全 文 ：第 32卷第 12期　　　　　　　　　西 南 大 学 学 报(自然科学版)　　　　　　　　　　　2010年12月
Vol.32　No.12 Journal of Southw est Unive rsity (N atural Science Edi tion) Dec.　2010
文章编号:1673-9868(2010)12-0097-05
毛葡萄原生质体分离与纯化研究①
袁　彬1 , 2 , 　潘学军1 , 2
1.贵州省果树工程技术研究中心 , 贵阳 550025;2.贵州大学 喀斯特山地果树资源研究所 , 贵阳 550025
摘要:以毛葡萄愈伤组织 、 悬浮培养细胞 、 无菌苗幼叶为材料 , 研究了毛葡萄原生质体的分离纯化方法及影响因
素.结果表明 , 毛葡萄原生质体分离材料以悬浮细胞和愈伤组织最好.毛葡萄愈伤组织在 0.5 mo l/ L甘露醇中预处
理 90 min , CPW+13%甘露醇+2%纤维素酶+0.25%果胶酶+0.5%离析酶的酶液中酶解 10 h , 其原生质体产量
最高可达 6.24×106 个/g , 活力为 86.83%.
关　键　词:毛葡萄;愈伤组织;原生质体;分离;纯化
中图分类号:Q949.756.3 文献标识码:A
毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)是贵州野生葡萄属植物中分布最广泛的种 , 其抗病 、抗逆性强 ,
但存在果粒小 、含酸量高 、可食率低等缺陷[ 1] , 遗传改良势在必行.由于葡萄遗传背景复杂 , 通过传统育种
方法进行品种改良有一定困难[ 2] .原生质体融合技术是近30年发展起来的体细胞杂交技术 , 它不仅可以克
服有性杂交的不亲和障碍 , 而且可以利用双亲的细胞质产生胞质杂种 , 因而已被广泛用于食用菌[ 3] 、稀有
树木[ 4] 和农作物的品种改良[ 5-6] .而原生质体的分离 、纯化是原生质体融合和植株再生的基础 , 要获得高
产量和高质量的原生质体 , 必须研究植物材料原生质体分离和纯化过程中的各种影响因素[ 7] , 为此本试验
研究了不同材料与不同试验条件对毛葡萄原生质体分离与纯化的影响 , 以期建立获得高产量 、高质量的毛
葡萄原生质体的方法 , 为毛葡萄原生质体培养及葡萄的品种改良奠定基础.
1　材料与方法
1.1　材　　料
以毛葡萄“花溪-4”无菌苗幼叶及诱导产生的愈伤组织和悬浮细胞为材料.试验于 2009 年 9月至 2010
年 5月在贵州大学果树科学实验室进行.
1.2　方　　法
1.2.1　试验材料的获得
取叶龄 40 ～ 60 d的无菌苗叶片(图 1A), 接种到愈伤组织诱导培养基 MS +2 mg/L 6-BA +0.5 mg/L
2 , 4-D上进行培养 , 培养温度为(25±1)℃, 开始 20 d在黑暗中培养 , 然后转到光下培养.每日光照
12 h , 光照强度为 2 000 lx .然后以诱导出的分散性良好 、黄绿色颗粒状的愈伤组织(图 1B)为材料 ,
①收稿日期:2010-06-08
基金项目:贵州省优秀科技教育人才省长专项资金[ 黔省专合字(2006)10号] ;贵州省优秀青年科技人才培养对象专项资金资助[ 黔科合人
字(2009)02号] .
作者简介:袁　彬(1984-), 女 , 山东聊城人 , 硕士研究生 , 主要从事喀斯特山地果树资源的利用与研究.
通讯作者:潘学军 , 副教授.
DOI :10.13718/j.cnki.xdzk.2010.12.026
在 MS+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2 , 4-D+0.1 mg/ L K T +400 mg/L CH 的液体培养基上振荡培养获
得悬浮细胞(图 1C).
1.2.2　原生质体的游离
取萌发 40 ～ 60 d的毛葡萄无菌苗叶片 1 g , 在超净工作台上用无菌手术刀切成 1 ～ 2 mm宽的细丝;
取分散性良好的愈伤组织 1 g , 将其碾碎;取悬浮培养细胞 , 在 500 r/min转速下 , 离心 5 min , 收集沉淀
物 1 g , 然后分别放入盛有酶液 10 mL 的 6 cm 培养皿中 , 并使其完全浸没于酶液 , 培养皿用 parafilm 封
口 , 置于摇床进行酶解.
酶液组成为 CPW盐溶液附加原生质膜稳定剂(MES)、不同浓度的甘露醇 、纤维素酶(Cellulase Ono-
zuka R-10)、果胶酶(Pecto ly ase Y-23)和离析酶(Macerozyme R-10)(具体组合见表3), pH 5.8 ～ 6.0 , 酶液
经 0.22 μm混合纤维素微孔滤膜过滤除菌.酶解过程在(25±1)℃恒温振荡培养箱(80 ～ 100 r/min)中黑暗
条件下进行.
1.2.3　原生质体的纯化
酶解结束后将悬浮有原生质体的酶液经 200目和 400目不锈钢筛网过滤 , 滤液再经 500 r/min离心
5min后去掉上清液 , 收集原生质体.再用 13%甘露醇与 25%蔗糖界面法离心 5 min , 将两液界面处的原生
质体(图 1D)轻轻吸出 , 置于另一离心管中 , 用原生质体培养基离心洗涤 2 ～ 3次 , 即可获得纯净的原生质
体(图 1E 、F).
1.2.4　原生质体产量和活力的测定
原生质体产量用血球计数板测定[ 8] , 以每克鲜重的起始材料分离得到的原生质体个数(个/g)来表示.
原生质体活力采用伊文斯兰染色法测定[ 9] .原生质体活力=(未染色原生质体数/观察的原生质体总数)×
100%.试验所得数据使用 DPS7.05数据分析软件进行处理.
A.无菌苗;B.愈伤组织;C.悬浮培养细胞;D.形成的原生质体条带;E.F.以愈伤组织为材料获得的原生质体.
图 1　毛葡萄原生质体的分离
2　结果与分析
2.1　不同材料对原生质体分离效果的影响
以不同材料在酶液组合(2%纤维素酶+0.25果胶酶+0.5%离析酶)中振荡酶解 , 酶解时间为 10 h.不
同材料对原生质体分离的影响结果见表 1.
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表 1　不同材料对毛葡萄原生质体分离效果的影响
材　料 产量/ 106 个· g-1 活力/ % 细胞碎片
愈伤组织 5.20a 84.67a +
幼叶 2.26b 82.17a ++
悬浮细胞 5.21a 84.89a +
　　注:1.按邓肯氏新复极差法测定差异显著性(p=0.05);2.“ +”表示较少 , “ ++”表示较多.
从表 1可以看出 , 悬浮细胞和分散性良好的愈伤组织的原生质体产率无差异 , 原生质体产量分别为
5.21×106 个/g 、 5.20×106 个/g , 原生质体活力分别为 84.89%,84.67%, 两者都是分离原生质体的良好
材料.无菌苗幼叶分离效果差 , 且细胞碎片较多 , 不适用于原生质体分离 , 其原生质体分离条件有待进一
步探讨.这可能与愈伤组织 、悬浮细胞的生理年龄较小 , 细胞的组织结构较一致有关.以下均以分散性良
好的愈伤组织为试验材料.
2.2　质壁分离时间对原生质体分离效果的影响
毛葡萄愈伤组织在 0.5 mo l/L 甘露醇溶液中质壁分离 0 min ,30 min ,60 min ,90 min ,120 min后 , 在纤
维素酶 2%+果胶酶 0.25%+离析酶 0.5%的酶液中黑暗酶解 10 h , 比较不同质壁分离时间对原生质体分
离的影响.
从表 2可以看出 , 质壁分离时间对原生质体分离有明显影响.当处理时间介于 0 ～ 90 min之间时 , 随
着处理时间逐渐延长 , 原生质体产量明显增加 , 活力也明显增强.当处理时间为 90 min时 , 得到的原生质
体产量和活力最高.但处理时间大于 90 min 时 , 原生质体产量和活力都有所下降 , 且细胞碎片增多.
表 2　质壁分离时间对原生质体分离效果的影响
时间/ min 产量/ 106 个· g-1 活力% 细胞碎片
0 5.20b 84.67ab +
30 5.21b 83.00b +
60 6.01a 85.06ab ++
90 6.24a 86.83a ++
120 6.15a 86.06ab +++
　　注:1.按邓肯氏新复极差法测定差异显著性(p=0.05);2.“ +”表示较少 , “ ++”表示较多 , “ +++”表示很多.
2.3　不同酶液组合对原生质体分离效果的影响
毛葡萄愈伤组织在黑暗条件下振荡酶解 8 h , 比较不同酶液组合对原生质体分离的影响 , 结果见表 3.
表 3　不同酶液组合对原生质体分离效果的影响
编号 酶液组合纤维素酶/ % 果胶酶/ % 离析酶/ %
产量
/ 106 个· g-1
活力
/ % 细胞碎片
A 0.50 0.50 0.50 2.60c 86.44ab +
B 1.00 0.25 0.50 3.22b 89.83a +
C 2.00 0.25 0.50 4.45a 87.78a +
D 3.00 0.25 0.50 4.47a 81.72b ++
　　注:1.按邓肯氏新复极差法测定差异显著性(p=0.05);2.“ +”表示较少 , “ ++”表示较多.
从表 3可以看出 , 酶液组合对原生质体分离有明显影响.愈伤组织在酶液组合 C 中的原生质体分离效
果最好.纤维素酶对原生质体分离的产量影响很大 , 随着纤维素酶浓度的逐渐增加 , 原生质体产量明显上
升 , 但明显可见原生质体活力下降 , 细胞碎片增多 , 而果胶酶则影响不明显.综合考虑 , 产量适中 、活力较
高和细胞碎片较少的酶液组合为纤维素酶 2.00%+果胶酶 0.25%+离析酶 0.50%.
2.4　不同甘露醇浓度对原生质体分离效果的影响
甘露醇是植物细胞质壁分离常用的渗透压稳定剂 , 可以促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂.
毛葡萄愈伤组织在酶液(纤维素酶 2.00%+果胶酶0.25%+离析酶 0.50%)中振荡酶解8 h , 比较不同甘露
醇浓度对原生质体分离的影响.
从表 4可以看出 , 甘露醇浓度对原生质体的产量和活力有明显影响.随着甘露醇浓度的升高 , 原生质
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体产量明显增加 , 在 0.5 mo l/L 时达到最大.当甘露醇浓度超过 0.5 mol/L 时 , 随着甘露醇浓度的升高 ,
原生质体产量和活力逐渐下降 , 细胞碎片也逐渐增多.综上所述 , 毛葡萄愈伤组织原生质体分离中 , 甘露
醇浓度应以 0.5 mo l/L 为宜.
表 4　不同甘露醇浓度对原生质体分离效果的影响
甘露醇浓度/mo l/ L 产量/ 106 个· g-1 活力/ % 细胞碎片
0.3 1.93c 81.67b ++
0.4 3.84b 86.83ab +
0.5 4.45a 87.78a +
0.6 4.23a 85.00ab +
0.7 3.61b 82.89ab ++
　　注:1.按邓肯氏新复极差法测定差异显著性(p=0.05);2.“ +”表示较少 , “ ++”表示较多.
2.5　不同酶解时间对原生质体分离效果的影响
从表 5 可以看出 , 酶解时间对原生质体的产量和活力都有明显的影响.在酶解前期 , 随着酶解时
间的增加 , 原生质体产量也明显增加 , 在 10 h时达到最高.酶解时间超过 10 h 后 , 随着酶解时间的
增加 , 原生质体产量和活力都显著下降 , 细胞碎片也明显增加.因此 , 毛葡萄愈伤组织振荡酶解的时
间应以 10 h为宜.
表 5　酶解时间对原生质体分离效果的影响
酶解时间/ h 产量/ 106 个· g-1 活力/ % 细胞碎片
4 h 0.74f 84.00abc +
6 h 1.77e 86.50ab +
8 h 4.45b 87.78a +
10 h 5.20a 84.67ab +
12 h 5.07a 83.00bcd ++
14 h 4.18c 80.22cd ++
16 h 3.73d 78.94d +++
　　注:1.按邓肯氏新复极差法测定差异显著性(p=0.05);2.“ +”表示较少 , “ ++”表示较多 , “ +++”表示很多.
3　讨论与结论
对于原生质体的分离 , 分离材料的选择对原生质体分离效果有显著影响.在以往研究中 , 悬浮培养细
胞常作为原生质体的分离材料[ 10] , 本试验中以悬浮细胞为材料获得的原生质体产量和活力都较高 , 但是悬
浮细胞的建立和保持都较困难 , 因此本试验中以未经继代培养 、结构较为紧实的淡绿色愈伤组织为材
料[ 11] , 获得的原生质体产量和活力都较理想 , 与以悬浮细胞为材料获得的原生质体无差异 , 因此愈伤组织
可作为毛葡萄原生质体分离的首选材料.
酶解前对材料进行一定方式的预处理 , 可以改变细胞或细胞壁的生理状态 , 增加细胞膜的生理强度 ,
达到提高细胞壁酶解的酶解效率 , 减少原生质体损伤的目的 , 能有效地提高原生质体的产量和活力[ 12] .本
试验结果得出 , 毛葡萄愈伤组织在 0.5 mo l/L 甘露醇预处理 90 min , 原生质体产量提高了 20.0%, 原生质
体活力提高了 2.55%.另外 , 在原生质体分离的整个过程中 , 对试验材料的轻拿轻放也需要特别注意.
对于原生质体的分离 , 酶解是关键 , 酶解中酶的种类的选择应适宜.目前用于植物原生质体分离的酶
主要有纤维素酶 、果胶酶 、离析酶 、半纤维素酶 、崩溃酶 、蜗牛酶等 , 酶液浓度也随酶解材料不同而略有差
异 , 一般情况下 , 纤维素酶 、果胶酶 、离析酶的质量分数分别为 1%～ 3%, 0.05%～ 2%和 0.5%～
1.5%[ 11] .酶解前 , 酶液在 55 ℃水浴锅中加热 10 min , 以加强酶的活性和去除 DNA 酶[ 13] .本试验中 , 酶
液组成以纤维素酶 R-10 2%+果胶酶 0.25%+离析酶 0.5%较适宜 , 原生质体产量和活力都很好.在原生
质体纯化过程中 , 使用与原生质体分离过程中相同浓度的质膜稳定剂 , 也能在很大程度上缓解原生质体在
清洗过程中由于渗透式和离子平衡骤变而引起的水解和涨变效果[ 14] .
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Protoplast Isolation and Purification of Vitis quinquangularis Rehd
YUAN　Bin1 ,2 , 　PAN Xue-jun1 , 2
1.Guizhou Engineering Research Center for Fruit Crops , Guiyang 550025 , China;
2.Research Institute for Fruit Resource of Karst Mountain Region , Guizhou University , Guiyang 550025 , China
Abstract:To establish a good sy stem of protoplast iso lation and purif icat ion fo r Vit is quinquangularis Re-
hd , calli , suspension cells and tube-plant leaves o f V.quinquangularis we re used as explants to study the
inf luencing facto rs fo r protoplast iso lation and purification.The results showed that the most sui table ma-
terials we re calli and suspension cells for pro toplast isolat ion.Pret reating the calli of V.quinquangularis
with 0.5 mol/L mannitol and zymoly zing them in an enzyme liquid of CPW+0.5 mo l/L mannito l +2%
cellulose +0.25%pectinase +0.5%macetating enzyme for 90 min gave the highest yield o f pro toplast of
6.24×106/g w ith a viability of 86.83%.
Key words:Vit is quinquangularis Rehd;callus;pro toplast;iso lation;purif ication
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