全 文 ：第 33 卷 第 2 期
2015 年 3 月
食 品 科 学 技 术 学 报
Journal of Food Science and Technology
Vol. 33 No． 2
Mar． 2015
doi:10． 3969 / j． issn． 2095-6002． 2015． 02． 008 文章编号:2095-6002(2015)02-0042-06
引用格式:李小波，樊琛，龙立梅，等． 山黧豆中 β-ODAP及其他氨基酸的提取和 HPLC分析［J］． 食品科学技术学报，2015，33
(2) :42 － 47．
LI Xiaobo，FAN Chen，LONG Limei，et al． Extraction and HPLC analysis of β-ODAP and other amino acids in Lathyrus
Sativus［J］． Journal of Food Science and Technology，2015，33(2) :42 － 47．
山黧豆中 β-ODAP及其他氨基酸的提取和 HPLC分析
李小波1， 樊 琛1， 龙立梅1， 李 柰1， 曹学丽1，* ， 李雪帆2， 牛晓峰2， 贾 平2
(1．北京工商大学 食品学院 /食品添加剂与配料北京高校工程研究中心 /食品质量与安全北京实验室，
北京 100048;2．太原六味斋实业有限公司，山西 太原 030401)
摘 要:利用氯甲酸对硝基卞酯(PNZ-Cl)作为柱前衍生化试剂，建立了山黧豆中神经毒素 β-N-草
酰基-L-α，β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-α，β-diaminopropionic，β-ODAP)及其他游离氨基酸的同时分析
法。HPLC法为色谱柱 Ultimate XB－C18，流动相乙腈和乙酸－乙酸钠缓冲溶液(pH值 = 4. 6) ，梯度
洗脱程序 0 ～ 5 minφ(乙腈)25%，5 ～ 30 minφ(乙腈)25% ～ 90%，流速 0. 8 mL /min，柱温 30 ℃，检
测波长 300 nm。利用该方法对山黧豆中 β-ODAP及其他游离氨基酸的提取条件中乙醇体积分数、
山黧豆粉的质量浓度(ρ(山黧豆粉) )、提取温度等进行了优化。结果表明，在 φ(乙醇)为 10%，
ρ(山黧豆粉)为 0. 025 g /mL，提取温度为 60 ℃时，提取效率较高。
关键词:山黧豆;β-N-草酰基-L-α，β-二氨基丙酸;氨基酸
中图分类号:TS207. 3 文献标志码:A
收稿日期:2014-09-12
基金项目:农业部公益性行业(农业)科研专项(201303069－04) ;北京工商大学研究生科研学术创新基金项目。
作者简介:李小波，女，硕士研究生，研究方向为生物分离工程;
* 曹学丽，女，教授，博士，主要从事生物分离和分析方面的研究。通信作者。
山黧豆(Lathyrus sativus Linn．) ，又名马牙豆、家
山黧豆、山棱豆、栽培香豌豆，木兰纲(Magnoliopsi-
da)蔷薇亚纲(Ｒosidae)豆目(Fabales)蝶形花科
(Fabaceae)野豌豆族(Trib． Vicieae)山黧豆属(La-
thyrus) ，一年生作物［1 － 3］。由于其具有耐寒、抗旱、
抗虫害、固氮肥沃土壤以及低成本高产的特性，在我
国东北、西北、华北等地区大面积种植［4］。山黧豆
籽实中含有丰富的蛋白质和氨基酸，但也含有一种
非蛋白质氨基酸，这种氨基酸含两种同分异构体，一
种是 β-N-草酰基-L-α，β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-α，
β-diaminopropionic，β-ODAP) ，是一种神经毒素，长
期食用可引起下肢瘫痪，称为山黧豆中毒［5 － 8］，由于
这种氨基酸的存在妨碍了山黧豆的推广和种植;另
一种是 α-N-草酰基-L-α，β-二氨基丙(α-N-oxalyl-α，
β-diaminopropionic，α-ODAP) ，无毒性［9 － 10］。研究报
道，β-ODAP在种子中的含量变异很大，所以人们一
直致力于选育低毒或无毒品种，因而神经毒素 β-
ODAP含量分析方法颇受关注［11］。鉴于此，本工作
拟利用 β-ODAP 与其他游离氨基酸性质相近的特
点，应用柱前衍生化高效液相色谱 －紫外检测法
(HPLC-UV)进行定性和定量分析，为山黧豆这一新
型食物资源的进一步研究开发提供实验依据。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
山黧豆，山西太原六味斋实业有限公司;β-
ODAP标样(纯度 ＞ 98%) ，成都瑞芬思生物科技有
限公司;氨基酸混合标样(纯度 ＞ 99%)和对硝基氯
甲酸苄酯(4-nitrobenzyl chloroformate，PNZ-Cl) ，美国
Sigma公司;甲醇、乙腈均为色谱纯。
1. 2 仪器与设备
Agilent 1100 型高效液相色谱系统(配有可变波
24
长紫外检测器和 Ｒev． A． 09． 03 色谱工作站) ，美国
安捷伦科技有限公司;超纯泵机，北京德泉兴业商贸
有限公司;PHS －3D 型 pH 计，上海三信仪表厂;溶
剂过滤器，北京江海科仪科技有限公司;KQ5200DE
型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;
SHB－B95 型循环水式多用途真空泵，郑州长城科工
贸有限公司;分析天平，Sartorius 公司;4K15 型离心
机，美国 Sigma公司;F500AG型高速多功能粉碎机，
北京汇海科仪仪器有限公司。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 样品处理
根据参数文献［12］进行样品前处理。将山黧
豆磨碎，过 40 目筛。准确称取 1 g 山黧豆粉，加入
40 mL提取溶剂，φ(乙醇)为 10%，控制提取温度为
60 ℃，ρ(山黧豆粉)= 0. 025 g /mL (m(山黧豆粉)∶
V(提取溶剂)= 1 g∶ 40 mL) ，超声波处理 1 h，静置一
晚，在 4 000 r /min离心 15 min，取上清提取液，将提
取液保存于 4 ℃。
1. 3. 2 标准溶液和样品衍生化
吸取 25 μL 17 种氨基酸混合标样溶液，25 μL ρ
(β-ODAP)= 0. 5 mg /mL 标样溶液，加入 200 μLc
(NaHCO3)= 0. 5 mol /L，200 μLc (PNZ-Cl)= 5
mmol /L，超声 2 min，过 0. 45 μm滤膜并进样。
取上清提取液 200 μL，加入 200 μLc(NaHCO3)
= 0. 5 mol /L，200 μLc(PNZ-Cl)= 5 mmol /L，超声 2
min，过 0. 45 μm滤膜并进样。
1. 3. 3 色谱条件的优化［13 － 15］
分别考察流动相梯度洗脱条件，乙酸－乙酸钠
缓冲溶液 pH值、柱温、流动相流速等液相色谱条件
对 β-ODAP及其他 17 种氨基酸的分离效果的影响。
1. 3. 4 样品提取条件的优化
1. 3. 4. 1 乙醇体积分数
取 5 支试管，分别加入 1 g 山黧豆粉，按 φ(乙
醇)分别为 10%，30%，50%，70%，90%，加入 10 mL
提取溶剂，在 100 W功率下超声 1 h，常温静置一晚，
在 4 000 r /min转速下离心 15 min，取上清提取液，分
别衍生化处理，分析，每个样品做三次平行实验。
1. 3. 4. 2 山黧豆粉质量浓度
取 6 支试管，分别加入 1 g 山黧豆粉，φ(乙醇)
为 10%，按 ρ(山黧豆粉)为 0. 10，0. 05，0. 03，
0. 025，0. 02，0. 017 g /mL 加入 10 mL 提取溶剂，在
100 W 功率下超声 1 h，常温静置一晚，在 4 000
r /min转速下离心 15 min，取上清提取液，分别衍生
化处理，分析，每个样品做三次平行实验。
1. 3. 4. 3 提取温度
取 5 支试管，分别加入 1 g 山黧豆粉，φ(乙醇)
为 10%，按 ρ(山黧豆粉)= 0. 10 g /mL 加入 10 mL
提取溶剂，在 100 W 功率下超声 1 h，在水浴温度分
别为 30，40，50，60，70 ℃条件下提取 2 h，静置一晚，
在 4 000 r /min转速下离心 15 min，取上清提取液，分
别衍生化处理，分析，每个样品做三次平行实验。
2 结果与分析
2. 1 衍生化条件的选择
目前用于 HPLC分析的柱前衍生化试剂主要有
9-芴基甲基－氯甲酸酯(9-fluorenylmethyl chlorofor-
mate，FMOC)［16］、异硫氰酸苯酯(phenyl isothiocya-
nate，PITC)［17］、2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluoro-
benzene，FDNB)［18］、6-氨基喹啉-N-羟基丁二酰亚胺
氨基甲酸酯 (6-aminoquinoly-N-hydroxysuccinimidy
carbamate，AQC)［19］以及丹磺酰氯(dansyl chloride，
Dansyl-Cl)等［20］。但这些衍生化试剂均需要精确控
制多种反应条件，衍生化操作复杂，衍生化时间长，
衍生化后的产物不稳定。由于 PNZ-Cl 是一种定量
检测生物胺和非蛋白质氨基酸的稳定的衍生化试
剂。衍生化反应完成在超声条件和适宜的温度下只
需 6 min，与之前的柱前衍生化提取方法相比，这种
方法快速、简便，测定结果准确，衍生产物一定时间
内稳定，可连续测定［21］。
2. 2 色谱条件的优化
较佳色谱条件是色谱柱为 Ultimate XB － C18
(4. 6 mm × 150 mm，5 μm) ，流动相乙腈和乙酸－乙
酸钠缓冲溶液(pH 值 = 4. 6) ，梯度洗脱程序 0 ～ 5
min φ(乙腈)25%，5 ～ 30 min φ(乙腈)25% ～ 90%，
流速 0. 8 mL /min，柱温 30 ℃，检测波长 300 nm。
2. 3 样品提取条件的优化
由于 β-ODAP及其他游离氨基酸的提取含量与
峰面积呈正相关，所以可以用峰面积大小来表示其
提取效率高低。
2. 3. 1 乙醇体积分数对 β-ODAP 及氨基酸提取效
率的影响
取 5 支试管，分别加入 1 g 山黧豆粉，按 φ(乙
醇)分别为 10%，30%，50%，70%，90%，加入 10 mL
提取溶剂，在 100 W功率下超声 1 h，常温静置一晚，
在 4 000 r /min转速下离心 15 min，取上清提取液，分
34第 33 卷 第 2 期 李小波等:山黧豆中 β-ODAP及其他氨基酸的提取和 HPLC分析
别衍生化处理，分析，每个样品做三次平行实验。比
较不同的乙醇体积分数下 β-ODAP及氨基酸的提取
效率，结果见图 1。
图 1 乙醇体积分数对 β-ODAP及其他游离氨基酸
提取效率的影响
Fig． 1 Effects of ethanol concentration on extraction yield
of β-ODAP and other free amino acids
由图 1可以看出，当 φ(乙醇)为 10%时，山黧豆中
的 β-ODAP与其他游离氨基酸的提取率达到较高。
2. 3. 2 山黧豆粉质量浓度对 β-ODAP 及氨基酸提
取效率的影响
取 6 支试管，分别加入 1 g 山黧豆粉，φ(乙醇)
为 10%，按 ρ(山黧豆粉)为 0. 10，0. 05，0. 03，
0. 025，0. 02，0. 017 g /mL 加入 10 mL 提取溶剂，在
100 W功率下超声1 h，常温静置一晚，在4000 r /min转
速下离心 15 min，取上清提取液，分别衍生化处理，
分析，每个样品做三次平行实验。比较不同的山黧
豆粉质量浓度下 β-ODAP 及氨基酸的提取效率，结
果见图 2。
图 2 山黧豆粉质量浓度对 β-ODAP及其他游离
氨基酸提取效率的影响
Fig． 2 Effects of material concentration on extraction yield
of β-ODAP and other free amino acids
由图 2 可以看出，当 ρ(山黧豆粉)为 0. 025
g /mL时，山黧豆中的 β-ODAP与其他游离氨基酸的提
取率达到较高，再减小质量浓度，提取率不再变化。
2. 3. 3 提取温度对 β-ODAP 及氨基酸提取效率的
影响
取 5 支试管，分别加入 1 g 山黧豆粉，φ(乙醇)
为 10%，按 ρ(山黧豆粉)= 0. 10 g /mL 加入 10 mL
提取溶剂，在 100 W 功率下超声 1 h，在水浴温度分
别为 30，40，50，60，70 ℃条件下提取 2 h，静置一晚，
在 4 000 r /min转速下离心 15 min，取上清提取液，分
别衍生化处理，分析，每个样品做三次平行实验。比
较不同提取温度下的 β-ODAP 及氨基酸的提取效
率，结果见图 3。
图 3 提取温度对 β-ODAP及其他游离氨基酸提取
效率的影响
Fig． 3 Effects of extraction temperature on extraction
yield of β-ODAP and other free amino acids
由图 3 可以看出，当提取温度为 60 ℃时，山黧
豆中的 β-ODAP与其他游离氨基酸的提取率达到较
高，再增加提取温度，其提取率开始下降。
2. 4 样品定性及定量分析检测
2. 4. 1 标样及样品图谱分析
β-ODAP与 17 种氨基酸混合标样的色谱图见
图 4a。实验确定较佳提取条件为 φ(乙醇)为 10%，
ρ(山黧豆粉)为 0. 025 g /mL，提取温度为 60 ℃。在
此提取条件下，对山黧豆中的 β-ODAP 及其他游离氨
基酸进行HPLC分析，见图 4b。定性分析结果表明山
黧豆中明显含有包括 β-ODAP 在内的 16 种游离氨基
酸，包括 β-ODAP、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸、
丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨
酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸。但仍存在未
解决的问题，即天冬氨酸和谷氨酸，苯丙氨酸和异亮氨
酸没有达到完全分离，所以后面定量分析工作中，将未
分开的氨基酸放在一起进行定量分析。
2. 4. 2 β-ODAP和 17种氨基酸标准曲线及结果计算
用 β-ODAP和 17 种氨基酸的浓度与色谱峰面
积回归得到工作曲线方程，见表 1。实验表明，在实
验浓度范围内，呈现很好的线性。由氨基酸标样与
山黧豆样品的 β-ODAP 及 17 种氨基酸衍生物的
HPLC 色谱图对比可以看出，山黧豆中明显含有包
括 β-ODAP在内的 16 种游离氨基酸。由标准曲线
求出各种山黧豆中氨基酸的质量比，见表 1。
44 食品科学技术学报 2015 年 3 月
1 号峰是 β-ODAP;2，3 号峰是天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu) ;4 号峰是组氨酸(His) ;5，6 号峰是精氨酸(Arg)和丝氨酸(Ser) ;7 号峰是苏氨
酸(Thr) ;8 号峰是甘氨酸(Gly) ;9 号峰是丙氨酸(Ala) ;10 号峰是脯氨酸(Pro) ;11 号峰是酪氨酸(Tyr) ;12 号峰是 PNZ-Cl;13 号峰是甲硫氨
酸(Met) ;14 号峰是缬氨酸(Val) ;15 号峰是胱氨酸(Cys) ;16，17 号峰是苯丙氨酸(pHe)和异亮氨酸(Ile) ;18 号峰是亮氨酸(Leu) ;19 号峰
是赖氨酸(Lys)
图 4 β-ODAP及 17 种氨基酸混合标样和较佳提取条件下山黧豆样品氨基酸衍生物的 HPLC
Fig． 4 HPLC chromatogram of standard mixture of β-ODAP and 17amino acids derivatized with PNZ-Cl and PNZ-derivatived amino
acids from Lathyrus sativus Linn． under optimized conditions
表 1 β-ODAP和其他 17 种游离氨基酸的工作曲线及质量比
Tab． 1 Calibration curves data and contents of β-ODAP and 17 free amino acids
峰号 氨基酸 线性范围 /(μmol·L －1) 标准曲线方程 相关系数 Ｒ2 质量比 /(mg·g － 1) ＲSD /%
1 β-ODAP 0. 15 ～ 2. 50 y = 443. 36x + 2. 245 6 0. 999 8 0. 169 ± 0. 012 3. 7
2 天冬氨酸(Asp)
0. 3 ～ 5. 0 y = 45. 853x － 14. 621 0. 999 0 0. 651 ± 0. 031 2. 33 谷氨酸(Glu)
4 组氨酸(His) 0. 15 ～ 2. 50 y = 79. 690x + 10. 140 0. 999 3 0. 568 ± 0. 043 3. 8
5 精氨酸(Arg)
0. 3 ～ 5. 0 y = 68. 561x + 38. 183 0. 999 1 0. 168 ± 0. 012 3. 76 丝氨酸(Ser)
7 苏氨酸(Thr) 0. 15 ～ 2. 50 y = 177. 57x + 2. 712 0. 999 5 0. 267 ± 0. 010 1. 9
8 甘氨酸(Gly) 0. 15 ～ 2. 50 y = 20. 422x － 0. 283 8 0. 999 6 0. 317 ± 0. 012 1. 9
9 丙氨酸(Ala) 0. 15 ～ 2. 50 y = 73. 494x + 0. 481 8 0. 999 4 0. 200 ± 0. 007 1. 8
10 脯氨酸(Pro) 0. 15 ～ 2. 50 y = 155. 42x + 2. 180 1 0. 999 4 0. 257 ± 0. 011 2. 2
11 酪氨酸(Tyr) 0. 15 ～ 2. 50 y = 144. 16x + 2. 747 6 0. 999 4 0. 092 ± 0. 006 3. 1
13 甲硫氨酸(Met) 0. 15 ～ 2. 50 y = 93. 365x + 0. 452 2 0. 999 5 — —
14 缬氨酸(Val) 0. 15 ～ 2. 50 y = 99. 753x + 0. 622 9 0. 999 7 0. 306 ± 0. 024 4. 0
15 胱氨酸(Cys) 0. 10 ～ 1. 25 y = 148. 68x + 1. 582 1 0. 999 6 — —
16 苯丙氨酸(pHe)
0. 3 ～ 5. 0 y = 119. 40x + 10. 292 0. 999 7 0. 128 ± 0. 007 2. 917 异亮氨酸(Ile)
18 亮氨酸(Leu) 0. 15 ～ 2. 50 y = 101. 47x + 2. 735 4 0. 999 4 0. 190 ± 0. 009 2. 3
19 赖氨酸(Lys) 0. 15 ～ 2. 50 y = 119. 93x + 6. 134 9 0. 999 3 0. 007 ± 0. 000 2. 9
54第 33 卷 第 2 期 李小波等:山黧豆中 β-ODAP及其他氨基酸的提取和 HPLC分析
定量分析结果表明山黧豆中 β-ODAP的质量比
为 0. 169 mg /g，16 种游离氨基酸中必需氨基酸有 6
种，分别为苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮
氨酸和赖氨酸，其中苏氨酸和缬氨酸含量都相对较
高，均大于 0. 2 mg /g。非必需氨基酸有天冬氨酸、谷
氨酸、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨
酸、酪氨酸。其中天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨
酸、丙氨酸、脯氨酸的质量比相对较高，均大于
0. 2 mg /g。
3 结 论
本文利用对硝基氯甲酸卞酯(PNZ-Cl)作为柱
前衍生化试剂，建立了山黧豆中神经毒素 β-N-草酰
基-L-α，β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-α，β-diaminopro-
pionic，β-ODAP)及其他游离氨基酸的高效液相色谱
检测方法。较佳色谱条件是色谱柱为 Ultimate XB－
C18 (4. 6 mm ×150 mm，5 μm) ，流动相乙腈和乙酸－
乙酸钠缓冲溶液(pH值 = 4. 6) ，梯度洗脱程序 0 ～ 5
min φ(乙腈)25%，5 ～ 30 min φ(乙腈)25% ～ 90%，
流速 0. 8 mL /min，柱温 30 ℃，检测波长 300 nm。该
方法快速、简便，在普通的实验室即可实现。本文还
比较了 φ(乙醇)、ρ(山黧豆粉)和提取温度对提取
效率的影响。结果表明:在 φ(乙醇)为 10%，ρ(山
黧豆粉)为 0. 025 g /mL，提取温度为 60 ℃时，提取
效率较高。
该方法可以实现对山黧豆中包括 β-ODAP在内
的 16 种游离氨基酸的分析测定，但仍存在未解决的
问题，即天冬氨酸和谷氨酸，苯丙氨酸和异亮氨酸没
有达到完全分离。定量分析结果也显示，山黧豆中
β-ODAP的质量比为 0. 168 mg /g，必需氨基酸如苏
氨酸和缬氨酸质量比都相对较高，均大于 0. 2 mg /g。
非必需氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、
丙氨酸、脯氨酸的质量比相对较高，均大于 0. 2 mg /g。
本文的研究结果可进一步为山黧豆的开发利用提供
实验依据。另外，在此基础上，针对山黧豆的去毒及
蛋白质等营养学价值还需进一步研究和探讨。
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64 食品科学技术学报 2015 年 3 月
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Extraction and HPLC Analysis of β-ODAP and Other Amino Acids
in Lathyrus Sativus
LI Xiaobo1， FAN Chen1， LONG Limei1， LI Nai1， CAO Xueli1，* ，
LI Xuefan2， NIU Xiaofeng2， JIA Ping2
(1． School of Food and Chemical Engineering /Beijing Higher Institution Engineering Ｒesearch Center of
Food Additives and Ingredients /Beijing Key Lab of Food Quality and Safety，
Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China;
2． Taiyuan Liuweizhai Industry Co． Ltd．，Taiyuan 030401，China)
Abstract:An high performance liquid chromatographic(HPLC)method was developed to analyze neuro-
toxin β-N-oxalyl-α，β-diaminopropionic acid(β-ODAP) ，and other free amino acids in Lathyrus sativus
Linn． by precolumn derivatization with para-nitro-benzyloxycarbonyl chloride (PNZ-Cl)． The chromatog-
raphy conditions were as followed:column of Ultimate XB-C18，acetonitrile and sodium acetate as the
mobile phase，gradient elution procedure being 0 － 5 min φ(acetonitrile)25% ，5 － 30 min φ(acetoni-
trile)25% － 90%，and flow rate 0. 8 mL /min，the colum thermostated at 30 ℃，and detecting wave-
length 300 nm． The extraction conditions，such as the ethanol concentration，raw material concentration，
and extraction temperature，were optimized using this analytical method． The results showed that higher
extraction yield of β-ODAP and other free amino acids was obtained under the conditions of 10% (V∶ V)
ethanol，material concentration of 0. 025 g /mL，and extraction temperature 60 ℃ ．
Key words:Lathyrus sativus;β-ODAP;amino acids
(责任编辑:李 宁)
74第 33 卷 第 2 期 李小波等:山黧豆中 β-ODAP及其他氨基酸的提取和 HPLC分析