息学分析
利用在线分析软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）预测基因的开放阅读框，利用
（http://web.expasy.org/protparam/）网站分析 GpPER1 基因所编码氨基酸序列的理化性质，运用 ProtScale 工
具（http://ca.expasy.org/tools/protscale.html）对蛋白质的亲属水性进行分析，通过 NCBI 的 CDD 数据库
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测 GpPER1 蛋白的保守区域，蛋白质立体结构预测
采用 SWISS-MODEL（http://swissmodel.expay.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1）。采用 NCBI
中的 blast X 进行序列同源性比对，并用 MEGA5 软件构件系统进化树。
2 结果与分析
2.1 毛尖紫萼藓总RNA的检测
采用改良的 SDS 法提取毛尖紫萼藓总 RNA，用 RNase-Free Dnase 消化
RNA 中的 DNA，经核酸检测仪检测，其 OD260/ OD280的比值为 1.95，在 1.8~2.0
之间，说明没有蛋白质污染，且 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，28S RNA
的亮度约为 l8S RNA 的 2 倍（图 1），说明所提的 RNA 质量很好，可用于反
转录试验。
2.2 GpPER1 基因的克隆
以毛尖紫萼藓反转录 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增，得到一条长度约为 700 bp 左右的特异性条带（图
2），与预期的目的片段大小相符。回收该特异性条带，并与 pMD 18-T Simple Vector 连接，挑取阳性克隆
并进行测序，测序结果表明，该基因序列与
GenBank 中已经登录的 GpPER1 基因序列相一
致。
2.3 重组载体 pRI 101- GpPER1 的构建
用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别双酶切
pMD-GpPER1和pRI 101-AN质粒，pMD-GpPER1
质粒经双酶切后得到大小约为 700 bp 左右条带
（图 3），回收此条带与经过相同酶切后的 pRI

纯化前 RNA 纯化后 RNA
A B
图 1 毛尖紫萼藓总 RNA 的电泳图

图 2 GpPER1 基因 RT-PCR 扩增产物

图 3 pMD -GpPER1 质粒的酶切

第 4 期 毛尖紫萼藓 1-半胱氨酸过氧化物酶基因 GpPER1 的克隆、表达载体构建及序列分析 ·3·
101-AN 质粒大片段连接，得到表达载体 pRI-GpPER1；用限制性内切酶 Sal
Ⅰ和 BamHⅠ双酶切 pRI-GpPER1，经电泳检测得到与预期大小一致的约 700
bp 的酶切片段（图 4），表明表达载体 pRI-GpPER1 构建成功。
2.4 半胱氨酸过氧化物酶基因 GpPER1 的序列分析
GpPER1 基因序列全长 1040 bp，ORF 长 666 bp，编码 221 个氨基酸，5′
非编码区（UTR）长 106 bp，3′非编码区（UTR）长 268 bp，GenBank 登录号
为 GU989314。ExPASy Proteomics Server 预测该蛋白推测 GpPER1 的分子式
为 C1095H1706N292O325S5，分子量为 24.3 kD，理论等电点为 5.68，此类蛋白为酸
性蛋白。负电荷残基（AsP+Glu）总数为 28 个，正电荷残基（Arg+Lys）总数
为 23 个。不稳定系数是 37.82，为稳定的蛋白质，脂肪系数为 86.02。
用 ProtScale 工具进行蛋白的亲疏水性，结果显
示（图 5）：MIN: -2.511，MAX: 1.711，为亲水性蛋
白。利用 NCBI 中的 CDD（Conserved Domain
database）数据库对 GpPER1 基因编码的蛋白进行预
测，结果显示与其匹配的蛋白保守区共 3 个（图 6），
均属于硫氧还原蛋白超家族（Thioredoxin_like
superfamily）。对 GpPER1 基因编码蛋白的二级结构
进行预测，结果表明该蛋白的二级结构中 α-螺旋结
构占 27.15%；β-折叠占 23.08%；无规则卷曲占
49.77%。由 SWISS- MODEL Workspace 在线分析软
件建立 GpPER1 三维结构模型（图 7），以沙柳中过
氧化物酶为模板，在第 4~220 位氨基酸建模，序列
相似度为 50.92 %，E 值为 0。

图 6 GpPER1 基因氨基酸序列保守区预测
通过 Blast X 比对分析，GpPER1 基因与其他物种的 1-Cys
peroxiredoxins 序列具有很高的相似性，从中选取 Physcomitrella patens
（小立碗藓）、Syntrichia ruralis（山赤藓）、Glycine max（大豆）、
Medicago truncatula（蒺藜苜蓿）、Vitis vinifera（葡萄）、Xerophyta viscosa
（维柯萨）、Populus trichocarpa（毛果杨）、Fagopyrum tataricum（鞑
靼荞麦）、Elaeis guineensis（油棕）、Hordeum vulgare（大麦）、Triticum
aestivum（小麦）、Oryza sativa（水稻）、Arabidopsis thaliana（拟南芥）、
Brachypodium distachyon（二穗短柄草）、Sorghum bicolor（高粱）、Zea
mays（玉米）16 种植物构建系统发育树。Blast X 比对结果显示 GpPER1
基 因 所 编 码 的 氨 基 酸 序 列 与 syntrichia ruralis （ 山 赤 藓 ） 和
physcomitrella patens（小立碗藓）的同源性最高，均为 91%，系统发
育树结果显示（如图 8），可形成二个分支，毛尖紫萼藓 PER1 与山赤藓的 PER1 亲缘关系最近并与小立碗
藓聚为一类，而其它的植物形成一个大的分支。

图 4 pRI-GpPER1 质粒的酶切鉴定
50 100 150 200
Position
图 5 GpPER1 蛋白的疏水性预测图
So
ore

2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
-3.0
图 7 预测的 GpPER1 蛋白三维结构

·4· 齐 齐 哈 尔 大 学 学 报 2013 年

3 结束语
抗氧化蛋白（Prx）是广泛存在于所有生物体中的一类过氧化物酶，植物 Prx 作为抗氧化剂，其催化活
性与其它抗氧化剂完全不同，除了在活性氧清除中具有重要作用以外，还具有其它多种功能[6-7]。如参与细
胞增殖、凋亡和细胞内信号转导等过程[8]。转柽柳 Prx1 基因的酵母细胞在 NaCl、KCl、NaHCO3、山梨醇、
低温、高温及甲基紫精的胁迫下，存活率比转空载体的酵母明显提高，证实了柽柳 Prx1 基因具有多重的抗
逆能力[9]。1-Cys Prx 仅含有一个保守的 Cys，植物 1-Cys Prx 首次发现是在大麦中被鉴定的，称为 Per1。
最初认为它的功能是作为休眠调节子和抗氧化剂，在种子发育的晚期和早期的吸胀吸水过程中保护胚和糊
粉层细胞免受氧化损伤[10]。2000 年，Lee 等人将水稻 Per1 基因在烟草中过量表达，结果发现：转基因植株
和对照植株的萌发效率相似，但是抗氧化能力却显著增加，表明 Per1 基因主要作为抗氧化剂来起作用[11]。
2002 年，Mowia 等在一种复苏植物维柯萨（Xerophyta Viscose Baker）中分离了 XvPer1 基因，与以前的 1-Cys
Prx 只在种子中表达不同，XvPer1 还可在脱水、热激、高温、ABA、NaCl 等非生物胁迫情况下在营养组织
中表达[12]。
本研究从毛尖紫萼藓干旱材料中成功扩增了 PER1 基因，通过对测序结果的分析表明，该基因 ORF
长 666 bp，编码 221 个氨基酸，对其所编码的蛋白进行了生物信息学分析，且成功构建了表达载体 pRI 101-
GpPER1，为进一步研究该基因的功能，以及在模式植物中的表达奠定基础。
参考文献
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Chemistry，2002，227(28)：25 370-25 376.
（下转第 9 页）
Hordeum vulgare
Triticum aestivum
Brachypodium distachyon
Zea mays
Sorghum bicolor
Oryza sativa
Arabidopsis thaliana
Xerophyta viscosa
Vitis vinifera
Glycine max
Medicago truncatula
Fagopyrum tataricum
Elaeis guineensis
Populus trichocarpa
Physcomitrella patens
Grimmia pilifera
Syntrichia ruralis
图 8 PER1 基因编码蛋白的系统进化树

第 4 期 毛尖紫萼藓 GpPOD 基因克隆及其表达载体的构建 ·9·
connected it with pMD-18T simple Vetcor to construct cloning vector pMD18T-GpPOD. It was inserted into
expression vector PRI101-AN for constructing expression vector PRI101-GpPOD, and recombinant plasmid was
carried into Agrobacterium tumefaciens EHA105. The DNA sequencing result of recombinant plasmid
pMD18T-GpPOD、PRI101-GpPOD had 99% similarity with the original sequence, which indicated that GpPOD
gene was connected to clone vector pMDl8-T successfully and had been cloned into expression vector PRI101-AN;
There were bands appeared at about 581 bp in electrophoregram of PCR of Agrobacterium transformer，indicating
that PRI101-GpPOD had been introduced into Agrobacterium tumefaciens.The experimental provided an essential
basis for genetic transformation of Grimmia pilifera GpPOD gene.
Key words：Grimmia pilifera；GpPOD；clone vector；expression vector；Agrobacterium tumefaciens EHA105
（上接第4页）
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Cloning, expression vector construction of GpPER1 gene from Grimmia pilifera
and its sequence analysis
AN Hong-xue，SHA Wei，ZHANG Mei-juan，LIU Bo，SONG Lu
（College of Life Sciences and Agriculture and Forestry，Qiqihar University，Heilongjiang Qiqihar 161006，China）

Abstract：A drought-restance relative gene was cloned from a drought cDNA library of Grimmia pilifera，namely
1-Cys peroxiredoxins gene or GpPER1，GenBank login number is GU989314，The full cDNA length of GpPER1 is
1040 bp，The ORF is 666 bp，encoding 221 amino acid. PCR primer were designed according to the ORF of
GpPER1，using RT-PCR method，we amplified GpPER1 gene sequence and construct the expression plasmid pRI
101-GpPER1，for further exploring drought resistant mechanisms of Grimmia pilifera in molecular level，and laid a
foundation for finding and exploitation of resistant genes from stress-tolerant plant.
Key words：Grimmia pilifera；1-Cys peroxiredoxins (PER1) gene；peroxiredoxin；plant expression plasmid