全 文 ：文章编号:1000-694X(2001)03-0300-03
用于 RAPD分析的沙拐枣 DNA 提取方法
　　收稿日期:1999-11-20;改回日期:2000-01-14
　　基金项目:中国科学院沙坡头开放试验站基金资助
　　作者简介:陶玲(1970—),女(汉族),甘肃省靖远县人 ,博士研究生 ,主要从事植物生理生态学研究。
陶玲1 , 刘志学2 , 何兴东1 , 刘新民1
(1.中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 , 甘肃 兰州　730000;2.上海大学 生命科学学院 ,上海　201800)
摘　要:DNA 分子标记技术是检测遗传差异的一种新技术 , 特别是 RAPD技术 ,应用更为广泛。 DNA 质量是保证
RAPD分析成功的关键。本文用改进的 SDS 法对沙拐枣属植物种子的总 DNA 进行了提取。琼脂糖凝胶电泳结果
表明:得到的 DNA 片段大小在 20 kb 以上;通过 PCR扩增实验 , 证明用此方法提取的 DNA , 可直接用于随机扩增
的 DNA 多态性(RAPD)遗传标记。
关键词:沙拐枣;总 DNA;提取;SDS 法;RAPD
中图分类号:Q94-336 文献标识码:A
　　RAPD分子生物学技术已普遍应用于生物学的
各个领域 。荒漠植物蕴含着丰富的抗旱 、抗寒 、抗病
等基因 ,受到越来越多的植物学家的重视。生物总
DNA的提取是进行基因文库构建 、遗传标记 、转化
等研究的基础[ 1] 。DNA 分子标记技术是 90年代发
展起来的检测遗传差异的一种新技术 , RAPD(Ran-
dom amplified polymorphic DNA , 随机扩增的多态
性 DNA)技术近年来广泛应用于种质资源鉴定 、遗
传差异分析 、性状早期预选等 ,具有检测位点多 、灵
敏度高 、操作简便 ,无须预先知道模板 DNA 的碱基
顺序等优点 。DNA 的质量直接影响到 RAPD 的扩
增结果 ,因此 , DNA 的提取方法是保证扩增成功的
关键[ 2] 。
许多植物 ,如小麦 、水稻 、玉米等的总 DNA 提
取已有许多成熟的方法 ,而沙漠植物 DNA 的提取
仍处于探索阶段 。80年代末提出的 CTAB 法在大
部分植物材料中可以提取到高质量的 DNA ,但价格
比较昂贵 ,且不适于裸子植物和沙生植物。1992年
Pierre和 Hauvence等提出了一种快速的 DNA 提取
方法 ,但需要 Cscl密度梯度离心和柱层析等步骤 ,
比较繁琐 ,多数实验室条件不能满足 ,因此不被普遍
采用[ 3～ 6] 。
本文采用 CTAB 法和 SDS 法分别对沙拐枣属
(Call igonum)幼苗和种子 DNA 进行提取[ 4] , 提取
产物在 1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳 ,结果都不
理想 ,大部分 DNA 降解或发生褐变。最后采用改
进的 SDS法 ,经过鉴定 ,结果可以直接用于 RAPD
分析[ 2] 。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料为在不同地区采集的沙拐枣属植物种
子 ,用于 RAPD分析的种有:戈壁沙拐枣(Calligon-
um gobicum , 采自新疆乌尔禾), 小沙拐枣(C.
pumilum ,采自新疆福海),三列沙拐枣(C.tri far-
icum ,采自新疆福海),河西沙拐枣(C.potaninii ,
采自甘肃河西)。
1.2　方法
1.2.1　DNA 提取
将沙拐枣供试种子先用浓 H2SO4浸泡至刺毛脱
落 ,瘦果用自来水冲洗干净 , 再用自来水浸泡于
37℃恒温水浴锅内 ,每天换水 ,直至果皮软化 ,取出
胚 ,每种约 1.0 g 用液氮研磨成细粉 ,转入 10 ml离
心管中 ,加入 4.0 ml 提取缓冲液(100 mmol·L-1
T ris-HCl , 50 mmol·L -1 Na2EDTA , 500 mmol·
L -1 NaCl , 1.5%SDS , 1%PVP , pH8.0 ,使用前加
入 100 mmol·L-1 BME),搅匀后在65℃水浴中保温
30 min ,离心(5 000 rpm , 10 min),将上清液转入干
净离心管中 ,加入等体积苯酚 、氯仿 、异戊醇(25∶24∶
1),缓慢颠倒混匀 ,离心(6 000 rpm , 10 min),上清
液再以氯仿 、异戊醇(24∶1)抽提后离心(8 000 rpm ,
10 min),收集上清液 , 加入 0.45 m l 0.1 mol·L-1
NaAc和 0.6倍体积预冷的异丙醇 ,混匀后在-20℃
下静置 30 min ,离心(8 000 rpm , 10 min),沉淀物加
第 21卷　第 3期
2001年 9月 　　　　　　　　　　　　　　
中　国　沙　漠
JOURNAL OF DESERT RESEARCH
　　　　　　　　　　　　　Vol.21　No.3
S ep.2001
入75%的酒精清洗 ,转入灭菌后的 1.5 ml离心管
中 ,用无水乙醇冲洗两次后 ,晾干。最后加入 300 μl
TE溶解。
1.2.2　DNA质量检测
用 TAE(pH8.0)为电极缓冲液 , 用 λ/HindIII
作为分子量参照物 ,将溶解于 TE 中的 DNA ,在 1%
的琼脂糖凝胶上进行电泳 ,溴化乙锭染色后 ,用 FR
-200型凝胶电泳成像系统进行观察并照相。
1.2.3　DNA扩增
扩增反应在 PE公司的 PCR仪上进行 ,总反应
体积 25 μl ,反应体系为:50 mmol·L-1 Tris-HCl ,
pH8.3 , 250 μg·ml-1 BAS , 2%Ficoll , 1 mmol·L-1
Tatrazine , 2 mmol·L-1 MgCl2 , 200 μmol·L-1
dNTPs , 0.2 μmol·L-1 10-mer primer , 1 μTaq
polymerase(Sangon), 25 ～ 50 ng DNA 。反应条件:
94℃3 min ,然后以94℃1 min , 35℃1 min , 72℃2
min运行 45个循环 ,之后 72℃延伸 5 min。扩增产
物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳分离 ,溴化乙锭染色后 ,
用 FR-200型凝胶电泳成像系统进行观察并照相 。
2　结果与讨论
2.1　DNA 质量检测
用上述方法提取的沙拐枣 DNA ,经电泳染色 ,
成像系统照相(图 1)。可以看出 ,各个种所得的
DNA样品的产量在 20 kb以上 , 降解较少 , 少数种
图 1　几种沙拐枣 DNA电泳图谱
F ig.1　DNA samples isolated from 7 Calligonum species
M-λ/HindI II marker;b2-红皮沙拐枣(C.rubi-
cund um);c3-河西沙拐枣(C.potaninii);e2-乔
状沙拐枣(C.arborescens);f2 -三列沙拐枣(C.
tri faricum);h1-小沙拐枣(C.pumilum);i2-
戈壁沙拐枣(C.gobicum , 乌尔禾);i1-戈壁沙拐
枣(C.gobicum , 136 团)
含有残留的 RNA。
2.2　RAPD扩增
以上述方法提取的各种沙拐枣植物 DNA ,以
Sangon公司生产的引物 S1258(序列为 CCAGCT-
G TGA)扩增 ,扩增产物经电泳染色 ,成像系统照相
(图 2)。可以看出 , 4种沙拐枣 DNA用引物 S1258
扩增后 ,出现了多态位点 ,表明沙拐枣属种间存在着
明显的遗传差异。
图 2　几种沙拐枣 RAPD图谱
Fig.2　Genomic DNA amplifica tion pattern in four
Calligonum species with 10-mer random primer
M1-λ/HindIII marker;120-戈壁沙拐枣(C.gobicum);
110-小沙拐枣(C.pumi lum);81-三列沙拐枣(C.t ri-
faricum);54-河西沙拐枣(C.potanin ii)
DNA的提取质量往往是决定 RAPD成功与否
的关键 ,是进行基因表达分析及基因克隆等分子生
物学研究的基础 。CTAB 法由于成本较高 ,毒性较
大 ,且操作繁琐 ,目前仅在需 DNA 量较大的 RFLP
等分析中采用 。在本实验中 ,用 CTAB 法对沙拐枣
DNA提取的结果不理想 。SDS法对于模板 DNA质
量要求不严的 RAPD分析采用较多[ 2] ,但在沙拐枣
植物中 RAPD没有结果 。加入适量防止氧化 、褐变
的物质 BME 、PVP ,可以得到质量较好的 DNA 。
沙拐枣属植物是荒漠地区固沙造林的先锋树
种 ,具有较强的抗旱 、抗寒 、抗病虫害等特性 ,其基因
的研究 ,对于抗性基因的筛选与克隆 ,培育作物抗性
品种 ,具有一定的实践意义 。沙拐枣 DNA 的提取
是基因研究的基础 。沙拐枣种子发芽率较低 ,目前
尚未找到合适的用叶子提取 DNA的方法 。在研究
301　3期　　　　　　　　　　　　　　　　　陶玲等:用于 RAPD分析的沙拐枣 DNA提取方法　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
居群遗传学时 ,由于采样比较困难 ,用种子作为材料
提取 DNA ,采样和保存都很容易 ,是比较简便易行
的方法 ,且已证实 ,用改进的 SDS 法进行种子 DNA
提取 ,获取 DNA 质量较好 ,可直接用于 RAPD 扩
增。
致谢:本研究在复旦大学遗传研究所沈大棱教授实
验室完成 ,特此致谢 。
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DNA Extraction Method for RAPD Analysis with Calligonum spp.
TAO Ling
1 , LIU Zhi-xue2 , HE Xing-dong 1 , LIU Xin-min1
(1.Cold and Ar id Regions Environmen tal and Engineer ing Research Insti tu te , Ch inese Academy of Sciences , Lanzhou 730000 ,
China;2.Academy of Li fe Sciences , Shanghai Universi ty , Shanghai 201800 , China)
Abstract:DNA Molecular Markers is a new method for detecting genetic variation.RAPD(Random amplified
polymo rphic DNA)technique has been widely used in genet ic and systematic evolution of plant.The quality of
DNA sample is important in RAPD analysis .In this paper , an improved SDS method of DNA isolation was ap-
plied to obtain to tal DNA from Calligonum spp.The results of ag arose gel elect rophoresis showed that the frag-
ments of DNA samples were larger than 20 kb;The PCR results showed that high level of genetic variation was
found betw een four Calligonum species.It was also proved that the isolated DNA could be used directly for
RAPD analysis w hich are useful for detect ing the genetic diversity of Calligonum .
Key words:Calligonum ;DNA;ex t raction;SDS;RAPD
302　　　　　　　　　　　　 　　　　中　国　沙　漠　　　　　　　　　　　　　　21卷