全 文 ：［收稿日期］ 20121024(008)
［第一作者］ 易荆丽，硕士研究生，从事中药新剂型与新技术研
究，Tel:020-39352168，E-mail: yijingli2008 @
163． com
［通讯作者］ * 周毅生，教授，从事药物新剂型与新技术研究，
Tel:020-39352168，E-mail:yishzhou@ yahoo． com． cn
HPLC测定龙须藤中 2 种多甲氧基黄酮的含量
易荆丽，张嘉家，周毅生* ，赵永恒，王嵩
( 广东药学院，广州 510006)
［摘要］ 目的:建立 HPLC测定龙须藤中 5，7，3，4，5-五甲氧基黄酮和 5，6，7，5-四甲氧基-3，4-亚甲二氧基含量的方
法。方法:DIKMA PlatisilODS C18色谱柱(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流动相乙腈(A)-0. 1%磷酸溶液(B) ，梯度洗脱(0 min，
25%A;15 min，45%A;40 min，50%A) ，流速 0. 8 mL·min －1，检测波长 324 nm。结果:5，7，3，4，5-五甲氧基黄酮和 5，6，7，5-
四甲氧基-3，4-亚甲二氧基分别在 0. 008 4 ～ 0. 336 0 μg(r = 0. 999 9) ，0. 013 4 ～ 0. 536 0 μg(r = 0. 999 7)与峰面积呈良好的线
性关系，平均回收率分别为 99. 41%，98. 65%，ＲSD分别为 0. 57%，1. 01%。结论:该方法操作简单准确，分离效果、精密度和
重复性好，适合于测定该药材中 5，7，3，4，5-五甲氧基黄酮和 5，6，7，5-四甲氧基-3，4-亚甲二氧基的含量。
［关键词］ 高效液相色谱;龙须藤;多甲氧基黄酮;含量测定
［中图分类号］ Ｒ284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)18-0155-03
［doi］ 10． 11653 /syfj2013180155
Determination of Two Polymethoxylated Flavonoids in
Bauhinia championii by HPLC
YI Jing-li，ZHANG Jia-jia，ZHOU Yi-sheng* ，ZHAO Yong-heng，WANG Song
(Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)
［Abstract］ Objective: To establish a quantitative determination method of HPLC for two
polymethoxylated flavonoids in Bauhinia championii． Method:The determination was performed on a DIKMA
Platisil ODS column (4. 6 mm ×250 mm，5 μm)with acetonitrile-0. 1% phosphoric acid as the mobile phase by
gradint elution (0 min，25%A;15 min，45% A;40 min，50% A)． The flow rate was 0. 8 mL·min －1 and the
detection wavelength was set at 324 nm． Ｒesult:The calibration curves were linear in the range of 0. 008 4-0. 336
0 μg (for 5，7，3，4，5-pentamethoxy flavone， r = 0. 999 9) ，0. 013 4-0. 536 0 μg (for 3，4-
methylenedioxy-5，5，6，7-tetramethoxyflavone，r = 0. 999 7)． The average recoveries were 99. 41% (ＲSD
0. 57%)and 98. 65% (ＲSD 1. 01%)respectively． Conclusion:This method is simple and accuracy with good
separation and reproducibility． It can be used as the quality control of the polymethoxylated flavonoids in Bauhinia
championii．
［Key words］ HPLC;Bauhinia championii;polymethoxylated flavonoids;quantitative determination
龙须藤为豆科苏木亚科羊蹄甲属植物龙须藤的
干燥藤茎，别名过岗圆龙、羊蹄藤、九龙藤、五花血
藤、梅花入骨丹、燕子尾、黑皮藤，性味甘、微苦、温，
具有祛风除湿、行气活血的功效［1］。该药在我国多
个少数民族广泛用于治疗风湿性关节炎，跌打损伤，
疗效显著［2］。但目前对龙须藤的基础研究还不够
深入，其抗风湿性关节炎的有效成分不清，缺乏以有
效成分为基础的质量标准，疗效难以保证。鉴于龙
须藤的化学成分主要为黄酮类、氰苷、没食子酸
等［3-4］，多甲氧基黄酮类成分具有镇痛抗炎作用［5］，
且目前龙须藤中 5，7，3，4，5-五甲氧基黄酮和 5，
6，7，5-四甲氧基-3，4-亚甲二氧基的含量情况未见
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中国实验方剂学杂志
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Vol． 19，No． 18
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报道。本实验采用 HPLC梯度洗脱法对龙须藤药材
中这 2 种多甲氧基黄酮进行含量测定，为提高龙须
藤药材的质量标准提供依据。
1 材料
美国 Waters 2695-2996 高效液相色谱仪(包括
PDA检测器、四元泵、在线真空脱气机、Empower 色
谱工作站) ，SB-100D型超声波清洗仪(宁波新芝生
物科技股份有限公司) ，AY120 型电子天平(日本岛
津公司) ，微孔滤膜(上海市新亚净化器件厂)。
龙须藤药材由广东罗浮山国药股份有限公司提
供，批号为 20110511，另 2 批采自广西隆安和桂林，
批号分别为 20110523，20110528，经广东药学院中
药鉴定教研室李书渊教授鉴定为豆科苏木亚科羊蹄
甲属植物龙须藤 Bauhinia championii (Benth．)
Benth．的干燥藤茎。
5，7，3，4，5-五甲氧基黄酮和 5，6，7，5-四甲
氧基-3，4-亚甲二氧基(实验室自制，面积归一化法
计算纯度为 98%，97%) ，乙腈、甲醇为色谱纯(美国
DIKMA公司) ，磷酸为分析纯(天津市大茂化学试剂
厂) ，蒸馏水(屈臣氏基团有限公司)。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件及系统适应性试验 DIKMA
PlatisilODS C18色谱柱(4. 6 mm ×250 mm，5 μm) ，流
动相乙腈(A)-0. 1% 磷酸溶液(B) ，梯度洗脱
(0 min，25%A;15 min，45%A;40 min，50%A) ，流速
0. 8 mL·min －1，检测波长 324 nm，柱温 30 ℃，进样
量 10 μL。在此色谱条件下，5，7，3，4，5-五甲氧基
黄酮和 5，6，7，5-四甲氧基-3，4-亚甲二氧基 2 种
成分色谱峰理论板数不低于 26 000，峰间分离度良
好。结果见图 1。
A．对照品;B．供试品;1. 5，7，3，4，5-五甲氧基黄酮;
2. 5，6，7，5-四甲氧基-3，4-亚甲二氧基
图 1 龙须藤 HPLC
2. 2 溶液的制备
2. 2. 1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒质
量的 5，7，3，4，5-五甲氧基黄酮 4. 20 mg，5，6，7，
5-四甲氧基-3，4-亚甲二氧基 5. 36 mg 分别置于 2
个 100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，
即得 2 种对照品的储备液，5，7，3，4，5-五甲氧基
黄酮(42. 00 mg·L －1) ，5 6，7，5-四甲氧基-3，4-亚
甲二氧基(53. 60 mg·L －1)。取前者 2 mL、后者 2. 5
mL置同一 5 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，
摇匀，即得混合对照品溶液，其中 5，7，3，4，5-五甲
氧基黄酮质量浓度为 16. 80 mg·L －1，5，6，7，5-四甲
氧基-3，4-亚甲二氧基质量浓度为 26. 80 mg·L －1。
2. 2. 2 供试品溶液的制备 取龙须藤药材于 60 ℃
下烘 3 h，粉碎，过 40 目筛，精确称取约 3 g，置具塞
锥形瓶中，精密加入甲醇 50 mL，称定质量，超声处
理(功率 100 W，频率 50 kHz)60 min，放冷，再称定
质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用 0. 45 μm 微
孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2. 3 线性关系的考察 分别精密吸取 2. 2. 1 项下
的混合对照品溶液 0. 5，1，2，5，10，15，20 μL，注入
高效液相色谱仪，按 2. 1 项下色谱条件测定各色谱
峰峰面积。以峰面积 Y 为纵坐标，成分的含量
X(μg)为横坐标进行线性回归，得 5，7，3，4，5-五甲
氧基黄酮和 5，6，7，5-四甲氧基-3，4-亚甲二氧基的
回归方程分别为 Y = 4. 823 8 × 106X － 6. 249 4 × 103
(r = 0. 999 9) ，Y = 4. 451 6 × 106X － 7. 193 2 × 103
(r = 0. 999 7)。结果表明 5，7，3，4，5-五甲氧基黄
酮进样量在 0. 008 4 ～ 0. 336 0 μg，5，6，7，5-四甲氧
基-3，4-亚甲二氧基进样量在 0. 013 4 ～ 0. 536 0 μg
与峰面积线性关系良好。
2. 4 精密度考察 精密吸取对照品溶液 10 μL 连
续进样 5 次，测定 5，7，3，4，5-五甲氧基黄酮、5，6，
7，5-四甲氧基-3，4-亚甲二氧基色谱峰峰面积的
ＲSD分别为 1. 10%，1. 40%，表明精密度良好。
2. 5 稳定性考察 取龙须藤药材供试品溶液于制
备后 0，2，4，8，16，24 h 进样，测定 5，7，3，4，5-五
甲氧基黄酮、5，6，7，5-四甲氧基-3，4-亚甲二氧基
色谱峰峰面积，峰面积 ＲSD分别为 0. 98%，0. 57%，
表明龙须藤药材供试品溶液在 24 h内基本稳定。
2. 6 重复性考察 取同一批龙须藤药材样品 6 份，
按 2. 2. 2 项下方法操作，按 2. 1 项下色谱条件，各取
10 μL进样，测定峰面积，计算药材中 5，7，3，4，5-
五甲氧基黄酮、5，6，7，5-四甲氧基-3，4-亚甲二氧
基的平均含量分别为 0. 429 8 mg·g －1(n = 6，ＲSD
1. 20%) ，0. 482 7 mg·g －1(n = 6，ＲSD 0. 51%)。表
明方法的重复性良好。
2. 7 回收率试验 取已知浓度的龙须藤样品粉末
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约 1 g，共 12 份，精确称定，按表 2 所示，样品中分别
精确加入质量浓度为 42. 00 mg·L －1的 5，7，3，4，
5-五甲氧基黄酮对照品溶液 10 mL［6］，质量浓度
53. 60 mg·L －1的 5，6，7，5-四甲氧基-3，4-亚甲二
氧基对照品溶液 9 mL，按 2. 2. 2 项下方法制备供试
品溶液，按 2. 1 项下色谱条件测定，计算 2 种成分的
平均回收率，结果见表 1。
表 1 龙须藤样品中 2 种成分加样回收率试验
成分
称药量
/ g
样品中
含量
/mg
加入量
/mg
测定量
/mg
回收率
/%
平均
回收率
/%
ＲSD
/%
A 1. 003 6 0. 431 3 0. 420 0 0. 851 7 100. 10 99. 41 0. 57
1. 002 4 0. 430 8 0. 420 0 0. 848 7 99. 50
1. 002 8 0. 431 0 0. 420 0 0. 845 0 98. 57
1. 006 1 0. 432 4 0. 420 0 0. 852 2 99. 95
1. 001 3 0. 430 4 0. 420 0 0. 847 3 99. 26
1. 007 9 0. 433 2 0. 420 0 0. 849 3 99. 07
B 1. 004 6 0. 484 9 0. 482 4 0. 958 8 98. 24 98. 65 1. 01
1. 003 9 0. 484 6 0. 482 4 0. 962 3 99. 03
1. 002 7 0. 484 0 0. 482 4 0. 966 7 100. 06
1. 005 4 0. 485 3 0. 482 4 0. 964 2 99. 27
1. 006 8 0. 486 0 0. 482 4 0. 959 2 98. 09
1. 004 1 0. 484 7 0. 482 4 0. 953 6 97. 20
注:表中 A为 5，7，3，4，5-五甲氧基黄酮，B 为 5，6，7，5-四甲
氧基-3，4-亚甲二氧基。表 2 同。
2. 8 不同产地龙须藤药材含量测定 取 3 个不同
产地龙须藤样品，按 2. 2. 2 项下方法操作，按 2. 1 项
色谱条件测定，计算这 2 种多甲氧基黄酮的含量，结
果见表 2。
表 2 不同产地龙须藤中多甲氧基黄酮类成分的平均含量(n = 3)
mg·g － 1
产地及批号 A B
广东惠州(20110511) 0. 429 8 0. 482 7
广西隆安(20110523) 0. 315 9 0. 353 6
广西桂林(20110528) 0. 355 7 0. 341 5
3 讨论
3. 1 检测波长的选择 HPLC-PDA分析结果表明，2
个黄酮指标成分最大吸收波长分别为 324，332. 4 nm，
相差不是很大，两种成分在 324 nm检测条件下能满
足灵敏度要求，色谱峰数量较多，峰型较好且基线稳
定，故选择 324 nm为检测波长。
3. 2 提取方法的选择 供试品溶液的配置为对龙
须藤中 2 种多甲氧基黄酮的提取，曾采用超声、热回
流、酸水解提取法［7］，结果酸水解法效果最好，热回
流提取效果差于超声提取(可能因为多甲氧基黄酮
在加热条件下结构会发生变化) ，考虑到超声提取
法简便快捷，故最终选择超声提取法。分别以不同
提取时间(20，40，60 min)提取［8］的结果无明显差
异，但为保证提取完全，故采用超声处理 60 min 为
提取方法。
3. 3 流动相的选择 考察了甲醇-水［9］、乙腈-水［9］
及乙腈-不同浓度的磷酸［10］溶液对样品分离的影
响，发现乙腈-磷酸溶液对多甲氧基黄酮类成分的分
离较好:保留时间适宜，峰型好，有效改善拖尾效应;
采用梯度洗脱可明显改善特征峰的分离度，故最终
选用乙腈-0. 1%磷酸溶液梯度洗脱法。
采用此含量测定方法对 3 个产地的龙须藤药材
中 2 种多甲氧基黄酮成分进行测定，由结果看出不
同产地的药材中这 2 种黄酮含量存在差异，这可能
与生长环境、采收时间、加工过程等因素有关。这对
龙须藤药材质量标准的建立和龙须藤制剂的开发利
用提供了有益的参考。
［参考文献］
［1］ 广东省食品药品监督管理局． 广东省中药材标准．第
2 册［M］．广州:广东科技出版社，2004:114.
［2］ 贾敏如，李星炜． 中国民族药志要［M］． 北京:中国
医药科技出版社，2005:85.
［3］ CHIEN C C，YUH P C，HONG Y H，et al． New
flavones from Bauhinia championii Benth［J］． Chem
Pharm Bull，1984，32(1) :166.
［4］ CHIEN C C，YUH P C，HONG Y H，et al． Bauhinin，A
new nitrile glucoside from bauhinia championii［J］． J
Nat Prod，1985，48(6) :933.
［5］ 周芳，彭朵花，杜方麓，等． 多甲氧基黄酮的化学成分
及药理作用［J］． 中南药学，2008，6(6) :734.
［6］ 邹兵，刘玉强，才谦． 不同地区锁阳药材及饮片中儿
茶素的含量测定［J］． 中国实验方剂学杂志，2011，17
(6) :69.
［7］ 叶蕻芝，陈鹏程，杨建萍，等． HPLC 测定梅花入骨丹
中的没食子酸和槲皮素含量［J］． 福建中医药大学学
报，2011，21(1) :35.
［8］ 梁美宜，黄韵然，周毅生，等． HPLC 法测定黄藤素结
肠定位片中盐酸巴马汀的含量及有关物质的检查
［J］． 西北药学杂志，2012，27(4) :324.
［9］ 徐欢，陈海芳，介磊，等． HPLC 法测定枳壳中川陈皮
素、红橘素的含量［J］． 药物分析杂志，2009，29
(9) :1411.
［10］ 徐伟，郑海音，洪振丰，等． ＲP-HPLC测定龙须藤中 4
种黄酮类成分的含量［J］． 中国现代应用药学杂志，
2009，26(9) :763．
［责任编辑 顾雪竹］
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