全 文 ：赵春燕，晏国洪，姜 山． 小立碗藓 CAD1 基因敲除载体的构建及酶切方法优化［J］． 江苏农业科学，2016，44(3) :59 － 63．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 03． 014
小立碗藓 CAD1基因敲除载体的构建及酶切方法优化
赵春燕，晏国洪，姜 山
(贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳 550001)
摘要:苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。肉桂醇脱氢酶(CAD)催化木质素单体合成的最后一步
反应，Ｒeal － Time PCＲ表达分析表明，小立碗藓 CAD1 基因在接种灰霉菌后的第 2 天表达量迅速上升。本试验利用
PCＲ技术，以小立碗藓基因组 DNA为模板，使用 Primer 5 － Cracked 设计的引物，扩增出小立碗藓 CAD1 基因的上、下
游同源臂基因片段。酶切 CAD1 上游同源臂和 pTN182 原始质粒，经连接酶连接、转化至感受态大肠杆菌，筛选出阳性
株。采用裂解液裂解、质粒 DNA提取、质粒 PCＲ以及酶切进行验证，得到 CAD11 － pTN182。采用同样的方法把下游
片段转入 CAD11 － pTN182，即得 CAD11 － pTN182 － CAD12，最后进行测序分析。结果表明，已成功构建 CAD11 －
pTN182 － CAD12 敲除载体，并将该重组质粒转入目的菌株大肠杆菌中保存备用，可为后续进行小立碗藓 CAD1 基因敲
除，验证小立碗藓 CAD1 基因功能，进一步了解模式植物小立碗藓防卫反应机理研究奠定良好基础。
关键词:小立碗藓;CAD1 基因;基因克隆;载体构建;酶切
中图分类号:Q782 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)03 － 0059 － 05
收稿日期:2015 － 09 － 01
基金项目:国家自然科学基金(编号:30860158、31260426)。
作者简介:赵春燕(1989—) ，女，山东济宁人，硕士研究生，主要从事
植物分子生物学研究。E － mail:1220982962@ qq． com。
通信作者:姜 山，博士，教授，主要从事植物病理学研究。E － mail:
kyosan200312@ hotmail． com。
苔藓植物是高等植物的低等类群，是陆生植物登陆早期
的代表，含有一整套合成木质素的基因［1］，具备合成木质素
的生理基础，但是苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定
的争议。小立碗藓(Physcomitrella patens)隶属葫芦藓目葫芦
藓科(Funariaceae)小立碗藓属(Physcomitrium)。小立碗藓生
活史中单倍体的配子体时期占优势，其整个基因序列已知，核
基因组易于与有同源片段的外源 DNA 发生高频率的同源重
组，这使得基因敲除成为可能，并且试验过程中得到的突变体
即为纯合体，为基因功能的研究提供了良好的材料［2］，已经
成为植物分子生物学研究的模式生物。
病原真菌和细菌感染维管束植物时，感染部位的细胞壁
加厚并形成突起状结构———乳突。本试验室前期工作中发现
灰霉菌感染非维管束植物小立碗藓后，小立碗藓细胞壁加厚
或形成乳突结构。形成乳突是维管束植物常见的防卫反应，
是限制病原体入侵的一道物理障碍，其主要成分之一为木质
素，说明乳突是植物一个较为保守的抗病反应机制。木质素
是一种复杂的酚类聚合物，广泛存在于高等植物中的维管束
植物中［3］，苔藓植物中是否合成木质素目前还存在一定的争
议。相关文献报道，苔藓植物不合成木质素，却合成木酯素或
类木质素。用木质素的特异性染料高锰酸钾染色灰霉菌感染
的小立碗藓样品并于电镜下观察发现，细胞壁加厚或乳突部
位出现明显染色加深，说明小立碗藓在灰霉菌胁迫下可能合
成了类木质素。木质素的生物合成是以苯丙酸起始，在一系
列酶催化下逐步转化为木质素单体，最终聚合成木质素的过
程，其中肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素代谢途径中第一个被
研究的酶，其催化木质素单体合成的最后一步反应，将 3 种肉
桂醛还原生成相应的 3 种肉桂醇［4］。本试验室前期使用
Ｒeal － Time PCＲ表达分析表明，小立碗藓 CAD1 基因在接种
灰霉菌后的第 2 天表达量迅速上升，达到未接种对照组的 17
倍。综上所述，小立碗藓中可能合成了类木质素。
本试验构建小立碗藓 CAD1 基因的敲除载体，为后续敲
除小立碗藓 CAD1 基因，获得 CAD1 基因敲除突变株，验证小
立碗藓 CAD1 基因是否参与木质素的合成奠定基础，对揭示
模式植物小立碗藓防卫反应机理有重要意义。
1 材料与方法
1． 1 仪器、试剂与材料
1． 1． 1 仪器 电子天平，美国 Denver Instrument MXX － 612，
TP － 214;PCＲ 仪，美国 Bio － Ｒad Engine;电泳仪，美国 Bio －
Ｒad A101439;凝胶成像系统，美国 Bio － Ｒad Engine;微量冷
冻离心机，日本 3500;超净工作台，上海博迅 VS － 840 － 2;微
电脑光照培养箱，上海博迅 SPX － 250B － G;101A － 3 型电热
鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂;YXQ － LS － 75 SⅡ型立式
压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司;HHS 型电热恒温
水浴锅，上海博讯实业有限公司;十万分之一分析天平，梅特
勒 －托利多仪器有限公司;TGL － 16G 型离心机，上海安亭科
学仪器厂;85 － 2A恒温磁力搅拌器，金坛市科析仪器有限公
司;精密酸度计，上海大普仪器有限公司。
1． 1． 2 试剂 引物，限制性核酸内切酶(XhoⅠ、EcoＲⅤ、Xba
Ⅰ、BamHⅠ)、Premix TaqTM、T4 － DNA 连接酶、DNA Marker
DL15000，大连宝生物工程有限公司;Plasmid Mini KitⅠ试剂
盒，OMEGAbiotek公司;Kanamycin;测序由上海生工完成;其
他试剂均为国产分析纯。
1． 1． 3 材料 小立碗藓(提取其 DNA，用于扩增 CAD1 基因
上、下游同源臂)、质粒 pTN182(5 006 bp，用于构建 CAD11 －
NPTⅡ － CAD12 敲除载体)由首都师范大学提供，E． coli
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DH5α(用于外源基因的转化)由贵阳医学院提供。pTN182
质粒模式见图 1，该质粒含有 NPTⅡ基因，在大肠杆菌中表现
为抗卡那霉素，此外，该质粒含有 2 个多酶切位点，可将小立
碗藓 CAD1 基因上、下游同源臂先后 2 次转入该质粒。
1． 2 方法
1． 2． 1 引物设计 (1)在 GenBank中搜索出蓝桉树 CAD1 基
因的蛋白质序列。(2)在 blast 中比对出相应的 mＲNA 序列。
(3)在 JGI Genome Portal(http:/ / genome． jgi － psf． org /)通过
mＲNA序列比对出小立碗藓 CAD1 基因 的 DNA 序列
(1 624 bp)。(4)将小立碗藓 CAD1 基因的 DNA序列均分为
上、下游片段。(5)根据小立碗藓 CAD1 上、下游片段的 DNA
序列使用引物设计软 Primer 5 － Cracked分别设计 CAD1 基因
上、下游片段的最佳引物与同源臂片段(上游同源臂CAD11 －
681 bp，下游同源臂 CAD12 － 650 bp)。(6)在 DNAMAN 软
件中根据比对的基因序列在引物前添加酶切位点。(7)根据
GC%添加保护碱基。(8)大连宝生物工程有限公司合成引
物［5］。所合成的引物序列见表 1。
表 1 引物序列
引物名称 引物序列 酶切位点
上游臂 CAD11 － F 5 － ACA CTCGAGAGCGTCTTGCTGTTTGTT － 3 XhoⅠ
上游臂 CAD11 － Ｒ 5 － CGC GATATCCAGGAAGTTCGGAGTTGTA －3 EcoＲⅤ
下游臂 CAD12 － F 5 － CGC TCTAGATGCCAAATTCGGTGTCGT － 3 XbaⅠ
下游臂 CAD12 － Ｒ 5 － ATA GGATCCTGAGGGTGTCACGCTCCA －3 BamHⅠ
注:下划线部分为酶切位点碱基序列。
1． 2． 2 目的基因的获取 以改良的 CTAB 法提取的小立碗
藓基因组 DNA为模板［6 － 7］，以 CAD11 － F、CAD11 － Ｒ 为引物
进行 PCＲ，扩增出 CAD1 上游同源臂 CAD11;以 CAD12 － F、
CAD12 － Ｒ 为引物进行 PCＲ，扩增出 CAD1 下游同源臂
CAD12，反应体系见表 2。PCＲ反应条件:94 ℃预变性 5 min;
94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环，
72 ℃终延伸 10 min，保存于 4 ℃。扩增出目的基因片段采用
乙酸钠、乙醇洗脱法进行回收，溶于无菌去离子水中，置于
－ 20 ℃ 保存备用［8 － 9］。
1． 2． 3 质粒的提取 将含有 pTN182 质粒的大肠杆菌置于
LB固体培养基上 37 ℃活化培养 12 ～ 16 h，挑取单菌落接种
于 LB液体培养基中，37 ℃振荡过夜培养。将该培养基转移
表 2 PCＲ反应体系
药品 体积(μL)
CAD11 － F 1
CAD11 － Ｒ 1
小立碗藓基因组 DNA 3
Premix TaqTM 25
无菌去离子水 20
总体积(μL) 50
至 5 mL EP 管中，室温离心(12 000 r /min，1 min) ，去上清。
采用 Plasmid Mini KitⅠ试剂盒(按试剂盒说明)抽提 pTN182
质粒，将提取的质粒溶于无菌去离子水中保存于 4 ℃冰箱。
1． 2． 4 CAD1 － pTN182克隆载体的构建 使用 XhoI、EcoＲV 2
种酶，分别使用同步双酶切、分步酶切方法酶切 CAD1 上游目
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的基因和 pTN182原始质粒，经乙醇洗脱后使用 EcoＲⅤ继续酶
切，酶切体系为 2 μL酶、4 μL对应 buffer、12 μL目的基因，使
用无菌去离子水补齐至 40 μL，酶切反应条件为 37 ℃、3 h。取
目的基因片段 9 μL、质粒 3 μL、连接液 12 μL于 EP管中混匀，
封口膜密封 EP管 16 ℃过夜连接［10 －15］。
1． 2． 5 克隆载体的转化 采用 CaCl2 方法制作感受态大肠
杆菌［16］，保存于 4 ℃冰箱。取 1 μL过夜连接产物，加入到感
受态大肠杆菌(感受态 12 ～ 24 h 转化效率最高) ，轻旋，冰浴
30 min，放入 42 ℃水浴锅热激 90 s，立即冰浴 3 min，加入 LB
液体培养基 1 mL，37 ℃振荡培养 1 h。取 800 μL转化液于含
有卡那霉素(10 mg /mL)的 LB固体平板培养基上，37 ℃放置
20 min，待菌液完全被吸收后倒置过夜培养。
1． 2． 6 转化菌株的鉴定 挑取长出的单菌落，转移到新的含
卡那霉素的 LB 固体平板培养基上并编号做进一步筛选。
(1)挑取第 2 次在含卡那霉素的 LB 固体培养基上长出的单
菌落将于裂解液中 65 ℃裂解 1． 5 h，裂解产物用琼脂糖凝胶
电泳与 pTN182 原始质粒对比验证。(2)将筛选出的菌落用
LB液体培养基 37 ℃振荡过夜培养，使用质粒 DNA提取试剂
盒提取质粒，琼脂糖凝胶电泳与 pTN182 原始质粒对比验证，
筛选出比原始质粒条带略高的菌落。(3)以筛选出的质粒为
模板进行 PCＲ验证，琼脂糖凝胶电泳验证是否可以得到目的
条带。(4)用 XhoⅠ、EcoＲⅤ分步酶切验证。以插入了上游
片段的 pTN182 重组质粒(CAD11 － pTN182)为载体，采用插
入上游臂方法构建插入下游片段的重组质粒(CAD11 －
pTN182 － CAD12)。CAD1 敲除载体构建过程模式见图 1，以
CAD11 － pTN182 － CAD12 重组质粒为模板，使用 CAD11 － F、
CAD12 － Ｒ 为引物 PCＲ 出总目的基因条带(CAD11 －
NPTⅡ － CAD12)，送至上海生工测序。
2 结果与分析
2． 1 提取出的小立碗藓基因组 DNA的检测
采用改良的 CTAB法提取小立碗藓基因组 DNA，最后用
70%的乙醇洗脱，溶于蒸馏水中于 － 20 ℃备用。琼脂糖凝胶
电泳验证提取出的 DNA。从图 2 可以看出，经 0． 7%琼脂糖
凝胶电泳可看出预期的 DNA条带。
2． 2 PCＲ扩增小立碗藓 CAD1 基因上、下游目的基因
使用设计好的引物，以提取的小立碗藓基因组 DNA为模
板，PCＲ扩增同源臂基因片段出现了模糊的弥散条带(图 3)，
没有出现目的基因条带。将提取的小立碗藓基因组 DNA 用
高盐 TE溶液和无水乙醇沉淀，再用 70%的乙醇洗脱 3 遍，以
此 DNA为模板进行 PCＲ扩增，从图 4、图 5 可以看出，PCＲ产
物经 0． 7%琼脂糖凝胶电泳，可以获得 1 条清晰明亮的特异
性条带，条带大小与引物设计时设计的上、下游同源臂长度
681、650 bp相符。
2． 3 CAD1 上游同源臂插入结果鉴定
采用裂解液裂解转化的大肠杆菌进行验证。利用裂解液
裂解转化后在含卡那霉素的 LB 固体平板培养基上生长的大
肠杆菌，裂解产物经 0． 7%琼脂糖凝胶电泳，可以对比出比原
始质粒条带高的为插入了上游片段的质粒，进而可以筛选出
对应的插入了含上游同源臂质粒的大肠杆菌。从图 6 可以看
出，第 7 道的质粒比原始质粒条带略高，第 7 道的质粒可能已
经插入了 CAD1 上游臂。
提取质粒验证。挑取上述第 7 道菌落于含卡那霉素的
LB液体培养基 37 ℃振荡过夜培养，用质粒 DNA提取试剂盒
抽提，提取出的质粒经 0． 7%琼脂糖凝胶电泳，与原始质粒比
对，可以比对出可能插入了目的片段的菌落。从图 7 可以看
出，第 7 道菌落提取出的质粒条带比原始质粒条带略高，表明
第 7 道大肠杆菌中提取出的质粒可能已插入了小立碗藓
CAD1 上游臂基因。
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质粒 PCＲ验证。以上述 7 质粒为模板，进行 PCＲ 扩增，
PCＲ产物经 0． 7%琼脂糖凝胶电泳，获得预期上游目的基因
条带则该质粒可能已经插入了 CAD1 上游臂。以图 6 中第 7
道菌提取的质粒为模板，以 CAD11 － F、CAD11 － Ｒ 作引物进
行 PCＲ验证，PCＲ 产物采用琼脂糖凝胶电泳验证，结果(图
8)表明，产生的 1 条特异性条带与预期上游臂片段 681 bp 相
符。可能成功构建了 CAD11 － pTN182 重组质粒。
2． 4 CAD1 下游同源臂插入结果鉴定
CAD1 下游同源臂插入 CAD11 － pTN182 重组质粒即得
CAD11 － pTN182 － CAD12 重组质粒。验证方法同上。
裂解法验证。由图 9 可知，第 3、4、6、7、9 道的质粒比
CAD11 － pTN182 重质粒条带略高，有可能第 3、4、6、7、9 道的
质粒已经插入了 CAD1 下游同源臂。
提取质粒验证。挑取第 3、4、6、7、9 道的菌落于含卡那霉
素的 LB液体培养基 37 ℃振荡过夜培养，进一步提取质粒验
证。从图1 0可以看出，第9道菌落提取出的质粒条带比
CAD11 － pTN182 重组质粒条带略高，表明第 9 道大肠杆菌中
提取出的质粒可能已插入了小立碗藓 CAD1 下游臂。
质粒 PCＲ 验证。以图 7 中第 9 道菌提取的质粒为模板
见图 11，以 CAD12 － F、CAD12 － Ｒ 作引物进行 PCＲ 验证，出
来 1 条特异性条带，与预期下游臂片段 650 bp 相符。可能成
功构建了 CAD11 － pTN182 － CAD12 重组质粒。
2． 5 CAD11 － pTN182 － CAD12 重组质粒鉴定
质粒 PCＲ 验证。以第 9 道菌提取出的质粒为模板，
CAD11 － F、CAD12 － Ｒ 为引物，PCＲ 出总目的基因条带(上游
臂 681 bp，下游臂650 bp，NPTⅡ基因约2 000 bp，总目的基因条
带约 3 300 bp) (图 12)。经 0． 7%琼脂糖凝胶电泳，可以看到 3
300 bp左右的特异性条带，与预期的 3 300 bp条带相符。
酶切验证。图 1 中构建好的 CAD11 － pTN182 － CAD12
重组质粒，AB(681 bp)为插入的 CAD1 上游臂，CD(650 bp)
为插入的 CAD1 下游臂，BC(2 114 bp)为选择标记基因 NPT
Ⅱ基因，BB、CC为酶切位点与NPTⅡ 基因连接片段。酶切
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验证电泳见图 13，单酶切原始质粒、CAD11 － pTN182 重组质
粒、CAD11 － pTN182 － CAD12 重组质粒(1、2、3) ，条带依次略
高。用 XhoⅠ、XbaⅠ酶切可能含有上下游片段的质粒(4) ，可
得到 2 条约为 2 700、3 700 bp 的条带。用 XhoⅠ、BamHⅠ酶
切可能含有上下游臂的质粒(5)可得到 2 条约 3 000、
3 300 bp 的条带。用 XhoⅠ、EcoＲⅤ酶切可能含有上游臂的
质粒(6)可能含有上下游臂的质粒可得到 2 条约 681、
5 000 bp 的条带。用 XbaⅠ、BamHⅠ酶切可能含有上下游臂
的质粒(7)可得到 2 条约 650、5 700 bp的条带。从图 13 可以
看出，酶切得到的条带与预期结果相符，说明原始质粒中插入
了 CAD1 上、下游同源臂。
测序验证。取 PCＲ 出的总目的基因拿到大连宝生物工
程有限公司进行测序，测序出来的结果用 DNAMAN软件与设
计的目的片段比对，比对结果见图 14。比对结果显示
99. 05%互补配对，可能在 BB、CC接口处会出现一些小的误
差，测序结果表明，插入了 CAD1 上下游同源臂，敲除载体构
建成功。
3 讨论及结论
本试验将 CAD1 基因的上、下游同源臂分别插入到含 2
个多酶切位点的 pTN182 质粒。以改良的 CTAB 法提取的小
立碗藓基因组 DNA为模板，使用引物设计软件设计的小立碗
藓 CAD1 基因上、下游同源臂的引物，利用 PCＲ技术扩增出小
立碗藓 CAD1 基因的上、下游同源臂。使用 XhoⅠ、EcoＲV 2
种酶，酶切 CAD1 上游同源臂和 pTN182 原始质粒，T4DNA 连
接酶过夜连接，连接产物转化至感受态大肠杆菌，用含卡那霉
素的 LB固体平板培养基筛选阳性株，之后采用裂解液裂解、
质粒 DNA提取、质粒 PCＲ 以及酶切进行验证。下游同源臂
的构建采用同样的方法，最后进行测序分析。结果表明，已成
功构建了 CAD1 基因敲除载体。
本试验过程当中，采用改良的 CTAB 方法提取小立碗藓
基因组 DNA，用 70%乙醇洗脱 1 遍。以此 DNA 为模板进行
PCＲ扩增，PCＲ产物经 0． 7%琼脂糖凝胶电泳，没有出现预期
的 681、650 bp 目的基因条带，而是在 300 bp 左右出现弥散
带［17］。改变 DNA模板与引物的比例，仍出现同样的弥散带。
在试验过程中发现提取的 DNA溶于水后，该溶液略微发黄并
有黏稠感，分析可能是以下原因影响了后续 PCＲ 反应［18］:
(1)提取的 DNA 的纯度不够，其中可能含有蛋白质、多糖和
酚类等杂质。(2)DNA 在溶解前可能有乙醇残留，乙醇抑制
后续反应。(3)提取的 DNA 中可能有残留的金属离子。为
排除以上因素，将提取的小立碗藓基因组 DNA 用高盐 TE 溶
液和无水乙醇沉淀，于 － 20 ℃沉淀 1 h 后离心，再用 70%的
乙醇洗脱 3 遍，从而去除混在 DNA 中的杂质，于超净工作台
吹风晾干，让乙醇充分挥发(不要过分干燥，以免 DNA 断裂)
后再加水溶解 DNA。以此 DNA 为模板进行 PCＲ 扩增，可以
得到目的基因。因此，在提取 DNA时，应将蛋白质、多糖和酚
类杂质洗脱完全，以免影响后续反应。试验前期过程中采用
同步双酶切的方法酶切 CAD1 上游目的基因和 pTN182 原始
质粒，经连接、转化至大肠杆菌等过程，一直未筛选出插入上
游目的片段的阳性株，后改用分步酶切的方法酶切，成功筛选
出插入目的基因的阳性株。说明同步双酶切没有分步酶切效
率高。可能是由于每一种酶都有随酶提供的相应的最佳
buffer，以保证 100%的酶活性。buffer 的组成及内切酶在不
同缓冲液中的活性不同。在设计引物时，虽然选择了能在最
大程度上保证 2 种酶活性的缓冲液，但由于 2 种酶均在非最
佳缓冲液条件下进行酶切，其效率会降低，从而影响后续的连
接及转化效率。因此，在同步双酶切不成功时，可以考虑采用
分步酶切的方法，提高酶切效率，为后续转化、筛选等过程奠
定良好的基础。
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