全 文 ：高黎贡山旱冬瓜 Fra nkia 的 IGS PCR2RFL P 分析 3
代玉梅　曹　军　唐晓萌　张成刚 3 3
(中国科学院沈阳应用生态研究所 , 沈阳 110016)
【摘要】　在云南省高黎贡山自然保护区海拔 1 310～2 400 m 的范围内 ,采集 30 个旱冬瓜根瘤样品 ,直接
从根瘤中提取 Frankia DNA ,对其 nif D2nif K 基因间隔区 (intergenic spacer , IGS) 和 16S223S rDNA IGS 进
行 PCR2RFL P 分析. 结果表明 , nif D2nif K IGS的 PCR 产物长度差异很大 ,经 Hae Ⅲ和 A f a Ⅰ双酶切后 ,得
到 15 种酶切带型 ,检测到多种基因型的菌株同时与同一株宿主植物共生 ;16S223S rDNA IGS的 PCR 产物
长度相似 ,酶切后亦区分出 15 种酶切带型. 通过对两个基因间隔区的 PCR2RFL P 联合分析 ,发现高黎贡
山旱冬瓜 Frankia 存在 20 种基因型.
关键词 　Frankia 基因型 　高黎贡山 　IGS 　PCR2RFL P
文章编号 　1001 - 9332 (2004) 02 - 0186 - 05 　中图分类号 　Q939. 13 　文献标识码 　A
Diversity of Frankia in nodules of Alnus nepalensis at Gaoligong mountains revealed by IGS PCR2RFLP analy2
sis. DAI Yumei , CAO J un , TAN G Xiaomeng , ZHAN G Chenggang ( Institute of A pplied Ecology , Chinese A2
cademy of Sciences , S henyang 110016 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2004 ,15 (2) :186～190.
30 nodule samples were used to assess the diversity of Frankia strains symbiotically associated with A lnus
nepalensis naturally occurring at the Gaoligong Mountains in Yunnan Province , China. DNA was extracted di2
rectly from nodules , and its two target DNA regions that encode nif D2nif K intergenic spacer ( IGS) and 16S2
23S rDNA IGS was studied by PCR2RFL P. The PCR fragments yielded by the nif D2nif K IGS were noticeably
different in size , and when they were digested by Hae Ⅲand A f a Ⅰ, 15 nif2type Frankia strains could be de2
tected , the PCR2RFL P result of this region also could show that more than one genotype Frankia strains could
form symbiosis with individual plants at the same time. The 16S223S rDNA IGS had similar PCR fragments , but
still identified 15 rrn2type strains after digested by Hae Ⅲand A f a Ⅰ. 20 genotype strains could be found only
when combined the PCR2RFL Ps of two target regions.
Key words 　Genotype of Frankia , Gaoligong Mountains , IGS PCR2RFL P.
3 国家重点基础研究发展规划资助项目 (001CB1089) .3 3 通讯联系人.
2003 - 06 - 18 收稿 ,2003 - 08 - 18 接受.
1 　引 　　言
旱冬瓜 ( A l nus nepalensis) 是桦木科桤木属的
落叶乔木 ,在云南省高黎贡山整个山体海拔 2 400
m 以下有普遍分布[3 ] . 旱冬瓜生长迅速 ,可改善土
壤肥力 ,促进生态恢复 ,同时其木材用途广泛 ,因此
具有重要的生态和经济价值[3 ] . 旱冬瓜的这些特性
与其根瘤内的放线菌 Frankia 为其提供丰富的氮源
是分不开的. 不同基因类型的 Frankia 有不同的侵
染能力和固氮效率 [11 ] . 探明与旱冬瓜共生的
Frankia 的基因类型 , 可为今后开展旱冬瓜2
Frankia 的协同进化、最适共生以及提高其固氮效
率等方面研究奠定基础.
Frankia 基因多样性的研究方法很多 ,如 RFL P
( rest riction fragment length polymorphism) 、RAPD
(randomly amplified polymorphic DNA) 、REP2PCR
(repeated sequence PCR) 、PCR2RFL P 等 [2 ,4 ] . 其中 ,
最后一种方法以特异性引物扩增目的基因 ,避免了
对可能混入的宿主植物、其它共生菌或污染菌 DNA
的扩增 ,因此可以直接对来源于根瘤的 Frankia 菌
株进行研究[1 ,2 ,4 ,8 ,10 ,12 ] .
在云南省高黎贡山国家级自然保护区海拔
1 310～2 400 m 的范围内 ,采集旱冬瓜根瘤样品 30
个 ,直接从根瘤中提取 Frankia DNA ,对其 nif D2
nif K 基因间隔区 ( intergenic spacer , IGS) 和 16S2
23S rDNA IGS 进行 PCR2RFL P 分析 ,以便准确地
查明高黎贡山旱冬瓜 Frankia 基因的多样性.
2 　研究地区与研究方法
211 　自然概况
高黎贡山位于云南省西部与缅甸北部交界 (24°34′～28°
22′N)处 ,具有独特的地质条件和生态环境 ,生物资源极为丰
富 ,且富含古老和孑遗类型 ,是进行生物起源及多样性研究
的理想地区[3 ] .
高黎贡山国家自然保护区位于高黎贡山的南段 ,山势陡
峭 ,峰谷南北相间排列 ,具有极典型的高山峡谷自然地理垂
应 用 生 态 学 报 　2004 年 2 月 　第 15 卷 　第 2 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Feb. 2004 ,15 (2)∶186～190
直带景观和丰富多样的动植物资源. 东西坡海拔 1 600～
2 800 m 的地区是自然保护区的主体 ,连接东喜马拉雅区 ,
组成了我国引人瞩目的原始阔叶林区 [3 ] .
212 　研究方法
21211 根瘤 　根瘤在海拔 1 300～2 400 m 处采集 (表 1) . 采
集到的根瘤经晾干后 ,在220 ℃条件下储存 ,备用.
表 1 　采集的根瘤样品
Table 1 Nodule samples and their locations
编号
No.
纬度
Latitude
经度
Longitude
海拔
Elevation
(m)
An01 24°56′06″ 98°34′98″ 2010
An02 24°54′92″ 98°36′47″ 1580
An03 24°50′79″ 98°45′10″ 1990
An04 24°50′79″ 98°45′11″ 2000
An05 24°49′46″ 98°46′72″ 2020
An06 24°49′46″ 98°46′72″ 2020
An07 24°48′26″ 98°47′56″ 1890
An08 24°48′27″ 98°47′55″ 1870
An09 24°48′27″ 98°47′55″ 1870
An10 24°48′11″ 98°47′73″ 1930
An11 24°48′10″ 98°47′73″ 1950
An12 24°48′04″ 98°47′74″ 1990
An13 24°48′08″ 98°47′74″ 2030
An14 24°48′07″ 98°47′74″ 2030
An15 24°48′05″ 98°47′76″ 1990
An16 24°48′05″ 98°47′78″ 2000
An17 25°01′27″ 98°40′77″ 1310
An18 24°58′54″ 98°43′83″ 2020
An19 24°58′38″ 98°43′76″ 2010
An20 24°58′38″ 98°43′76″ 2010
An21 24°58′41″ 98°43′75″ 2080
An22 24°58′41″ 98°43′75″ 2120
An23 24°58′41″ 98°43′75″ 2120
An24 24°58′41″ 98°43′75″ 2120
An25 24°58′38″ 98°43′70″ 2320
An26 24°58′37″ 98°43′69″ 2350
An27 24°58′37″ 98°43′69″ 2360
An28 24°58′37″ 98°43′69″ 2400
An29 24°58′48″ 98°43′77″ 2020
An30 24°59′52″ 98°37′78″ 2050
An :旱冬瓜 A lnus nepalensis .
21212 DNA 提取 　取 - 20 ℃冷藏的根瘤 0. 1 g ,洗净 ,用
30 %过氧化氢表面消毒后 ,磨碎 ,加 CTAB 提取液 ( 2 %
CTAB , 100 mmol·L - 1 Tris , 20 mmol·L - 1 EDTA , 1. 4 mol·
L - 1 NaCl , 1 % PVP) 1 000μl ,在 65 ℃孵育 2 h. 用氯仿和异
戊醇 (24∶1)抽提 2 次 ,用 1/ 10 体积 3 mol·L - 1的乙酸钠和 1
倍体积冰乙醇沉淀 DNA. DNA 沉淀经乙醇洗涤 2 次后 ,去离
子水溶解. 加等体积的 PEG2NaCl 混合液 ( 20 %聚乙二醇
8000MW ,2. 5 mol·L - 1 NaCl)于 DNA 溶解液中进行纯化 ,37
℃保温 15 min 后离心. DNA 沉淀用乙醇洗涤 2 次 ,去离子水
溶解后 ,置于220 ℃,备用[9 ] .
213 　PCR 扩增
　　选择 Frankia 的特异性引物 FGPD807285 (5′2CACTGC2
TACCGGTCGATGAA2 3′) 和 FGPK333′2355 ( 5′2CCGGGC2
GAAGTGGCT 2 3′)对 nif D2nif K IGS区段进行扩增 ,扩增片段
包括 nif D 3′端、IGS、nif K 5′端[4 ] ;选择侵染 Alnus2Casuarina
的 Frankia 的 特 异 性 引 物 FGPS989ac ( 5′2GGGGTCCG2
TAAGGGTC2 3′) 和 FGPL132′(5′2CCGGGTTTCCCCATTCGG
2 3′)扩增 16S223S rDNA IGS ,扩增片段包括 16S 3′端、IGS、23S
5′端[10 ] .
　　PCR 扩增反应在 Whatman 公司温度梯度扩增仪上进
行. 50μl 体系中包括 :DNA 模板 5～10 ng ,Mg2 + 2. 5 mmol·
L - 1 ,dN TP 0. 2 mmol·L - 1 ,引物各 0. 2μmol·L - 1 ,exTaqD2
NA 聚合酶 1. 5 U ( Ta KaRa 公司) . PCR 反应在 95 ℃预变性
5 s 后 ,进行以下 35 个循环 : 95 ℃变性 30 s ,58 ℃( nif D2
nif K IGS)或者 50 ℃(6S223S rDNA IGS) 退火 30 s ,72 ℃延
伸 2 min ,最后在 72 ℃下延伸 5 min. 0. 8 %琼脂糖电泳检测 ,
产物于 - 20 ℃储存备用.
214 　限制性内切酶酶切
　　对 5μl ( nif D2nif K IGS) 或 10μl (16S223S rDNA IGS)
PCR 产物进行 Hae Ⅲ和 A f a Ⅰ( TakaRa 公司) 双酶切 12 h.
酶切反应严格按照供应商提供的说明书进行. 取 5μl 酶切产
物在 Bio2RAD Mini2PRO TEAN ⅡVertical Gel System 上进行
15 %聚丙烯酰胺 ( PA G)电泳 ,然后胶银染.
215 　数据处理
　　胶片用 Bio2RAD 的凝胶成像系统拍照 ,Quantity one 软
件判读酶切条带的分子量 ,并转化为二元性状编码. 编码用
Phytool 1. 2 Jaccard 联合系数[13 ]计算出相似性.
3 　结果与讨论
311 　nif D2nif K IGS 的 PCR2RFL P 分析
　　27 个样品获得 nif D2nif K IGS 的 PCR 产物 ,琼
脂糖电泳图谱见图 1. PCR 产物长度在 1 100～
1 500 bp 之间 ,差异显著. 5 个样品 (An02、An09、
An10、An13、An17) 的片段长度为 1 350 bp 左右 ;4
个样品 (An06、An07、An19、An25) 的片段长度略短
于前述样品 ,在 1 250～1 320 bp 之间 ; 12 个样品
( An01、An03、An04、An08、An11、An15、An18、
An20、An22、An24、An26、An30)的片段长度为1 170
bp 左右 ;样品 An05 的片段长度为 1 100 bp 左右. 5
个样品的 PCR 产物为多片段 , An16、An29 有 1 350
和 1 170 bp 2 个片段 ,An14、An27、An28 在 1 250～
1 500 bp 之间有 3～4 个片段. Lumini[4 ]应用相同引
物对赤杨 Frankia 纯培养结果表明 ,侵染赤杨属不
同树种的 Frankia 菌株的 nif D2nif K IGS 扩增产物
在长度上表现出显著差异 ,而我们的实验则进一步
揭示 ,侵染同种赤杨 ( A . nepalensis) 的 Frankia 也
有不同长度的片段 ,并发现 5 个样品的 PCR 产物为
多片段. 因未见 Frankia 菌株的基因组中含有多拷
贝 nif D 或 nif K 基因的报道[4 ,5 ,8 ,10 ] ,可以认为多片
段现象是不同基因型 (具有不同 nif D2nif K IGS 长
度)的 Frankia 菌株与同一株植物同时共生所致.
PCR 产物经 Hae Ⅲ和 A f a Ⅰ双酶切后 ,可得 15
种酶切带型 ( nif2type) ,见图 2. 各带型间的相似性
7812 期 　　　　　　　　　　　代玉梅等 :高黎贡山旱冬瓜 Frankia 的 IGS PCR2RFL P 分析 　　　　　　　　
最大为 94. 1 % ,最小为 9. 5 % ,平均为 43. 5 % (表
3) . 相同长度的 PCR 产物经酶切后有相同或相似的
带型 ;不同长度的 PCR 产物酶切带型差异较大. 值
得注意的是 ,An16、An29 的 nif2type 图谱 Ⅻ中有图
谱Ⅳ( PCR 产物为 1 350 bp) 以及图谱 Ⅰ或 Ⅱ( PCR
产物为 1 170 bp) 的酶切条带. 初步认定 , nif2type
IX与 nif2type Ⅰ或 nif2type Ⅱ的 Frankia 菌株同时
存在于 An16 与 An29 这两个样品中. 经过下面 312
的 16S223S rDNA PCR2RFL P 分析后可确定 ,是基
因型为 nif2type Ⅱ与 nif2type Ⅳ的 Frankia 菌株同
时与同一宿主植株共生. 同样 ,样品 An14、An27、
An28 也被多种基因型 Frankia 菌株所侵染 ,但很难
确定这些菌株的基因型. 一方面可能是我们所采集
的样品还不能包括高黎贡山所有的 Frankia 的基因
型 ,因而未能检测到侵染这 3 个样品的菌株独自侵
染一株宿主植物的状态 (表现为 nif D2nif K IGS 的
PCR 产物为单一片段) ;另一方面 ,也可能是存在于
这 3 个样品中的 Frankia 菌株并不能单独侵染一株
植物 ,在其它基因型菌株存在时才能侵染宿主植物 ,
如长度为 1 500 bp 左右的片段只能在这 3 个样品中
找到. 当然无论哪种可能性 ,都需要对高黎贡山的
Frankia 资源做进一步调查 ,以便揭示多种基因型
菌株与同一宿主植株共生的实质.
图 1 　Frankia nif D2nif K IGS PCR 扩增产物的电泳图谱
Fig. 1 Electrophoresis of PCR2amplified Frankia nif D2nif K IGS.
泳道 Lane 1、12、25、31 : GeneRuler TM 100 bp DNA ladder plus ( Fermantas) ;泳道 Lane 2～11 :An03、An08、An15、An20、An01、An04、An18、An22、
An24、An26 ;泳道 Lane 13～24 : An10、An16、An29、An02、An09、An05、An06、An07、An17、An13、An30、An19 ;泳道 Lane 26～30 : An14、An28、
An27、An25、An11.
图 2 　nif D2nif K IGS 的 Hae Ⅲ和 A f a Ⅰ的双酶切带谱
Fig. 2 Restriction pattern of nif D2nif K IGS after digestion with Hae Ⅲand A f a Ⅰ.
从左至右样品依次为 From left to right the samples :An03、An04、An11、An30、An05、An09、An13、An06、An07、An10、An02、An19、An16、An29、
An14、An27、An28. M : GeneRuler TM 50 bp DNA ladder ( Fermantas) .
312 　16S223S rDNA IGS 的 PCR2RFL P 分析
26 个样品获得了 16S223S rDNA IGS 的 PCR
产物 ,经琼脂糖电泳分析 ,均显示为 1 100 bp 左右的
单一片段 ,部分样品见图 3. 这些样品的 16S223S
rDNA IGS PCR 产物长度差别不大 ,但其 nif D2
nif K IGS 的 PCR 产物或在长度上差异显著或为出
现多片段现象 (图 1) . Frankia 的基因组中含有 2 个
拷贝的 rDNA 操纵子[6 ,7 ] ,但本实验与应用相同引
物的其它研究都未发现 2 个拷贝的 16S223S rDNA
IGS 长度存在不同[7 ,10 ] .
　　16S223S rDNA IGS PCR 产物经 Hae Ⅲ和 A f a
Ⅰ双酶切后 ,也得到 15 种酶切带型 ( rrn2type) ,各
带型间的相似性最大为 90. 9 % ,最小为 31. 3 % ,平
均为 57. 6 % (表 4) . 带型间的平均相似性大于
881　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
nif D2nif K IGS 的酶切带型间的相似性 ,说明 nif D2
nif K IGS 具有更大的差异.
图 3 　Frankia 16S223S rDNA IGS PCR 扩增产物的电泳图谱
Fig. 3 Electrophoresis of PCR2amplified Frankia 16S223S rDNA IGS.
泳道 Lane 1、10 : GeneRuler TM 100 bp DNA ladder plus( Fermantas) ,泳
道 Lane 228 :An18、An24、An15、An17、An16、An10、An08、An29. 表 2 　nif D2nif K与 16S223S rDNA IGS的酶切带型Table 2 Restriction pattern of nif D2nif K IGS and 16S223S rDNA IGSnif D2nif K IGS的酶切带型nif2type 样品Samples 16S223SIGS 的酶切带型rrn2type 样品SamplesⅠ An03、An08、An15、 Ⅰ An03、An08、An20、An30 An15、An20Ⅱ An01、An04、An18、 Ⅱ An01、An04、An10、An18、An22、An24、An26 An21、An22、An24、An26Ⅲ An11 Ⅲ An11Ⅳ An05 Ⅳ An05Ⅴ An09 Ⅴ An09、An13Ⅵ An13 Ⅵ An12Ⅶ An06 Ⅶ An06Ⅷ An07 Ⅷ An07Ⅸ An10、An17 Ⅸ An17Ⅹ An02 Ⅹ An02Ⅺ An19、An25 Ⅺ An19Ⅻ An16、An29 Ⅻ An16Ý An14 Ý An29Þ An27 Þ An23ⅩⅤ An28 ⅩⅤ An30
图 4 　16S223S rDNA IGS 的 Hae Ⅲ和 A f a Ⅰ的双酶切带谱
Fig. 4 Restriction pattern of 16S223S rDNA IGS after digestion with Hae Ⅲand A f a Ⅰ.
从左至右样品依次为 From left to right the samples :An03、An04、An06、An10、An12、An13、An05、An07、An09、An30、An29、An26、An17、An16、
An01、An02、An11、An23、An19. M : GeneRuler TM 50 bp DNA Ladder ( Fermantas) .
表 3 　nif D2nif K IGS的酶切带型的相似性
Table 3 Similarities on restriction pattern of nif D2nif K IGS
nif2type Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ Ⅺ Ⅻ ⅩⅢ ⅩⅣ ⅩⅤ
Ⅰ 1. 000
Ⅱ 0. 692 1. 000
Ⅲ 0. 400 0. 500 1. 000
Ⅳ 0. 118 0. 118 0. 125 1. 000
Ⅴ 0. 368 0. 300 0. 316 0. 095 1. 000
Ⅵ 0. 263 0. 143 0. 211 0. 167 0. 647 1. 000
Ⅶ 0. 400 0. 313 0. 333 0. 200 0. 389 0. 278 1. 000
Ⅷ 0. 222 0. 158 0. 167 0. 188 0. 300 0. 263 0. 500 1. 000
Ⅸ 0. 375 0. 294 0. 313 0. 118 0. 733 0. 600 0. 313 0. 222 1. 000
Ⅹ 0. 353 0. 278 0. 294 0. 111 0. 800 0. 667 0. 294 0. 211 0. 917 1. 000
Ⅺ 0. 313 0. 313 0. 250 0. 200 0. 190 0. 211 0. 538 0. 500 0. 235 0. 222 1. 000
Ⅻ 0. 688 0. 588 0. 368 0. 143 0. 632 0. 450 0. 368 0. 227 0. 688 0. 647 0. 300 1. 000
ⅩⅢ 0. 333 0. 273 0. 286 0. 136 0. 600 0. 429 0. 500 0. 474 0. 647 0. 611 0. 500 0. 571 1. 000
ⅩⅣ 0. 350 0. 286 0. 238 0. 143 0. 550 0. 450 0. 529 0. 421 0. 588 0. 556 0. 529 0. 600 0. 833 1. 000
ⅩⅤ 0. 400 0. 333 0. 227 0. 136 0. 524 0. 429 0. 500 0. 400 0. 556 0. 526 0. 500 0. 650 0. 789 0. 941 1. 000
　　结合 nif D2nif K IGS 的 PCR2RFL P 分析 ,基本
上相同或相似的 nif2type 的样品有相同或相似的
rrn2type ,不同的 nif2type 样品有不同的 rrn2type ,
但 An10、An17 有相同的 nif2type ,可 rrn2type 的相
似性却只有 31. 3 % ,An11、An19 的 nif2type 相似性
为 20 % , rrn2type 却有 83. 3 %的相似性. 由于样品
An16、An29 的图谱中含有 rrn2type Ⅱ的酶切条带 , 因此可以推断具有 rrn2type Ⅱ、nif2type Ⅱ( nif2typeⅡ菌株有相同 rrn2type Ⅱ) 的 Frankia 菌株是侵染样品 An16、An29 的两种菌株之一 ,而另一种菌株的两个样品不同 ,是具有相同 nif2type Ⅸ,不同 rrn2type (分别与 Ⅴ、Ⅸ相似 ,但不包含其全部酶切条带)的 Frankia 菌株. An14、An27 和 An28 得到了多片段的 nif D2nif K IGS PCR 产物 ,却未能得到 16S2
9812 期 　　　　　　　　　　　代玉梅等 :高黎贡山旱冬瓜 Frankia 的 IGS PCR2RFL P 分析 　　　　　　　　
23S rDNA IGS 的 PCR 产物 ,可能是由于扩增后的
引物所需的反应条件更为严格 ,而侵染这 3 个样品
的菌株状况复杂 ,干扰了引物与 DNA 模板结合 ,所
以未能得到相应的 PCR 产物.
表 4 　16S223S IGS的酶切带型的相似性
Table 4 Similarities on restriction pattern of 16S223S rDNA IGS
nif2type Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ Ⅺ Ⅻ Ý Þ ⅩⅤ
Ⅰ 1. 000
Ⅱ 0. 538 1. 000
Ⅲ 0. 833 0. 538 1. 000
Ⅳ 0. 500 0. 462 0. 615 1. 000
Ⅴ 0. 375 0. 538 0. 467 0. 500 1. 000
Ⅵ 0. 615 0. 583 0. 615 0. 538 0. 400 1. 000
Ⅶ 0. 467 0. 429 0. 467 0. 500 0. 375 0. 615 1. 000
Ⅷ 0. 438 0. 400 0. 533 0. 571 0. 643 0. 467 0. 438 1. 000
Ⅸ 0. 400 0. 583 0. 500 0. 538 0. 909 0. 429 0. 400 0. 692 1. 000
Ⅹ 0. 400 0. 462 0. 500 0. 429 0. 750 0. 333 0. 313 0. 571 0. 818 1. 000
Ⅺ 0. 833 0. 538 0. 833 0. 500 0. 375 0. 750 0. 571 0. 438 0. 400 0. 400 1. 000
Ⅻ 0. 500 0. 900 0. 500 0. 429 0. 615 0. 538 0. 400 0. 467 0. 667 0. 538 0. 500 1. 000Ý 0. 467 0. 818 0. 467 0. 400 0. 692 0. 500 0. 375 0. 438 0. 615 0. 500 0. 467 0. 909 1. 000Þ 0. 313 0. 357 0. 400 0. 429 0. 500 0. 333 0. 615 0. 375 0. 429 0. 333 0. 313 0. 333 0. 400 1. 000
ⅩⅤ 0. 818 0. 500 0. 818 0. 462 0. 333 0. 583 0. 429 0. 400 0. 357 0. 462 0. 818 0. 462 0. 429 0. 267 1. 000
313 　联合分析确定 Frankia 的基因型
　　从 PCR 产物长度以及酶切带型的相似性看 ,
nif D2nif K IGS 显示出更大的差异 ,并可直接检测
到多种基因型与同一宿主植株同时共生的状况.
16S223S rDNA IGS 的 PCR 产物无显著差异 ,但酶
切后仍可检测出 15 种酶切型 ,同时有相同 nif2type
菌株 ,可能有不相同的 rrn2type ;反之 ,有相同的
rrn2type 菌株 ,也可能有不同的 nif2type ,因此只有
把 nif D2nif K IGS 和 16S223S rDNA IGS PCR2
RFL P 类型联合起来分析 ,才能更准确地区分出不
同基因型菌株. 经过 16S223S rDNA IGS 的 PCR2
RFL P 分析后确定的具有 nif2type Ⅱ的 Frankia 菌
株 ,侵染 An16、An29.
　　把不能具有完全相同 nif2type 和 rrn2type 的
Frankia 菌株定为不同的基因型 ,那么 23 个可得到
2 种目的区段 PCR 产物的样品就可以区分出 15 种
基因型 (为讨论方便 , An16、An29 定为两种基因
型) . An25 与 An21 只得到一种目的区段 PCR 产物 ,
但它们在上述 15 种基因型中可以找到具有相同
nif2type 或 rrn2type 的菌株 ,所以侵染这两个样品
的基因型已包括在上述 15 种基因型中. An12、An23
虽未得到 nif D2nif K IGS 的 PCR 产物 ,但由于其
rrn2type 不同于上述 15 种基因型的 rrn2type ,因此
无论其 nif2type 为何种类型 ,都可定为 2 种新基因
型. An14、An27 和 An28 定为 3 种基因型. 30 个样
品总计可区分出 20 种基因型的 Frankia 菌株.
4 　结 　　论
　　经过对高黎贡山旱冬瓜 Frankia 的 nif D2nif K
IGS 和 16S223S rDNA IGS 进行 PCR2RFL P 分析 ,
发现前一基因间隔区的差异更大 ,但二者均得到 15
种酶切带型. 经联合分析后 ,确定 30 个根瘤样品存
在 20 种基因型 Frankia 菌株 ,其中 5 个样品被检测
到不同基因型菌株与同一株植物同时形成共生 ,说
明高黎贡山旱冬瓜 Frankia 具有丰富而复杂的基因
多样性.
参考文献
1 　Hahn D ,Nickel A ,Dawson J . 1999. Assessing Frankia populations in
plants and soil using molecular methods. Microbiol Ecol ,29 :215～227
2 　Huguet V ,Batzli J , Zimpfer J . 2001. Diversity and specificity of
Frankia strains in nodules of sympatric Myrica gale , A lnus in2
cana ,and S hepherdia canadensis determined by rrs gene polymor2
phism. A ppl Envi ron Microbiol ,67 (5) :2116～2122
3 　L I H(李　恒) , Guo H2J (郭辉军) ,Dao Z2L (刀志灵) . 2000. Flo2
ra of Gaoligong Mountains. Beijing : Science Press. (in Chinese)
4 　Lumini E , Bosco M. 1999. Polymerase chain reaction2restriction
fragment length polymorphisms for assessing and increasing biodi2
versity of Frankia culture collections. Can J Bot ,77 (9) : 1261～
1269
5 　Nalin R ,Normand P , Simonet P. 1999. Polymerase chain reaction
and hybridization on DNA extracted from soil as a tool for Frankia
spp . population distribution studies in soil. Can J Bot ,77 (9) :1239
～1247
6 　Normand P ,Cournoyer B ,Simonet P. 1992. Analysis of a ribosomal
RNA operon in the actinomycete Frankia. Gene ,111 :119～124
7 　Pereze N ,Olivera H ,Vasquez L . 1999. Genetic characterization of
Mexican Frankia strains nodulating Casuarina equisetif olia. Can
J Bot ,77 (9) :1214～1219
8 　Ritchie N ,Myrold D. 1999. Geographic distribution and genetic di2
versity of Ceanothus2infective Frankia strains. A ppl Envi ron Mi2
crobiol ,65 :1378～1383
9 　Ritchie N , Myrold D. 1999. Phylogenetic placement of uncultured
Ceanothus microsymbionts using 16S rRNA gene sequences. Can J
Bot ,77 (9) :1208～1213
10 　Rouvier C , Prin Y , Reddell P. 1996. Genetic diversity among
Frankia strains nodulating members of the family Casuarinaceae in
Australia revealed by PCR and restriction fragment length polymor2
phism analysis with crushed root nodules. A ppl Envi ron Microbi2
ol ,62 :979～985
11 　Simonet P , Navarro E , Rouvier C. 1999. Co2evolution between
Frankia populations and host plants in the family Casuarinaceae
and consequent patterns of global dispersal. Envi ron Microbiol , 1
(6) : 525～533
12 　Wu S2H (吴少惠) , Zhang H2W (张惠文) , Xiong Z (熊 　智) .
2001. Biodiversity of Frankia strains in nodules from A lnus and
Hippophae by ARDRA. Chin J A ppl Ecol (应用生态学报) , 12
(6) :883～886 (in Chinese)
13 　Zou Y2P(邹喻苹) , Ge S (葛 　颂) , Wang X2D (王晓东) . 2001.
Molecular Fingerprint in Systematic and Evolution Botany. Beijing :
Science Press. (in Chinese)
作者简介 　代玉梅 ,女 ,1976 年生 ,博士 ,主要从事固氮放线
菌分子生态学方面的研究. E2mail :daysindy @sina. com
091　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷