全 文 ：第 36 卷 1 期
2014 年 1 月
宁夏医科大学学报
Journal of Ningxia Medical University
文章编号:1674 － 6309(2014)01 － 0017 － 04
·论著·
鹅绒藤中的黄酮苷类诱导肿瘤细胞凋亡的研究
李 洋1， 王 琦2
(1．北京军区总医院 263 临床部 /检验科，北京 101149; 2．宁夏医科大学基础医学院
病原生物学与免疫学系，银川 750004)
摘要:目的 观察不同浓度的鹅绒藤中黄酮苷类单体化合物山奈酚 － 7 － O － α － L －鼠李糖苷(Monomer Com-
pounds －Ⅴ，MC －Ⅴ)诱导肿瘤细胞凋亡的形态学变化及其凋亡率的检出。方法 用浓度 50、100 和 200
μg·mL －1的 MC －Ⅴ作用人宫颈癌 Hela细胞、人胃癌 MGC －803 细胞和小鼠淋巴瘤 YAC － 1 细胞 48h和 72h
后，采用细胞凋亡荧光 Hoechst33342 /PI双染方法，在荧光显微镜下观察肿瘤细胞在加 MC －Ⅴ后的形态变化
过程，并计算三种肿瘤细胞的凋亡率。结果 镜下可见正常对照组细胞质染色均匀，形态规则，呈均匀微弱
蓝光;所有 MC －Ⅴ作用的肿瘤细胞核固缩，染色质凝集，随着浓度的增加和作用时间的延长，细胞膜损坏加
剧;在 MC －Ⅴ作用的三种肿瘤细胞中，作用于 Hela细胞，染色质边集化，部分染色质裂断;作用于 MGC － 803
细胞，染色质部分高度凝集，核碎裂、边集化严重，呈现不均一的荧光显色结构;作用于 YAC － 1 细胞，细胞核
固缩凝集成小团块状结构。三种肿瘤细胞的凋亡率均随 MC －Ⅴ浓度的增高及作用时间的延长而增大。结
论 MC －Ⅴ可以诱导不同的肿瘤细胞显示不同的凋亡形态，并呈时间和剂量依赖性，提示其作用于肿瘤细胞
的作用机制不同。
关键词:鹅绒藤;Hoechst33342 /PI;细胞凋亡;形态学
中图分类号:Ｒ73 － 76 文献标识码:A
收稿日期:2013 －04 －01
基金项目:宁夏自然科学基金(C1018)
作者简介:李洋(1986 －)，男，硕士研究生，从事抗肿瘤药物的
研究。
通信作者:王琦，教授，硕士研究生导师，从事抗肿瘤中草药物的研
究。E －mail:wqmxm@126． com
鹅绒藤(Cynanchum Chinense)为萝摩科鹅绒
藤属(Cynanchum Chinense Ｒ． Br．)植物，异名羊奶
角或祖子花，为中国特有植物，其性寒味苦。有研
究表明鹅绒藤总生物碱对体外培养的肿瘤细胞有
明显的抑制作用［1］，同时鹅绒藤中黄酮苷类单体化
合物对 Hela、YAC －1 和 MGC －803 等多种肿瘤细
胞也表现出不同程度的增殖抑制作用［2］。为进一
步明确鹅绒藤在抗肿瘤活性方面的作用机制，本文
从细胞凋亡的形态学角度对鹅绒藤提取物山奈
酚 － 7 － O － α － L －鼠李糖苷进行研究，为中药提
取物合理的新药研发提供更为有力的科学依据。
1 材料和方法
1． 1 实验细胞株
人宫颈癌 Hela 细胞、人胃癌 MGC － 803 细
胞、小鼠淋巴瘤 YAC －1 细胞，来源于宁夏医科大
学基础医学院实验室。
1． 2 药物
山奈酚 － 7 － O － α － L －鼠李糖苷(Monomer
Compounds － Ⅴ，MC － Ⅴ)，分子量 432，纯度≥
95%，提取率为 0． 0278%，黄色结晶外观，由宁夏
医科大学基础医学院化学教研室提取供给。
1． 3 试剂仪器
ＲPMI 1640培养基(赛默飞)、胎牛血清(杭州
四季青)、0． 25%胰蛋白酶(赛默飞)、二甲亚砜
(DMSO，sigma 公司)、荧光显微镜(奥林巴斯
DP71)、Hoechst33342 /PI双染试剂盒(南京凯基)。
1． 4 方法
1． 4． 1 药物的制备 MC －Ⅴ用 DMSO 助溶(终
浓度 ＜ 0． 05%)，再用含 10% FBS的 ＲPMI1640 培
养液配成所需浓度，临用配制。
1． 4． 2 细胞培养 上述细胞采用 ＲPMI 1640 +
10% FBS 的完全培养基在 37℃ 5% CO2 条件下
常规细胞培养后，将 Hela细胞和 MGC － 803 细胞
浓度调整为 3 × 104·mL －1，YAC － 1 细胞浓度调
整为 4 × 104·mL －1，分别接种于 24 孔板中，每孔
1mL，细胞培养箱中继续培养。
1． 4． 3 Hoechst33342 /PI 双染［3］ 24h 后换液，
分别加入不同浓度的 MC －Ⅴ，每孔 1mL，使其终
浓度分别为 50、100 和 200μg·mL －1，即实验组
B、C、D组;另设不含药物培养液的肿瘤细胞对照
组，即细胞对照组 A 组。培养 48 和 72h 后，将约
106 个细胞悬浮于 1mL 新鲜培养基中，再加入
·71·
宁夏医科大学学报 36 卷
10μL Heochst 33342 染液，混匀，37℃避光，孵育
12min后;于 4℃，1000r·min －1，离心 5min，弃上
清液;加入 1． 0mL Buffer A工作液悬浮细胞后，加
入 5μL PI染液，室温避光静置 6min 后混匀;取出
50μL染色后的细胞悬液，迅速滴在用双面胶围封
洁净的载玻片上的小室内，盖好盖玻片，滤纸吸去
周边多余的液体，再用指甲油封住盖玻片周边。
1． 4． 4 荧光显微镜下观察 Heochst33342 用紫
外光激发，波长为 352nm，产生蓝色荧光;PI 在激
发波长为 488nm，产生红色荧光。暗室内选取多
个视野、多个倍数下，迅速拍照，根据细胞发出的
荧光颜色程度、细胞核的形态变化，判别出各个细
胞的细胞活性状态情况，实验重复 2 次。
1． 4． 5 计算细胞凋亡率 正常细胞(VN)为低蓝
色 /弱低红色，细胞呈正常细胞核结构形态;早中
期凋亡细胞(VA)为高蓝色 /低红色，细胞核固缩
成团块状或圆珠子状;晚期凋亡细胞(NVA)为高
蓝色 /红色，染色体呈明显凝集状态，边集化严重;
死亡细胞(NVN)为低蓝色 /高红色，细胞核结构
基本正常、染色均匀。
凋亡率 AI = (VA + NVA)/(VN + NVN +
VA + NVA)× 100%
1． 5 统计学方法 三种肿瘤细胞的凋亡率的比
较采用卡方检验，P≤0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 MC －Ⅴ致人宫颈癌 Hela 细胞凋亡的形态
学观察
镜下可见 48h 后 Hela 细胞对照组(A 组)细
胞质染色均匀，大小圆形或椭圆形，无细胞碎片，
整体呈均匀微弱的蓝光;加入 MC －Ⅴ的实验组
(B、C、D组)可以看出随着药物浓度的增加，细胞
核逐渐固缩，染色质部分凝集，细胞已经开始受到
损伤，肿瘤细胞早中期凋亡的特征。随着作用时
间的延长，高蓝光 /红光逐渐增强，细胞核相比
48h时进一步固缩，染色质边集化严重，部分染色
质裂断，是肿瘤细胞中晚期凋亡的特征(图 1，见
封 2)。具体不同浓度的 MC －Ⅴ作用 Hela 细胞
48h和 72h后的细胞凋亡率见表 1，其中同一时间
点不同浓度之间的细胞凋亡率比较差异有统计学
意义(P ＜ 0． 01);同一浓度两个时间点之间比较，
除 0μg·mL －1浓度组比较差异无统计学意义外
(P ＞ 0． 05)，其余时间点组间比较均差异有统计
学意义(P ＜ 0． 05)。
表 1 不同浓度的 MC －Ⅴ作用 Hela细胞 48h和 72h后的细胞凋亡率
浓度 /
(μg·mL －1)
48h 细胞计数
VN NVN VA NVA 合计 凋亡率 /%
72h 细胞计数
VN NVN VA NVA 合计 凋亡率 /%
0 192 4 1 3 200 2． 0 185 6 4 5 200 4． 5
50 170 5 19 6 200 12． 5 138 8 24 30 200 27． 0＊
100 162 5 21 12 200 16． 5 76 9 41 74 200 57． 5＊
200 116 8 49 27 200 38． 0 61 13 48 78 200 63． 0＊
同一时间点不同浓度之间的细胞凋亡率比较 P ＜ 0． 01;与 48h比较＊P ＜ 0． 05
2． 2 MC －Ⅴ致人胃癌 MGC － 803 细胞凋亡的形
态学观察
镜下可见 48h 后 MGC － 803 细胞对照组(A
组)细胞形态均一，多为圆形，细胞质染色均匀，
内有较深的蓝色颗粒，呈现均匀低蓝光;加入
MC －Ⅴ的实验组(B、C、D 组)细胞核开始固缩，
部分细胞染色质凝集，随着药物浓度的增加，细胞
膜开始损坏，红光不断增强，出现膜状突起，凋亡
细胞整体呈现绿色或桔红色荧光，是肿瘤细胞早
中期凋亡的明显特征。72h 后细胞核固缩明显加
强，形成圆珠子状结构;D 组细胞膜损坏加剧，部
分细胞膜状突起更为明显，染色质部分高度凝集，
被 Hoechst染料染成亮蓝色;部分细胞边集化严
重，出现核碎裂、核裂解现象，呈现不均一的荧光
显色结构，肿瘤细胞中晚期凋亡的明显特征(图
2，见封 2)。具体不同浓度的 MC －Ⅴ作用MGC －
803 细胞 48h和 72h后的细胞凋亡率见表 2。
表 2 不同浓度的 MC －Ⅴ作用 MGC － 803 细胞 48h和 72h后的细胞凋亡率
浓度 /
(mg·mL －1)
48h 细胞计数
VN NVN VA NVA 合计 凋亡率 /%
72h 细胞计数
VN NVN VA NVA 合计 凋亡率 /%
0 196 1 2 1 200 1． 5 189 3 5 3 200 4． 0
50 164 3 28 5 200 16． 5 151 4 23 22 200 22． 5＊
100 153 3 35 9 200 22． 0 118 4 37 41 200 39． 0＊
200 101 4 84 11 200 47． 5 39 6 62 93 200 77． 5＊
同一时间点不同浓度之间的细胞凋亡率比较 P ＜ 0． 01;与 48h比较＊P ＜ 0． 05
·81·
1 期 李 洋，等 . 鹅绒藤中的黄酮苷类诱导肿瘤细胞凋亡的研究
2． 3 MC －Ⅴ致小鼠淋巴瘤 YAC － 1 细胞凋亡的
形态学观察
镜下可见 48h后 YAC －1 细胞对照组(A组)
呈正常小鼠淋巴瘤细胞形态，分布均一，细胞较
小，形态规则，圆形，胞质内含蓝色细小颗粒，染色
均匀，呈现均匀低蓝光;加 MC －Ⅴ的实验组(B、
C、D组)细胞随着 MC －Ⅴ浓度的增加，显示出不
断增强的蓝光和红光;细胞核固缩成小团块状，D
组由于染色质的集聚发出亮蓝光，典型的早中期
细胞凋亡形态结构。72h后实验组明显可见细胞
核固缩凝集成小团块状结构，发出极强的亮蓝光，
细胞核被 PI复染成大小不等的颗粒状深浅不均
的橘红色荧光，典型的晚期细胞凋亡形态结构;此
外还可见到部分细胞质呈均匀高红染色的死亡细
胞(图 3，见封 2)。具体不同浓度的 MC －Ⅴ作用
YAC －1 细胞 48h和 72h后的细胞凋亡率见表 3。
表 3 不同浓度的 MC －Ⅴ作用 YAC － 1 细胞 48h和 72h后的细胞凋亡率
浓度 /
(μg·mL －1)
48h 细胞计数
VN NVN VA NVA 合计 凋亡率 /%
72h 细胞计数
VN NVN VA NVA 合计 凋亡率 /%
0 194 5 0 1 200 0． 5 186 9 2 3 200 2． 5
50 175 7 16 2 200 9． 0 152 10 28 10 200 19． 0＊
100 163 8 23 6 200 14． 5 113 16 46 25 200 35． 5＊
200 128 11 49 12 200 30． 5 79 19 48 54 200 51． 0＊
同一时间点不同浓度之间的细胞凋亡率比较 P ＜ 0． 01;与 48h比较＊P ＜ 0． 05
3 讨论
细胞死亡有两种不同的方式即细胞坏死和细
胞程序性死亡(PCD)，PCD 又可以分为细胞凋亡
和非凋亡方式进行［4］。细胞坏死是细胞的一种
被动性死亡过程，是细胞在生理过程中受到化学、
物理、生物及缺氧与营养不良等因素作用时引起
的自身损伤，通常会由于酶性消化和蛋白变性等
引起的病理性形态变化。以往人们总把细胞死亡
等同于细胞坏死，而忽略了细胞死亡的生理调控
机制，随着分子生物学研究的进展，证明细胞死亡
中存在不同于坏死的，由基因编制程序控制的另
一种死亡方式，即细胞凋亡［5］。细胞凋亡是在一
系列基因的激活、表达以及调控等作用下，为了维
持自己的内环境而发生的主动性死亡过程，又称
细胞程序性死亡［6］，常伴有一些生物学变化特
征，导致了最直接的形态学变化。
细胞凋亡与坏死的检测方法很多，但肉眼的
形态学观察检测仍是鉴定细胞凋亡最经典的标
准［7］，其优势在于可以在显微镜下最直观的看出
细胞发生凋亡与死亡的形态学变化过程。细胞在
发生凋亡时，其细胞核膜通透性增强、染色体的
DNA结构发生改变和膜上的 p －糖蛋白泵功能受
损等等发生一系列的变化，与各种荧光染料的结
合能力和作用方式也各不相同，且这种变化不同
于细胞膜已被破坏的死亡细胞，利用这些特征，本
文采用优于其他双染法的荧光 Hoechst33342 /PI
双染，根据其与荧光染料的结合发出不同程度荧
光的变化，分析出细胞的活性状态。
本实验研究结果可以看出 MC － Ⅴ在作用
Hela细胞和 MGC － 803 细胞 48h 后，其胞核固
缩，部分染色质凝集，形成强蓝光;同时胞膜开始
损坏，红光不断增强，存在膜状突起，MGC － 803
细胞比 Hela细胞更为明显;72h 后，核固缩加强，
形成明显的圆珠子亮蓝光结构;可见两个时间点
中处于早中期凋亡的细胞较多，死亡细胞较少。
由表 1 和表 2 中可以看出 MC －Ⅴ作用于肿瘤细
胞的时间越长，浓度越大，凋亡细胞越多，在
200μg·mL －1浓度作用下的 MGC － 803 细胞和
Hela细胞最大凋亡率分别为 77． 5%、63． 0%，分
析原因可能是由于 MC － Ⅴ直接抑制了 MGC －
803 细胞和 Hela细胞的增殖，并在相关基因和蛋
白的调控下，阻滞细胞的复制周期，将肿瘤细胞阻
滞于某一周期内，或诱导癌细胞逆转分化，从而达
到抑制肿瘤细胞增殖的效果。同样作用于YAC －
1 细胞 48h后，随着浓度的提高，胞核开始凝集固
缩，显示出不断增强的强蓝光;72h 后明显可见胞
核凝集成小团块状结构，发出极强的亮蓝光和红
光的晚期凋亡细胞增多，与对照组相比，高红荧光
染色的死亡细胞也在增多。由表 3 中可以看出时
间越长、浓度越大，MC －Ⅴ作用于 YAC － 1 细胞
后所致的凋亡细胞就越多，在最大浓度 200
μg·mL －1作用下 48 和 72h时的细胞凋亡率分别
为 30． 5%、51． 0%，我们分析可能是由于 MC －Ⅴ
作用 YAC －1 细胞后，在相关基因的调控下加快
诱导肿瘤 YAC － 1 细胞凋亡和坏死;也可能是直
接作用于 YAC － 1 细胞的核酸和蛋白质，使之合
成受到障碍或被破坏，从而促进 YAC － 1 细胞的
凋亡与死亡。
·91·
宁夏医科大学学报 36 卷
本文进一步验证了 MC －Ⅴ是鹅绒藤抗肿瘤
活性的主要成分，可诱导不同的肿瘤细胞产生不
同的凋亡形态，表明其致使肿瘤细胞凋亡的作用
机制不同。
参考文献:
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用的实验研究［J］． 宁夏医科大学学报，2011，33
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性的研究［J］． 宁夏医科大学学报，2013，35(6):
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色法在药敏试验中的可行性探讨［J］． 癌症，1999，
18 (3):359 － 360．
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究进展［J］． 东北农业大学学报，2006，37(2):
238 － 244．
［5］ 徐吉山．细胞坏死及细胞程序性死亡和细胞凋亡
［J］．大理师专学报，1998，2:43 － 44．
［6］ 张晓军，姚天明，王文亮．细胞凋亡的最新研究进展
［J］． 第四军医大学学报，2002，23:42 － 44．
［7］ 赵卫红，寿好长，闫福岭．细胞凋亡［M］． 郑州:河南
医科大学出版社，1997:53 － 96．
(责任编辑:任义芳)
Apoptosis of Tumor Cells Induced by the Flavonoid Glycosides
from Cynanchum Chinense
LI Yang1， WANG Qi2
(1． Dept． of Clinical Laboratory，263 Clinical Dept． of General Hospital of Beijing Military Area Command，
Beijing 101149; 2． School of Basic Medicine，Ningxia Med． Univ．，Yinchuan 750004)
Abstract:Objective To observe the morphological changes of tumor cells apoptosis with the different con-
centrations of kaempferol － 7 － O － α － L － rhamnose glycoside (Monomer Compounds －Ⅴ，MC －Ⅴ)from
Cynanchum Chinense flavonoids glycosides． Methods Apoptosis fluorescence Hoechst33342 /PI double dye
method was used after the human cervical cancer Hela cells，human gastric cancer cells MGC －803 and mouse
lymphoma cells YAC －1 were acted with the concentration of 50，100 and 200μg·mL －1，of MC －Ⅴ for 24h
and 48h． The morphological changes of tumor cells in the process of adding MC －Ⅴin fluorescence microsco-
py were observed． Ｒesults Microscopy showed uniform cytoplasm staining，morphological rules，uniformly
weak blue in normal control group． All three kinds of tumor cells treated with MC －Ⅴshowed nuclear conden-
sation，chromatin condensation，and concentration and time dependent cell membrane damage． Hela cell
showed margination of chromatin and part of chromatin breaking． MGC － 803 cells showed highly chromatin
condensation，nuclear fragmentation，serious margination，heterogeneous fluorescent color structure． YAC －1
cells showed small lumps of Karyopyknosis agglutination． The apoptosis rate of the three kinds of tumor cells
increased with the MC －Ⅴconcentration increased and duration of action prolonged． Conclusion MC －Ⅴ
can induce different tumor cells show different apoptotic morphology with a time － and dose － dependent man-
ner． It suggest that its role in the mechanism of action of tumor cells is different．
Key words:cynanchum chinense;hoechst33342 /PI;apoptosis;morphology
关于加注“通信作者”的要求
为顺应国际上的通行方法，更好地体现科研论文作者的分工协作关系，本刊决定在所发表的论文上可以注明通信
作者。通信作者可以是第一作者，也可以为其他作者，但必须是论文负责者，对论文的科学性和结果、结论的可信性负主
要责任，同时也是本刊和读者所联系的对象，本刊要求通信作者为研究生导师或科研课题的负责人。加注通信作者的主
要内容包括:作者姓名、单位、联系电话、电子信箱等信息。
(本刊编辑部)
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