全 文 ：转枯草芽孢杆菌植酸酶基因烟草对不同介质中
植酸磷的吸收利用 3
孔凡利1 　林文量2 　严小龙1 　廖　红1 3 3
(1 华南农业大学根系生物学研究中心 ,广州 510642 ; 2 香港大学动物科学系 ,香港)
【摘要】　利用转入枯草芽孢杆菌植酸酶基因的不同烟草株系 ,分别在无菌培养基、砂培和土培试验中研究
了转植酸酶基因烟草对植酸磷的吸收和利用. 结果表明 ,在无菌培养基试验中 ,所有转植酸酶基因烟草对
植酸磷的吸收利用能力均显著高于野生型 ,其生物量比野生型提高了 3. 6～10. 7 倍 ,总磷吸收量提高了
2. 2～4. 6 倍 ;在沙培和土培中 ,转植酸酶基因烟草对植酸磷的吸收利用与野生型相比 ,生物量和总磷吸收
量差异不显著. 这说明转植酸酶基因在无菌条件下可以提高植物吸收利用植酸磷的能力 ,但是在自然条件
下 ,由于微生物分解或矿物固定等原因 ,其作用不稳定 ,需要进一步研究克服土壤中的限制因素 ,才能使转
基因植物充分发挥作用.
关键词 　枯草芽孢杆菌 　转基因植物 　植酸酶 　植酸 　磷吸收利用 　烟草
文章编号 　1001 - 9332 (2005) 12 - 2389 - 05 　中图分类号 　Q945. 79 　文献标识码 　A
Phytate2phosphorus uptake and utilization by transgenic tobacco carrying Bacillus subtilis phytase gene. KON G
Fanli1 ,L IN Wenliang2 , YAN Xiaolong1 ,L IAO Hong1 (1 Center of Root Biology , South China A gricultural U ni2
versity , Guangz hou 510642 , China ; 2 Depart ment of Botany , U niversity of Hong Kong , Hong Kong) . 2Chin.
J . A ppl . Ecol . ,2005 ,16 (12) :2389～2393.
Phytate is the major form of organic phosphorus in soil. Elevating the phytase activity in transgenic plants may be
an effective approach to promote their phytate2phosphorus utilization ,but little is known about the applied condi2
tions. In this study ,several transgenic tobacco lines carrying B acillus subtilis phytase gene were compared with
wild2type tobacco ,in terms of their ability in acquiring phosphorus from phytate in sterilized agar ,sand and soil.
In sterilized agar ,transgenic tobacco plants were more efficient in phytate2phosphorus uptake and utilization ,and
their biomass and total phosphorus content were 3. 6～10. 7 and 2. 2～4. 6 fold of the wild2type’s ,respectively.
In sand and soil systems ,however ,there were no significant differences in biomass and total phosphorus content
between the trsansgenic and wild2type tobacco plants. These results indicated that B acillus phytase transgene
could only improve the phytate2phosphorus uptake by transgenic plants under sterilized condition ,and its effec2
tiveness might be limited under natural conditions because of microbial decomposition and mineral fixation.
Therefore ,further research is needed to understand the limiting factors on the functions of the transgene.
Key words 　B acillus subtilis , Transgenic plant , Phytase , Phytate , Phosphorus uptake and utilization , Tobac2
co. 3 国家教育部霍英东青年教师基金资助项目 (91026) .3 3 通讯联系人. Tel :020285283380 ; E2mail :hliao @scau. edu. cn.
2005 - 03 - 17 收稿 ,2005 - 07 - 06 接受.
1 　引 　　言
磷是植物正常生长和发育的必需营养元素之
一 ,磷有效性不高严重影响了全世界的农业生产. 增
施磷肥可以满足农作物生长 ,提高产量. 但是 ,增施
的磷肥中只有 10 %～20 %的磷被当季作物吸收利
用[6 ] ,其余大部分被土壤固定转变为不易被植物吸
收利用的无机和有机磷. 土壤中有 20 %～80 %的磷
以有机磷的形式存在[4 ] ,而植酸磷 (多为盐的形式)
约占土壤有机磷的 25 %[1 ] . 植酸是一种磷的贮藏
物 ,广泛存在于植物的种子、果实和块茎中[13 ] . 土壤
中的植酸主要来源于腐烂的植物残体. 然而 ,无机磷
酸根离子是植物直接吸收磷的主要形式 ,有机磷只
有在磷酸酶的作用下矿化分解 ,释放出无机磷后才
能被吸收利用[4 ,17 ] .
植酸酶 ( EC3111318 和 EC31113126) 是一类可
以专一性分解植酸释放无机磷离子的酶. Hayes
等[5 ]通过研究多种温带牧草和豆科植物对植酸磷
利用情况时发现根部植酸酶活性不高是造成其不能
吸收利用植酸磷的主要原因 ;同时 ,通过添加少量植
酸酶可以增强植物对植酸磷的利用. 近 20 年来 ,国
内外许多科学家开始致力于将植酸酶基因导入植物
(如烟草、拟南芥、油菜、大豆等) ,但多是使植酸酶在
子叶和种子中表达 ,来帮助动物消化吸收利用饲料
应 用 生 态 学 报 　2005 年 12 月 　第 16 卷 　第 12 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Dec. 2005 ,16 (12)∶2389～2393
中的植酸磷[12 ,16 ] . 通过转基因手段增强植物吸收利
用植酸磷的报道较少[8 ,14 ,20 ] ,并且都是在无菌培养
基中获得的. 关于转植酸酶基因植物在土壤中的应
用研究还没有报道. 本试验研究转植酸酶基因烟草
在不同环境下及不同介质中对植酸磷的吸收和利用
情况 ,以期为该类转基因植物在农业生产中的应用
提供理论依据.
2 　材料与方法
211 　植物材料
供试烟草为茄科 ( Solanncease) 烟草属 ( Nicotiana) 普通
烟草 ( Tabaccum)“GeXin 1 号”的野生种及 3 个转基因系 ,转
入的植酸酶基因来自枯草芽孢杆菌 ( B acillus subtilis strain
168) .
表 1 　供试野生型及转基因烟草基本特性
Table 1 Characters of the transgenic and wild2type tobacco plants
烟草株系
Lines
基本特性
Characters
Wt 野生型 Wild type
T4221 内分泌植酸酶 ,根部不分泌
Intracellular expression of phytase ,no root secretion
T1422 根部分泌植酸酶 ,胡萝卜信号肽
Root secretion of phytase , carrot extensine signal
peptide
T3423 根部分泌植酸酶 ,拟南芥信号肽
Root secretion of phytase ,arobidopsis extensine sig2
nal peptide
212 　研究方法
21212 培养基栽培试验 　配制改良的不含磷的 MS 培养基 ,
120 ℃下高压灭菌 15 min. 培养基组成 :016 %的琼脂粉 (W/
V) ;大量元素 :NH4NO32 0106 mmol·L - 1 , KNO3 1818 mmol·
L - 1 ,MgSO4·7H2O 015 mmol·L - 1 ,CaCl2·2H2O 310 mmol·
L - 1 ,Na2 ·EDTA 011 mmol·L - 1 , FeSO4 ·7H2O 011 mmol·
L - 1 ;微量元素 : KI 01005 mmol·L - 1 ,H3BO3 011 mmol·L - 1 ,
MnSO4·4H2O 011 mmol·L - 1 ,ZnSO4·7H2O 0103 mmol·L - 1 ,
Na2 MoO4 ·2H2O 01001 mmol ·L - 1 , CuSO4 ·5H2O 010001
mmol·L - 1 ,CoCl2·6H2O 010001 mmol·L - 1 ;有机成分 :Nico2
tinic acid 01004 mmol·L - 1 , Pyridoxine HCl 010025 mmol·
L - 1 ,Thiamine HCl 010003 mmol·L - 1 , Glycine 01027 mmol·
L - 1 ,Myo2inositol 5155 mmol·L - 1 ,Sucrose 55151 mmol·L - 1 ,
MES 01005 mmol·L - 1 ,用 015 mol·L - 1的 NaOH 调节 p H 至
518 左右.
本试验设 3 个处理 :不施磷处理 (No2P) 、施速效磷处理
( K2P ,)和施植酸磷处理 ( IP2P) . 3 次重复 ,随机区组排列. 施
钾磷处理和植酸磷处理的培养基分别加入 KH2 PO4 (013
mmol·L - 1) 和 C6 H6O24 P6Na12 (0105 mmol·L - 1 , P3168 , Sig2
ma ,USA) .
供试烟草种子 ,加入新鲜配制的 10 %的次氯酸钠溶液 ,
振荡 20 min ,加入无菌水 ,振荡 1 min ,重复 5 次 ,将种子表面
的次氯酸钠洗干净. 然后再加入少量无菌水 ,振荡 ,将种子和
水一起倒在培养基中 ,将培养皿用胶布封严. 置黑暗条件 ,25
℃条件下培养 1 周.
从培养皿中选取均匀一致的小苗移入培养瓶中 ,每瓶 3
棵. 在人工气候箱 (28 ℃,10 h 光照条件下) 培养 50 d. 收获
后将植株烘干 ,测定植株生物量和总磷含量.
21213 沙培试验 　试验设 3 个处理 (同上一试验) ,5 次重复 ,
随机区组排列. 其中 , KH2 PO4 (100 mg P·kg - 1 ) 和 C6 H6O24
P6Na12 (100 mg P·kg - 1) 以固体形式混入沙中 ,其他营养元
素以营养液的形式淋入. 营养液配方 : KNO3 115 mmol·
L - 1 , Ca (NO3 ) 2·4H2O 112 mmol·L - 1 ,NH4NO3 014 mmol·
L - 1 ,MgSO4·7H2O 01525 mmol·L - 1 , K2 SO4 013 mmol·L - 1 ,
(NH4) 2 SO4 013 mmol·L - 1 ,MnSO4·H2O 010015 mmol·L - 1 ,
ZnSO4·7H2O 010015 mmol·L - 1 ,CuSO4·5H2O 010005 mmol·
L - 1 , ( NH4 ) 6 Mo7O24 ·4H2O 0100015 mmol ·L - 1 , NaB4O7 ·
10H2O 010005 mmol·L - 1 ,Fe2EDTA 0103 mmol·L - 1 .
烟草种子用 800μl 的 10 %次氯酸纳溶液消毒后在避
光 ,25 ℃条件下催芽 3 d ,然后将露白的种子播于盆中. 烟草
植物在 28 ℃下 ,每天光照 12 h 下培养 60 d 收获. 测定植株
生物量和总磷含量.
21214 土培试验 　土壤采用南方酸性红壤 ,p H 5128 ,有机质
5130 g·kg - 1 ,全氮 56 mg·kg - 1 ,碱解氮 42130 mg·kg - 1 , 全
磷 0108 g·kg - 1 ,速效磷 1132 mg·kg - 1 ,全钾 2190 g·kg - 1 ,
速效钾 10164 mg·kg - 1 . 通过添加 CaCO3 (115 g·kg - 1 ) 调节
p H 到 610. 试验设 3 个处理 (与上同) 5 次重复 ,随机区组排
列. KH2 PO4 (100 mg·kg - 1)和 C6 H6O24 P6Na12 (100 mg·kg - 1)
以固体形式混入土中. 种子消毒、催芽以及育苗的栽培方式 ,
培养条件同沙培试验相同. 当苗长到 1 cm 时移苗. 在温室自
然条件下培养 (平均温度 28 ℃,自然光照 12 h·d - 1) 60 d 收
获 ,测定植株生物量.
21215 测试方法 　将收获的植物样品烘干 (105 ℃杀青 30
min ,60 ℃下烘干) 然后称重 ,得到生物量 ;总磷的测定采用
干灰化2钼蓝比色法 [9 ] .
21216 数据统计分析 　所有数据都采用 Microsoft Excel 和
SAS等统计软件分析. 单因素方差分析 (ANOVA) 用来分析
相同磷处理下不同材料的差异及同一材料在不同磷处理下
的差异 ,同时采用新复极差法 (DUNCAN 法)进行多重比较.
3 　结果与分析
311 　培养基栽培
转植酸酶基因对烟草在无菌培养基中的生长状
况具有显著的影响. 在植酸 ( IP2P)作为唯一磷源时 ,
转植酸酶基因烟草的生物量显著高于野生型 ( Wt) ,
转基因型烟草 T4221、T1422 和 T3423 的生物量分别
是 Wt 的 316、417 和 1017 倍. 并且转植酸酶基因烟
草各株系间的生长状况也有差异 ,其生物量依次为
T3423 > T1422 > T4221 (表 2) . 在不施磷 (No2P) 和施
速效磷肥 ( K2P) 的处理中 ,转基因烟草和野生型相
0932 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
比生长差异不显著 (表 2) .
转入植酸酶基因对烟草在无菌培养基中磷的利
用状况具有显著影响. 在植酸作为唯一磷源的处理
中 ,转植酸酶基因烟草的总吸磷量远高于野生型 ;并
且转植酸酶基因烟草各株系间对植酸的吸收也有差
异 ,其总磷量依次为 T3423 > T1422 > T4221 (表 2) .
在不施磷处理下 ,所有供试烟草植物的总吸磷量都
非常低 ,不同株系间差异不显著. 在施速效磷的处理
下 ,所有植物的总吸磷量都比较高 ,但株系间差异不
显著. 同一烟草材料在不同磷处理下 ,其生物量和总
吸磷量差异较大 ,均表现为 K2P > IP2P > No2P 的趋
势 (表 2) .
表 2 　培养基试验中转植酸酶基因烟草的生物量和总吸磷量3
Table 2 Biomass and total phosphorus content of the transgenic and
wild2type tobacco plants grown on MS medium
处 　理 Treatment
品系 Lines No2P K2P IP2P
生物量 Wt 3130 (013) a 3413 (018) a 3110 (012) d
Biomass T4221 3100 (012) a 3517 (018) a 1112 (014) c
( ×10 - 3 g T1422 311 (016) a 3910 (314) a 1419 (016) b
·ind - 1) T3423 312 (015) a 3812 (115) a 3316 (018) a
总吸磷量 Wt 515 (015) a 19618 (1118) a 11120 (216) c
Total P content T4221 610 (013) a 19112 (411) a 2515 (013) b
( ×10 - 3 mg T1422 511 (017) a 21611 (1015) a 3713 (710) b
·ind - 1) T3423 417 (011) a 34614 (617) a 5116 (412) a3 数据是 3 次重复的平均值及其标准误 . 每列数据相同字母时表示同一磷处
理下不同株系间差异不显著 ( P = 0105) . Each value is the mean of three repli2
cates with the standard error in the parentheses1Data in the same column with the
same small letter (s) are not significantly different ( P = 0105) from each other.
312 　沙培
沙培试验结果表明 ,转植酸酶基因对烟草的生
物量没有显著影响 (图 1) . 在相同磷处理下 ,供试烟
草植物的生物量没有显著差异. 在 IP2P 处理下 ,生
物量以转拟南芥信号肽的外分泌型株系 T1422 为最
高 ,其它依次为 T4221 > T3423 > Wt ,但株系间差异
达不到显著水平. 在不同磷处理下 ,相同烟草株系生
长状况表现出一定的差异 (图 1) . 从生物量来看 ,
T1422、T3423 和 Wt 在 K2P 处理下生物量最高 ,其
次为 IP2P处理 ,并且同一株系各处理间的生物量差
图 1 　沙培试验中转基因与野生型烟草的生物量差异
Fig. 1 Biomass of the transgenic and wild2type tobacco plants growing in
the sand culture.
1) Wt ;2) T4221 ;3) T1422 ;4) T3423. 下同 The same below.
异达到显著水平. 而 T4221 在 K2P、IP2P 生长状况都
比较好 ,与 No2P 处理生物量差异都达到显著水平 ,
但在 K2P 和 IP2P 处理之间差异不显著.
　　转植酸酶基因对烟草在沙培条件下的磷吸收具
有一定的影响 (图 2) . 在 K2P 处理下 ,转胡萝卜信号
肽的外分泌型株系 T1422 的总磷量显著高于内分泌
型的 T4221 和 Wt ,但与转拟南芥信号肽的外分泌型
株系 T3423 差异不显著. 而在 IP2P 和 No2P 处理下 ,
供试烟草植物的总吸磷量变化差异不显著. 此外 ,不
同磷处理下供试烟草总吸磷量差异较大 ,依次为 K2
P > IP2P > No2P.
图 2 　沙培试验中各烟草材料总吸磷量
Fig. 2 Total phosphorus content of the transgenic and wild2type tobacco
plants in the sand culture.
相同字母表示差异不显著 ( P = 0105) ;不施磷 ( No2P) 处理下总吸磷
量值扩大 5 倍作图 Columns with same letter ( s) are not significantly
different ( P = 0105) from each other. The data under No2P treatment
was drawn by timing the real data 52fold in the figure.
313 　土培
转植酸酶基因对烟草在土培条件下的生长状况
有一定影响 ,表现在各供试烟草株系在相同的磷处
理下生物量具有一定的差异 (图 3) . 在 IP2P 处理
下 ,供试烟草植物长势均较差 ,其生长状况和 No2P
处理差异不大. 其中 ,内源型株系 T4221 长势最好 ,
其次为 T1422 ;但它们与 Wt 的差异均达不到显著水
图 3 　土培试验中各个烟草材料的生物量
Fig. 3 Biomass of the transgenic and wild2type tobacco plants in the soil
culture.
相同字母表示基因型间差异不显著 ( P = 0105) ;NoP 和 IP2P 处理下
各烟草材料的生物量数值扩大 10 倍作图 Columns with same letter
(s) are not significantly different ( P = 0105) from each other1Biomass
under No2P and IP2P treatments times ten in the figure.
193212 期 　　　　　　　孔凡利等 :转枯草芽孢杆菌植酸酶基因烟草对不同介质中植酸磷的吸收利用 　　　　　　　　　　　
平. 在 No2P 处理下 ,由于土壤中可溶磷和总磷都非
常低 ,各个烟草材料生长状况都不好 ,从移苗到收获
几乎没有很大变化 ,株系间的生物量也没有显著差
异.在 K2P 处理下 ,各个烟草材料生长都比较好 ,但
株系间生物量仍没有显著差异.
　　此外 ,从土培的结果可以看出 , K2P 作为可溶性
磷源 ,在土培试验中同样显示了明显的优势 ,所有烟
草株系的生长都较好 ;但在 IP2P 处理下 ,几乎所有
烟草株系的生物量和 No2P 处理下差异不显著 ,生
长十分缓慢 ,说明植酸磷几乎没有被利用 (图 3) .
4 　讨 　　论
411 　转入植酸酶基因对提高植物磷效率的作用
植物几乎不能直接吸收利用土壤有机磷[15 ] ,磷
多以无机磷的形式被植物吸收利用. Richardson
等[14 ]证明拟南芥缺乏直接利用植酸磷的能力 ,但转
外分泌型真菌植酸酶基因拟南芥可以吸收利用植酸
磷.因此 ,科学家们希望通过转植酸酶基因 ,提高根
际植酸酶含量来增强植物吸收利用 IP2P 的能力.
研究发现 ,无菌培养基栽培中 IP2P 作为唯一磷
源条件下 ,内分泌型和外分泌型转基因烟草株系生
长均优于对照 Wt ,生物量和总的吸磷量差异都达到
显著水平 ,说明转植酸酶基因具有提高烟草植物对
植酸磷吸收利用能力的潜力. 本试验中 Wt 在 IP2P
处理下总磷含量比 No2P 处理高[14 ] ,说明其能吸收
一部分磷 ,也可能是由于 IP2P 本身在培养基的分
解. 转 PhyA 基因的植物 ,只有当植酸酶被分泌到质
外体时才能检测到酶活[2 ] ,而且生长速度和形态没
有变化[11 ] . Yip 等[20 ]认为 , PhyA 在细胞质的中性
条件下不能发挥作用. 所以 Richardson 的试验中可
能是以上原因 ,转 PhyA 内分泌型拟南芥在 IP2P 作
为唯一磷源时 ,生物量和总磷与野生型差异不显著.
在本试验中 ,植酸酶 168phyA 是一种中性植酸酶 ,
能在中性 p H 条件下起作用[3 ,19 ] . T4221 在 IP2P 处
理下 ,可能是植酸酶改变了体内磷的循环利用 ,使其
生长状况得到改善.
在无菌培养基试验中外分泌型转基因烟草
T142、T3423 的生物量及总磷含量与 Wt 和 T4221
差异都达到显著水平. 说明这两个转基因株系可以
通过分泌植酸酶到介质中分解 IP2P ,释放出无机磷
被植株吸收利用[8 ,14 ] . T1422 和 T3423 之间生物量
和总磷同样达到显著水平 ,可能是由于所用的信号
肽不同所致.
412 　转植酸酶基因植物在农业生产中的应用前景
目前 ,通过转植酸酶基因提高植物对 IP2P 的吸
收和利用 ,都是在无菌培养基中获得的. 关于转植酸
酶基因植物在土壤中的应用研究还没有报道.
本试验研究了在自然条件下 ,转基因植物在沙
子和土壤中的吸收利用情况. 研究表明 ,在沙培试验
中转基因烟草在利用 IP2P 作为单一磷源时 ,生物量
和总的吸磷量与 Wt 相比差异均不显著. Wt 在 No2
P 和 IP2P 处理间生物量和总的吸磷量差异都达到
显著水平. 这可能是由于与无菌培养基条件下相比 ,
在自然条件下沙培中 IP2P 自身或被分泌植酸酶的
微生物分解. 另一原因可能是在自然条件下 ,分泌到
介质中的植酸酶作用环境不如培养基中温和 ,不利
于植酸酶分解 IP2P ,也可能被微生物分解. 所以在
沙培条件下 ,转基因烟草生物量和总磷与野生型差
异不显著.
在土培试验中 ,植物在 IP2P 处理下生物量很
小 ,与无磷差异不显著 ,而和 K2P 处理差异极显著.
这可能是由于植酸通常在土壤中和一些金属阳离子
形成难溶性化合物所致[7 ] . 另一方面 ,由于植酸带 6
个磷酸基团 ,具有很高的电荷密度 ,土壤粘粒和难溶
性盐 (例如铁铝的氧化物及氢氧化物)对其有很强的
吸附和固定作用[18 ] . 同样 ,根系分泌植酸酶也可能
被土壤固定 ,从而不能与底物接触或失活. 目前 ,还
没有关于土壤中植酸酶被固定失活的报道 ,但 Palm
等[10 ]在研究 Bt 毒蛋白残效时发现一部分毒蛋白紧
紧地固定到土壤中 ,用抽提法不能测出其活性.
本试验结果显示 ,通过转植酸酶基因可以提高
植物吸收利用人工介质中 IP2P 的能力 ,表明通过转
基因手段提高植物对土壤中有机磷的吸收利用具有
一定的潜力. 但是在沙子和土壤却表现不出这种优
势. 所以 ,要想使转基因植物高效地吸收利用土壤中
的 IP2P ,今后需要进一步研究限制其在土壤中有效
性的因素及其改良方法 (例如提高植物分泌有机酸
的含量) ,才能使转基因植物充分发挥作用.
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作者简介 　孔凡利 ,男 ,1977 年生 ,硕士生. 主要从事植物营
养生理与遗传方面的研究 , 发表论文 2 篇. Tel : 0202
85271813 ; E2mail :flkong @ scau. edu. cn
393212 期 　　　　　　　孔凡利等 :转枯草芽孢杆菌植酸酶基因烟草对不同介质中植酸磷的吸收利用