全 文 ：Bt毒素在转基因棉花与土壤系统中的分布*
孙彩霞1, 2 陈利军1* * 武志杰1
( 1 中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳 110016; 2东北大学生物技术研究所,沈阳 110004)
摘要 研究了转 Bt基因棉花与土壤系统中 Bt 毒素的分布. 结果表明, 两种转 Bt基因棉花地上部(叶
片、茎秆)的毒素表达量( 1035~ 1341 ng!g- 1 )显著高于地下部分(根系) ( 447~ 21 2 ng!g- 1 ) , 土壤中
Bt 毒素总量可通过转基因棉花地上部分秸秆的处理得到控制; Bt 毒素在转 Bt 基因棉花根系分泌物中的
含量极低,如果控制 Bt毒素的其它导入来源,将显著降低转 Bt基因作物释放中因 Bt 毒素导入而引发的
对土壤生态系统的扰动.
关键词 Bt 毒素 转基因棉花 土壤 分布
文章编号 1001- 9332( 2005) 09- 1765- 04 中图分类号 S188 文献标识码 A
Bt toxin distribution in transgenic Bt cotton and soil system. SUN Caixia1, 2 , CHEN Lijun1, WU Zhijie1
( 1 I nstitute of App lied Ecology , Chinese A cademy of Sciences, Shenyang 110016, China; 2I nstitute of Biotech
nology, Nor theastern Univer sity , Shenyang 110004, China ) . Chin . J . A pp l. Ecol . , 2005, 16 ( 9) : 1765 ~
1768.
This study show ed that the amounts of Bt toxin expressed in tr ansgenic Bt cotton leaves and stems ( 103 5~
134 1 ng!g1) were rather higher than those expressed in transgenic Bt cotton r oots ( 447~ 212 ng!g1) , indi
cating that total amount o f soil Bt tox in introduced by transgenic Bt cotton could be decreased through tr eating its
aboveground biomass. In compar ing w ith the amount of Bt tox in expressed in tr ansgenic Bt cotton plant, that
expressed in its root exudates was rather low er , showing that the effects of plant Bt toxin on soil ecosystem would
be limited if other sources o f Bt toxin introduced into soil were controlled.
Key words Bt toxin, T ransgenic cotton, Soil, Distr ibution.
* 国家自然科学基金项目( 40101016)和中国科学院沈阳应用生态研
究所知识创新工程重大资助项目( SCXZD010402) .
* * 通讯联系人.
2004- 10- 18收稿, 2005- 02- 21接受.
1 引 言
转Bt基因作物是通过遗传工程技术表达外源
Bt基因而达到防治害虫目的的作物. 因其具有较高
的经济效益和生态效益, 已成为全球商品化最快的
抗虫转基因作物[ 2, 6, 7] . 在转 Bt基因作物种植全球
化的同时, 因其大规模释放而引发的安全性问题也
成为国际争论的焦点.主要集中在目标害虫抗性、非
目标生物的危害和对土壤生态环境影响等几个方
面[ 5, 31] .其中目标害虫抗性问题已经通过外源基因
高剂量表达和避难所等策略得到一定的治理[ 15] ; 通
过对转 Bt基因玉米花粉在农业生境中的散积状况
和花粉中 Bt毒素的表达量等方面深入系统的研究
并进行综合风险估算,结果表明转 Bt 基因作物对君
主斑蝶( Danaus p lex ippus)等非目标生物的危害微
乎其微[ 14, 22, 30] . 关于抗虫转基因作物释放对土壤生
态系统影响,学者们进行了转 Bt基因作物体内毒素
在不同遗传背景和环境条件下的表达特性[ 27, 32, 33]、
转 Bt基因作物秸秆在土壤中降解[ 11~ 13]及其对土
壤生物和土壤生态过程影响[ 3, 20, 23, 26, 28]的研究, 但
研究结果尚存争论且未提出治理策略. 本文将作物
和土壤作为一个体系, 研究 Bt 毒素在作物土壤系
统内的分布,以期探寻转 Bt基因作物释放生态风险
的评价指标及解决途径, 促进转基因作物产业的健
康持续发展.
2 材料与方法
2 1 供试材料
供试棉花为国内育成转 Bt基因棉花国抗 12( GK )、中抗
30( ZK )及非转 Bt基因棉花中棉所 30( CZ) . 盆栽温室种植.
供试土壤为棕壤, 土壤有机质含量为 2 52 g!kg - 1, pH 572,
全氮 1 22 g!kg- 1 , 全磷 ( P2O5 ) 112 g! kg - 1, 全钾 ( K 2O)
2424 g!kg- 1 ,碱解性氮 106 37 mg!kg- 1, 有效磷 1592 mg
!kg- 1 ,有效钾 14329 mg!kg- 1. 化肥作底肥一次施用,尿素
1 25 g/盆, KH2PO4 0 97 g/盆, 每盆装土 4 kg. 5 月初播种,
10 月末收获. 防治蚜虫 ( Aphis gossyp ii )、红蜘蛛 ( T etrany
chus cinnabar inus ) 2 次.其它栽培管理按照常规进行.分别在
棉花苗期、盛蕾期、盛花期、盛铃期、盛絮期取样并测定.每个
处理 3 次重复.
应 用 生 态 学 报 2005 年 9 月 第 16 卷 第 9 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Sep. 2005, 16( 9)∀1765~ 1768
22 测定方法
221 转Bt基因棉花不同组织中 Bt毒素的提取及测定 分
别在苗期、盛蕾期、盛花期、盛铃期、盛絮期采取棉花根系、茎
秆、叶片以及子叶、蕾、铃各 05 g,保存于- 80 # 冰箱中, 统
一时间提取. 冷冻样品在冰浴下研磨成匀浆, 4 # 下提取 4
h, 5 000 rpm 离心 15 min, 取上清液备用. 采用 ELISA 方法
测定, 试剂盒购于中国农业大学作物化控中心,酶标仪检测
波长 450 nm.
222 土壤中 Bt 毒素提取及测定 分别在苗期、盛蕾期、盛
花期、盛铃期、盛絮期将棉花植株从盆中取出,采集根际土壤
1 g, 加入 1 ml 1 倍 Cry1A ( b)提取液(美国 Envirologix 公司
生产) ,摇匀 , 4 # 下提取 4 h, 6 000 rpm 离心 15 min, 取上清
液,保存于- 80 # 冰箱中,统一时间测定. 采用 ELISA 方法
测定,试剂盒及试剂均购于美国 Envir ologix 公司, 酶标仪检
测波长 450 nm.
223 统计分析 差异显著性检验按 SPSS 110 提供的方
法进行.
3 结果与分析
31 Bt毒素在不同转 Bt 基因棉花各组织中的表
达量及分配
由图 1 可见, Bt毒素在转基因棉花叶片、茎秆
和根系中的表达均具有时间性, 随着棉株的生长发
育、成熟衰老而呈现下降的趋势,这可能是由于在棉
株体内的外源 Bt 基因随棉花生育期的推进而钝化,
表达量降低;或者棉花植株由营养生长进入生殖生
长后, 生长中心由营养器官转到生殖器官, Bt 毒素
在营养器官中的含量随之下降. Bt 毒素表达的这种
时间变化表明该外源基因的表达是受发育调控的,
这可能与外源基因的整合位点有关,当外源基因整
合到与生长发育有关的基因附近,其表达就会受生
长发育基因调控序列的调控[ 8, 21] .叶片中 Bt 毒素的
含量随生长发育时期的不同而发生变化的幅度比茎
秆和根系中的小,说明外源 Bt基因在叶片中表达相
对稳定. Bt 毒素含量在 2种转 Bt 基因棉花植株中
有所不同,转 Bt基因棉花 ZK叶片、茎秆、根系中 Bt
毒素含量呈现出高于 GK的趋势,说明形成不同转
基因棉花品种外源基因的转化作用不同. 转基因植
株中 Bt 毒素含量的变化也可能与转基因作物的栽
培措施和环境条件有关, 环境因子如温度、光照、水
分,栽培措施如施肥量, 都会引起外源基因表达变
化.束春娥等[ 24]报道暴雨能降低 Bt 杀虫蛋白的毒
性表达. Sachs等[ 16]研究发现, 同样的材料在同一生
育期、不同地点,由于管理条件不一样, Bt基因表达
量呈现较大差异.干旱胁迫可能影响转 Bt 玉米组织
图 1 不同生育时期转基因棉花叶片、茎秆和根系中的 Bt毒素表达
量
Fig. 1 Bt toxin contents in leaves, stems and roots f rom two t ransgenic Bt
cottons at diff erent plant grow th stages.
A:苗期 Seedling stage; B: 盛蕾期 Full squaring stage; C:盛花期 Full
flow ering stage; D: 盛铃期 Full boll stage; E: 盛絮期 Full boll opening
stage.下同 T he same below . a) 叶片 L eaves; b) 茎秆 Stems; c) 根系
Roots.
内杀虫晶体蛋白的表达及对欧洲玉米钻心虫的抗
性[ 29] . Bruns和 Abel[ 1]的研究表明, 在玉米生育前
期,氮肥的施用量可以影响转 Bt基因玉米植株体内
的杀虫晶体蛋白的表达量. 也有研究结果表明, 光照
加强会增加基因沉默产生的几率并影响基因沉默产
生的时间, 外界环境条件的改变可以使外源 DNA
甲基化程度发生变化, 进而引起外源基因表达的强
烈变化[ 8, 21] .
由图 2可见, Bt毒素含量在转基因棉花 GK 中
的顺序为茎秆> 叶片> 花蕾> 子叶> 铃絮> 根系,
在转基因棉花 ZK中的顺序为叶片> 茎秆> 花蕾>
子叶> 铃絮> 根系.结合图 1,两种转基因棉花地上
部分的 Bt 毒素含量( 1035~ 1341 ng!g- 1)显著高
于地下部分含量( 447~ 212 ng!g- 1) .按棉花植株
冠根比( 819~ 1431)估算[ 4, 9] , 棉花植株地上部分
的Bt毒素总量约为根系毒素总量的 848~ 1 919
倍,说明在转基因棉花的农业生产中,可以通过地上
部分秸秆的处理而有效地控制导入土壤 Bt 毒素的
总量. 在土壤中棉花根系较深, 下扎最深可达 200
cm , 转Bt基因棉花是否可通过深层根系导入Bt毒
1766 应 用 生 态 学 报 16卷
图 2 Bt 毒素在 2种转 Bt基因棉花不同组织中的分配
Fig. 2 Dist ribut ion of Bt toxin in different t issues from tw o t ransgenic Bt
cot tons.
1)子叶 Seed leaves; 2)叶片 Leaves; 3)茎秆 Stems; 4)花蕾 Flow ers and
squarings; 5)铃絮 Bolls an d bat ts; 6)根系 Roots.
素并对深层土壤的生态过程产生影响需进一步验证.
32 转 Bt基因棉花根际土壤中 Bt毒素含量变化
由图 3可知, 2种转 Bt 基因棉花盆栽种植的根
际土壤中均检测到 Bt 毒素. 转 Bt 基因棉花在苗期
和盛蕾期通过根系分泌物向土壤中导入 Bt毒素含
量明显高于生长发育后期. 这可能是转基因棉株根
系分泌物中外源基因与棉株地上部分均受发育调
控;也可能是由于盆栽试验的栽培管理过程中采取
淹灌方式补水并且在棉株生长发育需水量大的中期
补水次数增多, 导致根际土壤中的 Bt 毒素垂直运移
距离延长,淋洗量增加, 检测量减少,沿需进一步验
证.研究表明, 土壤中 Bt 毒素的垂直运移量与土壤
特性、地表径流量和强度、耕作措施、Bt 毒素含量等
因素有关[ 18] . Saxena等[ 17, 19]通过转 Bt 基因玉米盆
栽与大田实验证明, 根系分泌的 Bt毒素很快被土壤
中的表面活性颗粒吸附, 并保持杀虫活性 180 d 以
上.导入土壤中的 Bt毒素能被结合到土壤中的表面
活性颗粒不易被微生物降解, 仍保持杀虫活性,导致
Bt毒素累积,从而使土壤的特异生物功能类群以及
土壤生物多样性改变[ 25] . 因而转 Bt 基因作物释放
后,导入土壤中 Bt毒素的生物活性是评价其环境及
对土壤环境潜在风险的最重要参数[ 10] .
图 3 盆栽棉花根际土壤中的 Bt 毒素含量变化
Fig. 3 Soil Bt toxin content at diff erent cot ton growth stages.
不同字母为不同处理间差异显著性检验结果 Different let ters on the
columns represent a significant diff erence at 5% level.
4 结 论
41 Bt基因在受体植株体内的表达受转化方法及
环境等多种因素的影响, 较为复杂, 品种间差异显
著. Bt毒素在转 Bt基因棉花中表达量的时空动态
变化可能是由于基因表达的发育调控和外界环境因
素相互作用的结果,其分子机理有待深入研究. 从农
业生产的作物环境栽培措施的角度考虑, 可通过
转基因作物配套栽培措施的研究, 选择最适宜外源
基因表达的栽培措施及环境条件, 从而实现转基因
作物栽培的最大经济效益和生态效益.
42 Bt毒素的环境去向是转 Bt 基因作物田间释
放生态风险评价的核心问题. Bt 毒素导入土壤环境
的途径包括花粉飘散、枯枝落叶秸秆残茬降解及根
系分泌物.转 Bt 基因棉花地上部分如叶片、茎秆中
毒素含量显著高于地下部分根系,因而土壤中 Bt毒
素的总量可通过其导入的转基因棉花秸秆而得到控
制.与转 Bt 基因棉花植株体内含量比较, Bt 毒素在
其根系分泌物中的含量极低,说明如果向环境中导
入 Bt毒素的其它来源得到控制, 将有效降低转 Bt
基因作物释放中因 Bt 毒素导入而引发的对土壤生
态系统的扰动.
43 研究结果表明,转 Bt基因作物种植后, 原有土
壤生态环境发生了一定程度上的响应, 但尚没有确
定转 Bt基因作物引起土壤环境变化的原因是 Bt毒
素本身, 还是外源基因的插入导致受体植物生理生
化特性的改变.基因操作过程可能使受体植物的基
因表现插入失活或者因为非等位基因间的互补、修
饰、共抑制等作用,在一定程度上影响原有基因的表
达,改变转基因植物的某些生理特性并影响该转基
因植物与其它动植物和微生物的关系, 进而影响原
有生态系统结构和功能.今后,应将外源基因在转基
因植物中的分布、行为和可能的功能,尤其是外源基
因的非目标效应作为转基因生物安全性研究的一个
重要内容.
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作者简介 孙彩霞, 女, 1973 年生, 博士后, 副教授. 主要从
事植物逆境生理和转基因生物安全方面的研究, 发表论文
16 篇. Email: suncaixia@ hotmail. com
1768 应 用 生 态 学 报 16卷