全 文 ：海洋细菌抗菌和细胞毒活性的初步研究 3
郑　立1 ,2 　林　伟2 　严小军3 3 3 　陈海敏2
(1 中国科学院研究生院 ,北京 100039 ;2 中国科学院海洋研究所 ,青岛 266071 ;3 宁波大学生命科学院 ,宁波 315211)
【摘要】　从不同海域的生物、海水和海泥中分离海洋细菌 ,利用琼脂扩散法和 MTT 法对细菌培养液的乙
酸乙酯提取物进行了抗菌和细胞毒活性筛选 ,比较了活性菌株与来源的相关性. 结果表明 ,在分离的 341
株海洋细菌中 ,42 株细菌的代谢产物具有抗菌活性 ,7 株具有细胞毒活性 ,其中来源于海洋无脊椎动物和
海藻的活性菌株比例 (22 %和 11 %)大于来源于海水和海泥的细菌 (7 %和 5 %) . 细菌分类鉴定结果显示 ,
具有活性的细菌大部分属于假单胞菌属、发光杆菌属、梭状芽孢杆菌属、交替单胞菌属和黄杆菌属.
关键词 　海洋细菌 　抗菌 　细胞毒
文章编号 　1001 - 9332 (2004) 09 - 1633 - 04 　中图分类号 　Q938. 8 　文献标识码 　A
A primary study on antimicrobial and cytotoxic activity of marine bacteria. ZHEN G Li1 ,L IN Wei2 , YAN Xi2
aojun3 ,CHEN Haimin2 (1 Graduate School of Chinese Academy of Science , Beijing 100039 , China ,2 Institute of
Oceanology , Chinese Academy of Science , Qingdao 266071 , China ; 3 Ningbo U niversity , N ingbo 315211 , Chi2
na) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2004 ,15 (9) :1633～1636.
Marine bacteria were isolated from marine organisms including invertebrates and seaweeds and from sea water
and sediments of different sea area. Ethyl acetate extractions of marine bacterial fermentation were screened for
antimicrobial and cytotoxicity activities by using the methods of agar diffusion and MTT assay ,and the relation2
ship of active bacteria and their origin was studied. The results showed that 42 strains among total 341 isolated
marine bacteria had antimicrobial activity ,and 7 strains had cytotoxicity activity. The proportion of active bacte2
ria associated with marine invertebrates and seaweeds (22 % and 11 %) was higher than that isolated from sea
water and sediments (7 % and 5 %) . The most active marine bacteria were assigned to the Pseudomonas , Photo2
bacterium , Clost ridium , A lteromonas and Flavobacterium group.
Key words 　Marine bacteria , Antibacterial , Cytotoxicity.
3 国家科技部新药博士基金项目 (2003AA2Z3511) 和国家自然科学
基金重点资助项目 (29932030) .3 3 通讯联系人. E2mail :xiaojunyan @hotmail. com
2003 - 11 - 17 收稿 ,2004 - 02 - 27 接受.
1 　引 　　言
与陆源生物的次生代谢产物相比 ,海洋生物由
于生活环境更加复杂 ,门类更加多样化 ,使得其天然
产物具有很多新型的结构骨架和独特的化学结构 ,
在生物活性方面也具有更强烈的作用[3 ,17 ,19 ] . 随着
研究的深入 ,不少学者发现海洋动植物中的活性物
质相当一部分来源于共栖微生物[14 ,18 ,22 ] ,由于海洋
动植物中的活性物质含量低 ,且生物量有限 ,所以海
洋微生物作为活性物质的可持续性资源正日益受到
国内外研究工作者的重视[8 ,10 ,13 ,20 ] .
微生物在海洋环境中分布广泛 ,或生活于海水
中 ,或存在于沉积物和海泥中 ,或与海洋生物处于共
生、共栖、寄生或附生的关系. 特别是海洋生物附生
微生物 ,由于在空间、营养、光线等方面的竞争关系 ,
能产生许多具有工业和药用价值的天然产
物[2 ,6 ,24 ] . 而且培养这类微生物的条件更接近于自
然水体 ,相对于海洋生物内共生微生物要容易得多 ,
从这类微生物中寻找天然产物为开发海洋活性物质
开辟了新的空间. 本实验从山东青岛、烟台以及浙江
南麂岛潮间带水域分离海洋细菌 ,研究其抗菌和细
胞毒活性 ,比较了活性细菌与来源的相关性 ,为今后
海洋微生物活性物质的研究进行了前期工作.
2 　材料与方法
211 　供试材料
2002 年 6 月在浙江南麂岛潮间带采集海水、海泥及海
洋生物样品 :链状节荚藻 ( L omentaria catenata) 、冈村凹顶藻
( L aurencia okam urai) 、裂片石莼 ( Ulva f asciata) 、珍珠膜海
绵 ( Hymeniacidon perleve) 、真丛柳珊瑚 ( Euplexaura curva2
ta) ,2002 年 8 月在山东青岛、烟台沿海潮间带采集海水、海
泥、孔石莼 ( Ulva pertusa) 、鼠尾藻 ( S argassum thunbergii ) 、
叉枝藻 ( Gym nogongrus f labellif ormis ) 、海带 ( L aminaria
japonica) 、海葵 (未鉴定) 和石鳖 (未鉴定) .
212 　研究方法
21211 样品处理 　1)生物样品的处理 :剪取 015 g 样品 ,用无
应 用 生 态 学 报 　2004 年 9 月 　第 15 卷 　第 9 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Sep. 2004 ,15 (9)∶1633～1636
菌海水漂洗 3 遍 ,除去非附生细菌 ,加入 10 ml 无菌海水 25
℃研磨 ,再用无菌海水稀释为 10 - 1 、10 - 2两个稀释度 ;2) 海
泥样品 :称取 015 g 样品加入 10 ml 无菌海水 ,振荡摇匀后静
置 ,吸取上层海水用无菌海水稀释为 10 - 1 、10 - 2两个稀释
度 ;3)海水样品 :用无菌海水稀释为 10 - 1 、10 - 2两个稀释度.
21212 分离细菌 　细菌分离培养基采用 1/ 10 Zobell 2216E
固体培养基. 样品涂布后 25 ℃培养 20 d ,挑取不同形态、不
同色素的单菌落转入斜面培养 ,经 2 次纯化后 8 ℃保存.
21213 菌株培养液粗提取物制备 　纯化菌株活化 2 d 后接种
于装有 300 ml Zobell 2216E液体培养基的三角瓶中 ,25 ℃培
养 7 d. 培养液离心 (5 000 g ×30 min)除去菌体 ,用乙酸乙酯
(100 ml ×3)提取上清液 ,乙酸乙酯相 37 ℃蒸干作为活性检
测的粗提取物.
21214 抗菌活性筛选 　以枯草芽孢杆菌 CMCC (B) 63003
(B acillus subtilis ,BS) ; 金黄色葡萄球菌 CMCC (B) 26001
( S taphylococcus aureus , SA) ;大肠杆菌 CMCC (B) 44102 ( Es2
cherichia coli ,EC) ;根瘤土壤杆菌 AS111416 ( A grobacterium
tumef aciens , A T) ; 酿酒酵母 ACCC211882 ( S accharomyces
cerevisia , SC) 作为实验用敏感指示菌 ,用琼脂扩散法 [21 ]筛选
活性菌株 ;粗提取物用甲醇溶解 ,配制成 100 mg·ml - 1的溶
液 ,吸取 20μl 加在灭菌烘干的滤纸片 (直径为 6 mm) 上 ,置
于上层含有指示菌的双层营养琼脂固体平板中 ,甲醇作为阴
性对照 ,青霉素、氯霉素纸片 (上海医药化验所产) 作为阳性
对照. 培养皿放于 8 ℃冰箱中过夜 ,次日于 37 ℃培养箱中培
养 24 h 观察结果 ,根据抑菌圈大小判别抑菌活性.
21215 细胞毒筛选 　以肿瘤细胞 Hela ,B GC (中国科学院上
海细胞研究所)作为目标细胞 ,培养基为含 10 %BCS 的1 640
培养基 ,细胞毒活性测定采用 MTT 法 ,参照文献 [15 ]略有改
动.细胞用胰酶消化后 ,调节密度为 2～3 ×104 个/ 孔 ,添加
于 96 孔板中 ,每孔 195μl ,置于 37 ℃、015 %CO2 培养箱中培
养 24 h. 粗提取物用甲醇溶解后加入培养板中 ,每孔样品浓
度为 200μg·ml - 1 ,以甲醇作为阴性对照 ,37 ℃、015 %CO2
培养箱中培养 48 h. 取出 96 孔板 ,每孔加入 20μl MTT (5
mg·ml - 1) ,继续培养 4 h. 弃培养液 ,每孔加入 150μl DMSO ,
37 ℃振荡 6 min ,492 nm 处测定各孔的光吸收 ,计算抑制率
IR = (OD阴性对照 - OD样品) / OD阴性对照 ×100 %. IR ≥50 %判定
为具有细胞毒活性.
21216 细菌鉴定 　对具有抗菌和细胞毒的海洋细菌进行菌
种鉴定 , G+ 菌采用 Shewan 海洋异养细菌鉴定系统 , G- 菌采
用 Oliver 海洋细菌鉴定系统.
3 　结果与分析
311 　海洋细菌的抗菌活性
根据采样海域及菌落形态、大小、色泽等特点 ,
从海水、海泥及生物样品中共分离到 341 株海洋细
菌.对 5 株敏感指示菌的抑菌实验表明 ,42 株细菌
具有至少抑制一种指示菌的活性 (表 1) ,其中 4 株
对所有指示菌都有抑制作用 ,分别是真丛柳珊瑚
( Euplex aura curvata) 中分离到的 NJ52721、珍珠膜
海绵 ( Hymeniaci don perleve) 中分离到的 NJ62321、
来源于青岛海水的 QD122、来源于青岛石鳖的 QD52
221. 具有抑菌作用的海洋细菌属于假单胞菌属
( Pseudomonas) 、发光杆菌属 ( Photobacteri um ) 、梭
状芽孢杆菌属 ( Clost ri di um ) 、交替单胞菌属 ( A l2
teromonas) 、黄杆菌属 ( Flavobacteri um ) 、屈桡杆菌
属 ( Flex ibacter) 、黄单胞菌属 ( Xanthomonas ) 7 个
属 ,而大部分的活性菌株属于发光杆菌属 (12 株 ,
2816 %) 、假单胞菌属 (10 株 ,2318 %) 、梭状芽孢杆
菌属 (6 株 ,1413 %) 、黄杆菌属 (6 株 ,1413 %)和交替
单胞菌属 (5 株 ,1119 %) .
表 1 　海洋细菌的抑菌活性
Table 1 Antimicrobial activity of marine bacteria
菌株
Strain
细菌分类
Taxon of bacteria
指示菌 Test microorganisms
BS SA EC AT SC
NJ12121 发光杆菌属 Photobacterium sp1 + + + + - + + +
NJ12421 黄杆菌属 Flavobacterium sp1 - - - + -
NJ12822 发光杆菌属 Photobacterium sp1 + - - - -
NJ121021 假单胞菌属 Pseudomonas sp1 - + - + -
NJ121422 假单胞菌属 Pseudomonas sp1 + + - + -
NJ122022 屈桡杆菌属 Flexibacter sp1 - + - + -
NJ22221 发光杆菌属 Photobacterium sp1 + - - + -
NJ22921 黄杆菌属 Flavobacterium sp1 + + - + -
NJ32321 假单胞菌属 Pseudomonas sp1 + - - + -
NJ324 交替单胞菌属 A lteromonas sp1 + - - - -
NJ3210 发光杆菌属 Photobacterium sp1 + - - + -
NJ3218 发光杆菌属 Photobacterium sp1 - - - + -
NJ42621 假单胞菌属 Pseudomonas sp1 + + + - - -
NJ52222 发光杆菌属 Photobacterium sp1 + + - - -
NJ52321 梭状芽孢杆菌属 Clostridium sp1 + - - + -
NJ52322 梭状芽孢杆菌属 Clostridium sp1 + - - + + -
NJ52721 梭状芽孢杆菌属 Clostridium sp1 + + + + + + + + + +
NJ5216 发光杆菌属 Photobacterium sp1 - - - + -
NJ62321 假单胞菌属 Pseudomonas sp1 + + + + + + + + + +
NJ62322 梭状芽孢杆菌属 Clostridium sp1 + + + + - + + + + +
NJ62821 假单胞菌属 Pseudomonas sp1 + + - + -
NJ621021 黄杆菌属 Flavobacterium sp1 - - - + -
NJ6214 交替单胞菌属 A lteromonas sp1 + - - + -
NJ6220 假单胞菌属 Pseudomonas sp1 - - - + -
NJ6222 梭状芽孢杆菌属 Clostridium sp1 + + - - -
NJ6225 交替单胞菌属 A lteromonas sp1 + + - - -
NJ721522 梭状芽孢杆菌属 Clostridium sp1 + - - + -
QD122 屈桡杆菌属 Flexibacter sp1 + + + + + + + + + +
QD126 黄杆菌属 Flavobacterium sp1 - - - + -
QD226 发光杆菌属 Photobacterium sp1 + + - + -
QD322 交替单胞菌属 A lteromonas sp1 + + + - + + -
QD32321 发光杆菌属 Photobacterium sp1 + - - + -
QD3210 黄杆菌属 Flavobacteriums sp1 - - - + -
QD42321 假单胞菌属 Pseudomonas sp1 - + + - - -
QD427 假单胞菌属 Pseudomonas sp1 + + - + + -
QD52221 发光杆菌属 Photobacterium sp1 + + + + + + + + + + +
QD525 发光杆菌属 Photobacterium sp1 + + - - -
QD527 交替单胞菌属 A lteromonas sp1 - - - + -
QD62321 发光杆菌属 Photobacterium sp1 - - - + -
QD722 黄单胞菌属 Xanthomonas sp1 + - - + -
YTBM221 黄杆菌属 Flavobacterium sp1 - + - + -
YTHM217 假单胞菌属 Pseudomonas sp1 + + + - + + +
- 无抑制作用 No inhibition ; + 抑菌圈为 1～3 mm Inhibition zone was
1～3 mm ; + + 抑菌圈为 3～5 mm Inhibition zone was 3～5 mm ;
+ + + 抑菌圈≥5 mm Inhibition zone was ≥5 mm.
4361 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
　　具有活性的海洋细菌对于指示菌表现出不同的
抑菌谱 (图 1) ,42 株海洋细菌中只有 9 %对 EC 有抑
制作用 ,17 %对 SC 有抑制作用 ,对 SA 有抑制作用
的占 52 % ,对 BS 有抑制作用的为 69 % ,对 A T 有抑
制作用的最多 ,占总数的 81 %. Lemos[11 ]在实验中
也发现海洋细菌很难对陆源病原菌 Escherichia coli
A TCC 25922 产生抑制作用 ; Ivanova [9 ] 筛选到的
126 株抗菌菌株中只有 4 株对 E1 coli 的生长有抑
制作用. 造成这一现象的原因可能是革兰氏阴性菌
的细胞外膜上具有狭窄的膜孔道蛋白 ,阻碍了极小
亲水性抗生素类化合物进入细胞 ,而膜上的脂多糖
成分也可降低亲脂性抗生素的穿膜扩散 [4 ,16 ] ;
Lewis[12 ]则认为 ,在细菌中存在“抗药性泵”( Mul2
tidrug resistance pump) 可将许多抗生素从胞内排
出. 这也是目前许多细菌抗药性的原因之一.
图 1 　海洋细菌抑菌菌株的抑菌谱
Fig. 1 Antagonistic spectra of antimicrobial marine bacteria.
312 　海洋细菌的细胞毒活性
在分离到的海洋细菌中有 7 株细菌的培养液粗
提取物具有细胞毒活性 (表 2) . QD122 和 NJ62321 除
有抗菌活性外 ,对两种肿瘤细胞都有较高的细胞毒
活性 , IR 值分别为 6510 ±019 %和 5512 ±117 %、
6012 ±216 %和 5013 ±215 % ;具有抗菌活性菌株
QD52221 和 NJ62322 分别对两种肿瘤细胞中的一种
有抑制作用. 另外 3 株没有抗菌活性的细菌
YTBM821A、QD72121 和 NJ52122B 对 Hela 细胞有毒
性作用. 细菌分类表明这些活性菌株属于假单胞菌
属 、发光杆菌属 、梭状芽孢杆菌属和肠杆菌科
表 2 　海洋细菌的细胞毒活性(抑制率 x ±s %)
Table 2 Cytotoxicity activity of marine bacteria( Inhibition rate x ±s %)
菌株
Strain
细菌分类
Taxon of bacteria
肿瘤细胞 Cancer cell
Hela B GC
YTBM821A 发光杆菌属 Photobacterium sp1 5813 ±115 -
QD72121 假单胞菌属 Pseudomonas sp1 6111 ±512 -
QD52221 发光杆菌属 Photobacterium sp1 6411 ±017 -
QD122 屈桡杆菌属 Flexibacter sp1 6510 ±019 5512 ±117
NJ52122B 肠杆菌科 Enterobacteriaceae sp1 5910 ±211 -
NJ62321 假单胞菌属 Pseudomonas sp1 6012 ±216 5013 ±215
NJ62322 梭状芽孢杆菌属 Clost ridium sp1 - 5116 ±118
- 抑制率 < 50 % IR < 50 %.
( Enterobacteriaceae) .
313 　海洋细菌抗菌、细胞毒活性来源相关性
从具有抗菌、细胞毒活性的海洋细菌数量和比
例来看 (表 3) ,海水和海泥中所分离到的活性菌株
分别为 3 株 (5 %)和 2 株 (7 %) ,远低于生物样品. 虽
然来源于无脊椎动物和来源于海藻的活性菌株数量
一样多 ,但从比例来看 ,无脊椎动物达到 22 % ,高于
海藻的 11 %. 在不同的海域 ,受到人为保护的南麂
岛自然保护区所筛选到的活性细菌数量和比例 (28
株 ,16 %) 要高于山东的青岛和烟台 (17 株 , 10 %)
(表 3 ,表 4) ,其中南麂岛的珍珠膜海绵中筛选到 8
株活性细菌 ,是活性细菌来源最丰富的样品 ,其次是
真丛柳珊瑚 (6 株)和链状节荚藻 (6 株) . 同前人的报
道相似 ,Lemos[5 ,11 ]在海藻附生细菌抗菌活性筛选
工作中 ,发现 17 %的细菌对 S taphylococcus aureus
有抑制作用 ,对 23 株鱼类病原菌的 75 %也具有抗
菌活性. Ivanova 等[9 ]从海洋无脊椎动物体表分离到
491 株海洋细菌 ,发现 26 %对海洋细菌、陆源细菌和
真菌的生长有抑制作用. Burgess 等[2 ]对海藻和无脊
椎动物这些防御体系较弱生物的体表寄生菌非常感
兴趣 ,从这些生物表面筛选出 400 株细菌 ,发现
35 %的细菌有抗陆源病原菌活性 ,比从海水或土壤
中筛选的高出许多. 郑忠辉[23 ] 、黄耀坚等[7 ]开展了
包括厦门海区潮间带海洋动植物共、附生微生物的
培养条件及其抗菌活性的研究 ,发现这些共、附生微
生物具有相当高的抑菌比例. Armstrong[1 ]认为 ,海
洋生物附生微生物与宿主有着紧密的联系. 它们一
方面可以从其动植物宿主获得必需的各种. 维生素、
多糖、上中不饱和脂肪酸等营养 ,另一方面可以产生
表 3 　不同样地分离的活性细菌数量和比例
Table 3 Total number and percentage of bioactive bacteria isolated from
different region
样品 Sample A B C
浙江南麂岛 链状节荚藻 L omentaria catenata 40 6 15
Nanji island 冈村凹顶藻 L aurencia okam urai 22 2 9
Zhejiang 裂片石莼 Ulva f asciata 25 4 16
海 　水 Sea water 18 1 5
真丛柳珊瑚 Euplexaura curvata 24 6 25
珍珠膜海绵 Hymeniacidon perleve 29 8 28
海 　泥 Sediment 20 1 5
合 　计 Total 178 28 16
青岛、烟台 海 　水 Sea water 22 2 9
Qingdao 海 　泥 Sediment 17 1 6
and Yantai 海 　葵 Sea anemo 12 3 25
石 　鳖 Chiton 24 3 13
孔石莼 Ulva pertusa 25 2 8
叉枝藻 Gym nogongrus f labelli f ormis 18 1 6
鼠尾藻 Sargassum thunbergii 20 2 10
海 　带 L aminaria japonica 25 3 12
合 　计 Total 163 17 10
A :分离细菌数 Number of isolated bacteria (ind1) ;B :活性细菌数 Number of bioactive bacteria
(ind1) ;C :活性细菌比例 Percentages of bioactive bacteria ( %) . 下同 The same bleow.
53619 期 　　　　　　　　　　　　　郑 　立等 :海洋细菌抗菌和细胞毒活性的初步研究 　　　　　　　　　　　
表 4 　不同来源的活性细菌数量和比例
Table 4 Total number and percentages of bioactive bacteria isolated
from different region
来 　源 Origin A B C
海 　藻 Seaweed 175 20 11
无脊椎动物 Invertebrate 89 20 22
海 　水 Sea water 40 3 7
海 　泥 Sediment 37 2 5
某些物质 (如抗生素、毒素、抗病毒物质等) ,释放于
水体中 ,以利于宿主生长代谢或增强宿主的抵抗能
力. 在本实验中 ,来源于无脊椎海洋生物和海藻的附
生细菌具有相当高的活性细菌比例. 这个结果证明
了一些防御能力较差的动、植物能在海洋环境中存
活 ,除了自身具有的生存机制外 ,其附生微生物也扮
演着一定的保护性角色.
4 　结 　　语
本研究结果表明 ,在 42 株具有活性的细菌中 ,
来源于海洋生物的细菌中具有活性的比例高于来源
于非生命环境 (海水和海泥) . 因此 ,从这类微生物中
筛选活性物质具有巨大的潜力 ,并有望成为海洋抗
生素药物的重要来源. 进入 21 世纪 ,全世界都面临
着病原菌抗药性难题 ,抗肿瘤化疗药物的开发也是
近年的研究热点 ,使得寻找新的抗生素药物具有重
要意义. 目前 ,我们正在对其中几株活性较高的海洋
细菌的代谢产物进行研究 ,以期从中找到具有药物
价值的化合物.
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作者简介 　郑 　立 ,男 ,1976 年生 ,在读博士 ,从事海洋微生
物活性物质研究. E2mail :zhengli @ms. qdio. ac. cn ,zhenglijerry
@hotmail. com
6361 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷