全 文 ：云南四个瓜实蝇地理种群的遗传关系分析*
朱振华1, 2 叶 辉1* * 张智英1
( 1 云南大学生命科学学院,昆明 650091; 2云南省农业科学院粮作所,昆明 650205)
摘要 对云南 4 个不同地理区域的瓜实蝇种群( Bactr ocera cucur bitae)共 23 个个体的线粒体 DNA 细胞
色素 b 基因中的部分序列进行测定和分析, 并以桔小实蝇( B . dor salis)、番石榴实蝇( B. corr ect)和南瓜实
蝇( B. tau)为外群种构建了不同单倍型的 NJ 分子系统树. 在获得的 426 bp 序列中, A+ T 含量约占
650% ,有 4 个多态位点, 无任何碱基插入和缺失. 这些位点共定义 5 种单倍型, 其中一种为共享单倍型.
对 4 个瓜实蝇地理种群进行 Fst 值和基因流动统计, Fst值为 0. 16667~ 0. 20000( P > 0. 05) , Nm 值为 2. 00
~ 2. 50. 5 种单倍型共形成了 3 个聚类簇. 可以认为, 4 个地理种群间均存在一定程度的遗传分化, 但分化
程度不高, 导致遗传分化的主要因素是地理隔离, 而种群遗传分化程度低与瓜实蝇所在环境条件相似有
关.
关键词 瓜实蝇 线粒体 DNA 细胞色素 b 基因 遗传分化
文章编号 1001- 9332( 2005) 10- 1889- 04 中图分类号 S834 文献标识码 A
Genetic relationships among four Bactrocera cucurbitae geographic populations in Yunnan Province. ZHU
Zhenhua1, 2, YE Hui1, ZHANG Zhiying1 ( 1College of L if e Science, Yunnan Univer sity , K unming 650091, Chi
na; 2 I nstitute of Crop s , Yunnan Academy of Agricultural Science, K unming 650205, China) . Chin. J . A pp l .
Ecol . , 2005, 16( 10) : 1889~ 1892.
In this study , the partial sect ion of mitochondr ial cytochr ome b in 23 individuals of four Bactr ocera cucur bitae ge
ographic populations( Banna, Ruili, Yuanjiang , and Hekou) in Yunnan Province was sequenced, and the phylo ge
netic trees of all haplo types w ere constr ucted by means of NJ method, using B. dorsalis , B. cor r ect and B. tau
as the outgr oup species. Of the 426 bp mitochondr ial cytochr ome b DNA sequences obtained, A% + T% was
about 65. 0% , four nucleo tide sites w ere substituted, and no base composition of the sequences w as inserted and
lost. Fiv e haplotypes were identified in all the sequences, w ith four show ing polymorphism, and one shared. The
genetic characters of the four populat ions w ere analyzed by Fst value and gene flow through Mega software. The
Fst v alue was 0. 16667~ 0. 20000(P > 0. 05) , and t he Nm value was 2. 00~ 2. 50. The NJ tree suggested that
four haplotypes constructed three clades. A ll results show ed t hat the genetic differ ences pr esented among the four
populations, but with low degr ees. The main r eason causing the genetic differ ences among the four populations
was supposed to be related to genetic isolat ion and ecolog ical adaptation.
Key words Bactr ocera cucur bitae, M tDNA, Cy to chrome b gene, Genetic differentiation.
* 云南省自然科学基金项目 ( 2003C0007M)、国家自然科学基金项目
(30260023)和国家重点基础研究发展规划资助项目( 2003CB415100) .
* * 通讯联系人. Email: yehui@ ynu. edu. cn
2004- 09- 15收稿, 2005- 02- 21接受.
1 引 言
瓜实蝇( Bactrocer a cucur bitae )俗称!针蜂∀, 幼
虫称!瓜蛆∀, 属双翅目( Diptera) , 实蝇科( Tephriti
dae) ,果实蝇属( Bactrocer a) , 是我国华东、华南、西
南地区及海南、台湾等省上百种瓜果的重要害
虫[ 5, 12, 13] .瓜实蝇成虫将卵产在瓜果果肉内, 其幼
虫孵化出来后直接取食瓜果果肉,最终导致受害瓜
果腐烂变质.鉴于其对多种瓜果, 特别是热带、亚热
带瓜果的严重危害,瓜实蝇一直被世界各国列为重
要的检疫性害虫[ 5, 13] .
云南是我国瓜实蝇危害的主要省区之一, 受瓜
实蝇危害的瓜果蔬菜达百余种之多,其中一些重要
的热带和亚热带瓜果,如芒果、柑桔、番石榴、番荔枝
等受瓜实蝇的危害尤其严重[ 2, 14, 15] .瓜实蝇在云南
的地理分布可以分为常年分布区和季节性分布区两
类.常年分布区位于北纬 24#以南, 瓜实蝇在该区域
内常年发生; 而在北纬 24#以北的区域瓜实蝇仅发
生于春末至秋初. 初步研究认为,发生于季节性分布
区内的瓜实蝇源于常年分布区. 因此,如果能有效地
控制常年分布区内瓜实蝇种群的数量, 就有可能在
一定程度上减少甚至阻止其向季节性分布区的迁
移, 进而起到对季节性分布区瓜实蝇的控制作
用[ 14, 15] . 在瓜实蝇常年分布区内, 东西向长约 1 600
km,其间主要有三大高山深谷呈南北排列[ 2] . 在此
情况下, 随春季温度回升而向南迁移的瓜实蝇源于
何处? 它们又是沿着哪条路径向北迁移的呢? 显
应 用 生 态 学 报 2005年 10 月 第 16 卷 第 10 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , Oct. 2005, 16( 10)∃1889~ 1892
然,要回答这些问题,首先需要确定常年分布区内被
分隔在不同地区的瓜实蝇种群及其地理分布, 然后
对常年分布区内各瓜实蝇地理种群与季节分布区内
瓜实蝇种群加以对比研究,最终确定其虫源地.本项
研究正式基于这一基本思路提出来的.
遗传特征是区分同种不同种群的重要种群特
征.种群的遗传特征是该种群经长期遗传进化的结
果.在云南特定地理条件下,分布于不同地点的种群
是否已经形成了能彼此区分的种群遗传特征尚需加
以确认.本研究以常年分布区内被地理分隔的 4 个
瓜实蝇种群为对象, 利用分子生物学技术,寻求能反
映4个瓜实蝇地理种群的分子遗传标记, 为研究揭
示季节性分布区内瓜实蝇来源地提供基础信息, 并
为探讨瓜实蝇在云南的最初来源、系统进化等提供
重要的分子生物学证据.
2 材料与方法
21 供试样品
实验所用瓜实蝇标本分别采自元江、河口、版纳和瑞丽.
这 4 个地点为瓜实蝇常年分布区内的主要发生地,相互之间
在地理上处于分隔状态. 瑞丽位于云南的最西端, 与最南部
的版纳被怒江、澜沧江等分隔, 版纳与元江之间有高大的哀
牢山相隔, 而元江与河口之间有着众多起伏绵延的丘陵, 相
距 250 km 以上.有关供试瓜实蝇数量及采集地信息见表 1.
表 1 供试瓜实蝇数量、采集时间和地点
Table 1 Col lection locali ties, date and numbers of sampled B. cucur
bitae
采集地点
Locality
代号
Code
海拔
Altitude( m)
纬度
Latitude( N)
样品数量
Samples No.
采集日期
Collection date
元江Yuanjiang Y 797 23#41% 5 20036
河口Hekou K 87 22#31% 7 20035
版纳Banna B 558 21#29% 5 20035
瑞丽Ruili R 907 24#01% 6 20036
22 总 DNA提取
供试瓜实蝇标本用 TE( 10 mmol&L - 1 T ris, 1 mmol&L - 1
EDTA, pH 9 0)缓冲液浸泡 24~ 48 h, 用无菌水清洗, 然后
分别放入 1 5 ml的 Eppendorf中 ,用匀浆器将其磨碎, 采用
酚/氯仿法提取总 DNA. 获得每头实蝇的总 DNA 样品置于
- 20 ∋ 的冰箱中保存、备用.
23 PCR扩增及序列测定
扩增的目的片段为 mtDNA 细胞色素b 编码区中 433 bp
的一段序列.用于扩增 Cytb 基因片段的引物是 CB1 和 CB2,
由上海申友生物技术有限公司合成,引物序列分别为:
CB1: 5% - TATGTACTACCATGAGGACAAATATC -
3%,
CB2: 5% - ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT -
3%[ 8] .
PCR 反应的总体积为 50 l, 其中含有 10 ( Buffer, 5 l;
Mg2+ ( 25 mmol&L - 1 ) , 4 l; dNTP, 15 l; 引物 ( 10 pmol&
L
- 1
)各 4l, T aq DNA 聚合酶( 5 U&l- 1) 04 l, 模板 DNA 2
l.扩增条件为 94 ∋ 预变性 2 min, 共 35 个循环, 包括 94 ∋
变性 1 min, 44 ∋ 退火 1 min, 72 ∋ 延伸 15 min, 最后在 72
∋ 充分延伸 5 min, 同时, 以 DDH2O 代替模板 DNA 作空白
对照. 扩增产物的大小、纯度和亮度用 12 %的琼脂糖凝胶
电泳检测. PCR 粗产物的纯化及测序委托上海申友生物技
术有限公司完成. 测序反应均在 ABI100377 测序仪上进行.
2 4 DNA序列数据处理
获得的 Cytb 基因片段序列用 DNAstar软件中的 Editseq
程序编辑, 然后用 Dnastar 软件中的 Megalign 程序排列 DNA
同源序列, 并用人工核对校正.
用 Mega version 21 软件[ 4]确定上述序列中各碱基的含
量、多态位点分析、单倍型分布与分布频率, 选取基于 Kimu
ra2Parameter 双参数模型, 用邻接法 ( Neighbor Joining)构建
单倍型分子系统树, 并用 Boo tstrap1000 检验分子系统树中
各分枝的置信度, DNA 序列变异中的转换和颠换赋予相同
的加权值. 构系统树时,用瓜实蝇的近缘种桔小实蝇、番石榴
实蝇和南瓜实蝇的同源序列(本研究测定)为外类群.
采用 Arlequin1 1[ 9]中的 AMOVA 程序计算各瓜实蝇种
群间遗传变异的分化水平( Fst)、基因流程度,以及种群间基
于 Kimura 双参数模型的遗传距离.
3 结果与分析
31 序列变异分析
用引物 CB1、CB2 对 mtDNA Cytb区的序列进
行了 PCR扩增,检测结果如图 1 所示. 由图 1可以
看出该实验结果重复性好, 可以排除外源 DNA 污
染及 DNA 核拷贝的可能性.
图 1 4个瓜实蝇地理种群 PCR扩增带
Fig. 1 PCR band of amplification through electrophoresis for 4 geograph
ic populat ions of B . cucurbi tae .
PCR产物经纯化、测序、比较,最终得到长度为
426 bp的 mtDNA Cytb基因序列. 在所有可用于比
较的序列中共有 4 个变异位点, 占核苷酸总数的
094% .在变异位点中未发现任何碱基的插入和缺
失. 这些位点定义了 5 种单倍型. 序列中 A + T
( 650%)含量远远高于 G + C( 350%)含量. 而就
每个氨基酸密码子来看, 第 3位点的 A+ T 平均含
量较高, 达到 746%, 第 1 位点为 549% , 第 2位
点为 655%,与其它实蝇种类 mtDNA 的碱基组成
1890 应 用 生 态 学 报 16卷
特点基本一致[ 6, 10] .
32 单倍型及其分布格局
在所分析的瓜实蝇 23个个体中,共发现 5种单
倍型,占个体总数的 2083% ,其中, 1种单倍型为共
享单倍型, 在 4个种群中所占的比率均高达 60%以
上.版纳种群只有共享单倍型 B1,没有共享单倍型.
元江、河口和瑞丽种群除有共享单倍型 B1 以外, 并
有自己的独享单倍型,它们分别是 Y3 和 Y4、K2 和
R5.这些独享单倍型在该种群中所占的比率以及分
布频率都比较高(表 2) . 独享单倍型的存在表明这
些地理种群之间已出现一定程度的遗传分化.
以桔小实蝇、番石榴实蝇和南瓜实蝇的为外群
种,构建瓜实蝇 5单倍型的 NJ分子系统树, 系统树
上各分枝上的数值为经 1 000次bootst rap后的置信
度(图 2) . 5 种单倍型形成的拓扑结构分为 3 个簇
群,其中, 元江种群的独享单倍型 Y3和 Y4, 以 75%
的置信度构成聚类族 ); 河口种群的独享单倍型
K2,以 64%的置信度构成聚类族 ∗; 瑞丽种群的独
享单倍型 R5以 52%的置信度与版纳种群的单倍型
也即共享单倍型 B1构成聚类族+ .
表 2 23个瓜实蝇个体 Cytb基因序列的变异位点及其定义的单倍
型
Table 2 Variable sites of mtDNA Cytb partial sequence in 23 B. cucur
bitae and haplotypes
单倍型
Haplotypes
[ 3 4]
[ 2 2 0]
[ 4 1 7 1]
种群及所含单倍型个体数
Populations and individuals
w ith haplotypes
R5 T C T G 瑞丽( 1)版纳( 0)河口( 0)元江( 0)
Y3 .T . A 元江( 1)版纳( 0)河口( 0)瑞丽( 0)
Y4 G T. A 元江( 1)版纳( 0)河口( 0)瑞丽( 0)
K2 . . C A 河口( 2)版纳( 0)瑞丽( 0)元江( 0)
B1 . . . A 版纳( 5)河口( 5)瑞丽( 5)元江( 3)
注:表中上方方括号内的数字表示单倍型(H )相应碱基的位置;圆点
( &)表示与第一种单倍型( R5)有相同的碱基组成 Each haplotype is
indicated on the left , above site numbers correspond to base position in
haplotype R5; the dot stands for the same base pairs w ith the top se
quence R5T he last column is for the geographic populations and the f re
quency dist ribution of the haplotype.
图 2 用 N J法构建的瓜实蝇 5种单倍型的分子系统树
Fig. 2 Molecular phylogenet ic t ree of 5 haplotypes const ructed by NJ
m ethod.
33 种群遗传结构分析
4个瓜实蝇地理种群间的 Fst值和基因流动分
析结果见表 3 各种群间的 Fst 值为 016667 ~
020000( P> 005) ,说明几个地理种群间的遗传变
异较小.不同地理种群间的基因流动由 Nm值表示.
一般地, 当 Nm> 4, 表明种群间的基因交流比较充
分;若 Nm< 1, 则表明种群可能由于遗传漂变而发
生了分化[ 11] . 4个地理种群间的基因流动值 Nm 为
200~ 250,表明瓜实蝇 4个种群间既存在着一定
数量的基因交流, 也存在一定程度的遗传分化.
表 3 瓜实蝇 4个地理种群的 Fst值和基因流
Table 3 Fst value and genetic flow among 4 geographic populations of
B. cucurbitae
Y K B R
Y - 250 250 230
K 016667 - 250 221
B 016667 016667 - 200
R 017857 018462 020000 -
注:对角线以上为群体间的 Nm 值,对角线以下为群体间的 Fst 值
The f igures above the diagonal are Nm and below the diagonal are Fst.
34 瓜实蝇地理种群与外群间的遗传关系
经Arlequin11软件分析显示: 4个瓜实蝇地理
种群间的遗传距离为 000067~ 000220, 而不同种
实蝇间的遗传距离为 005493~ 0193354个瓜实
蝇群体间的遗传距离, 远远小于不同实蝇种类间的
遗传距离.由此表明, 4个瓜实蝇地理种群间的遗传
差异仅限群体自身,遗传分化程度较低.此结果与由
单倍型及频率、Fst 值、基因流、群体间的遗传距离
所提示的结果一致.
4 讨 论
本文基于 Cytb 基因序列对云南瓜实蝇 4个不
同地理种群的遗传关系进行了初步探讨, 揭示利用
Cytb基因序列可将云南边境与云南内地的瓜实蝇
种群加以区分,认为 Cy tb基因序列可以作为研究云
南瓜实蝇区域性分布的遗传标记.
东南亚国家是瓜实蝇主要发生区, 也是瓜实蝇
发生危害较为严重的地区[ 2] . 云南位于缅甸、越南
北部,受孟加拉湾气流的影响,常年受西南季风所控
制.有人认为,云南瓜实蝇可能是受西南季风的影响
由东南亚国家从南方向北扩散迁移而至. 本文通过
对云南 4个瓜实蝇地理种群单倍型发生频率的研究
表明,位于最南部的版纳种群仅有共享单倍型没有
独享的单倍型,而版纳以北的瑞丽、河口和元江种群
除了与版纳种群有共享单倍型外, 都有各自独享的
单倍型.版纳、瑞丽、河口和元江等地理种群的共享
单倍型频率分别为 100%、833%、714%、600%.
以此可以认为,版纳瓜实蝇种群内无变异产生, 即种
群内各个体间无显著遗传差异. 此外,版纳、瑞丽、河
口和元江等地理种群均以 B1为优势单倍型. 通常,
189110 期 朱振华等: 云南四个瓜实蝇地理种群的遗传关系分析
进入新区的种群数量较少, 其所拥有的基因数量也
应该少于原产地种群的基因数量. 因此,如果仅从上
述关于 4个种群单倍型发生频率看,版纳种群反而
可能是从元江、河口等地扩散迁移去的.瓜实蝇在云
南的最初发生地是一个很有趣的问题, 有助于我们
深刻认识瓜实蝇在云南的发生发展规律, 并基于这
一规律指导当地瓜实蝇的防治.上述 4个地理种群
单倍型发生频率为我们提供了一个方面的信息, 但
要完全回答云南瓜实蝇起源还需要对各单倍型成因
加以进一步分析.
从DNA分子水平上对云南瓜实蝇 4个地理种
群间的遗传关系的初步探讨表明,这 4个地理种群
间已存在一定程度的遗传分化, 但分化的程度还比
较低. 这一情况是与云南桔小实蝇遗传分化的研究
结果大体相同[ 10] . 可以认为, 云南瓜实蝇 4 个地理
种群间存在的遗传分化主要是受到地理因素的影
响.云南地势西北高东南低,其间一些高山大河、沟
谷深壑呈南北走向相间排列, 山体、水域等天然屏障
在地理隔离中有重要作用[ 1, 11] . 本次研究中所选择
的4个瓜实蝇发生地从东到西分布在云南北纬 24#
以南的范围内, 这种东西方向的分布在地理位置上
已经被南北走向的高黎贡山、哀牢山、无量山等山
脉,以及怒江、澜沧江等河流分隔开来. 南北走向的
大山大河从客观上构成了 4个瓜实蝇种群东西向活
动难以逾越的地理屏障. 瓜实蝇 4个地理种群实际
上是被分隔在相对隔绝的区域中,相互之间进行种
群交流机会较少.经对当地生态条件的逐渐适应, 遗
传分化在各地理种群中随之产生. 故认为,地理隔离
是导致云南瓜实蝇 4个种群遗传分化的根本原因.
另一方面, 在本研究中, 瑞丽、版纳、元江、河口
均位于北纬 24#以南,属于同一热带气候, 年均温在
18 ∋ 以上,冬季基本无霜雪,常年降雨充沛, 海拔高
度均在 1 200 m 以下. 而其重要寄主植物也大体相
同,主要为热带瓜果,如芒果、番石榴等.群体的分化
程度主要是对所在的生态条件相适应的结果. 如果
所产生环境作用强度及方向没有大的差异, 其各分
布区内种群在遗传上将难以形成显著 的分
化[ 3, 6~ 8] .由于气候条件与寄主种类基本相似, 上述
4个地区的瓜实蝇种群所承受的生态环境影响非常
接近, 自然选择对各瓜实蝇种群趋异进化的作用不
显著,因而,瓜实蝇 4个地理种群间遗传分化的程度
自然较低. 该情况在桔小实蝇的研究中也有类似发
现[ 10, 14, 15] .
上述研究初步探讨了云南省北纬 24#以南瓜实
蝇 4个地理种群间的遗传关系, 揭示了各地理种群
在遗传上存在一定差异, 并对云南瓜实蝇的来源地
提出了假设. 为了能更加全面地掌握云南瓜实蝇分
布区内各地理种群间的关系,从分子生物学上为制
定云南瓜实蝇区域性防治总体策略提供更加准确的
可靠依据.在下一步的研究中,需要增加研究各实蝇
种群的个体数量, 增加所选分子标记线粒体 DNA
Cytb的测序长度,以获得更多而有效的遗传信息.
致谢 总 DNA的提取和 PCR 扩增等是在云南省工业微生
物发酵工程重点实验室进行的, 实验中得到云南大学生物系
施伟老师、沙涛实验师的帮助,谨此致谢.
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作者简介 朱振华, 男, 1970 年生,硕士.主要从事分子生态
学研究, 发表论文 5 篇. Email: zhzhh86@ 126. com
1892 应 用 生 态 学 报 16卷