全 文 ：2 0 14年 月
四倍体鸡蛋参的诱导与鉴定 ■
张亚楠 严 毕丽伟 , ” 黄秀梅 通讯作者 王雅英 , ”
摘 要 泪 的 利 用秋水仙素处理和组织培养技术诱导鸡蛋参多倍体 , 丰富现有遗传资源 。 方法 通过不 同浓度 住 一住 的秋水仙
素和不 同的诱导时间 一 处理 已得到的鸡蛋参无菌苗 。 结果 诱导株经流式细胞术检测 , 获得秋鸡蛋参四倍体 、嵌合体和八倍体 。
结论 住 秋水仙素处理 , 四倍体诱导率在 , 诱导效果最佳 。
关键词 鸿蛋参 多倍体 秋水仙素 流式细胞术
中图分类号 丑 文献标识码 八 文章编号 一 一 一
讯
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鸡蛋参 才吉梗科党参属植物 , 表 秋水仙素诱导处理对成活率和芽苗生成率的影响
多年生缠绕草本 是一种常用的藏药 其藏药名 “尼哇 ” 。 一般分布
于西藏南部 、 四川西部 、 云南等地 庄于海拔 一 的草坡
或灌丛中 。 鸡蛋参的化学成分研究 。 《晶珠本草 》记载 尼哇治胸
痛 、 感冒 并止呕逆 、开 胃 。 现在藏医则认为 鸿蛋参味甘 、 性平 庄
要用于清热 、 治感冒 习。 在野外 ,由于鸡蛋参自身的繁殖系数比较
低 再加上近年来高原生态环境的破坏和人们的大量采挖 ,鸡蛋
参野外分布的地 区和数量锐减 ,资源濒临灭绝 属于一级 濒危
濒临灭绝的野生藏药品种
解决目前药用植物资源医乏的问题 ,以育种为核心的种质资
源创新和突破将起到决定性的作用 ,多倍体育种的手段则是其 中
最有可操作性的一种手段 问。 国内目前已进行了少量鸡蛋参组织
培养的研究 划 但尚无鸡蛋参多倍体诱导的报道 。 本研究首次对
鸡蛋参种质资源进行 了遗传改良 , 创造了四倍体鸡蛋参新种质 ,
为鸡蛋参新品种选育提供了新材料 。
材料与方法
材料 二供试的鸡蛋参无菌苗由厦门中药生物工程重点实验室
培育 材料取自西藏林芝地区科技局种植基地 。
方法
多倍体诱导 二配制多倍体诱导液体培养基 一住
秋水仙素 摊 蔗糖 将已经培养得到的无菌材料切
成 一 带芽茎节 ,放入诱导培养基中 ,摇床 设定 ℃ ,
处理 海个处理 个材料 取出后无菌水清洗 次 放入
不含秋水仙素的继代培养基中进行培养 乃次平行实验 , 统计存
活率 诱导率及变异率 取平均值 。
对照组用不含秋水仙素的相同培养基进行相同的处理 。
再生植株的获得 二将秋水仙素处理组和对照组的带芽茎段
转接到继代培养基上进行培养 , 诱导芽苗生长 乃 后统计茎段
的存活率和芽苗形成率 。 将培养出的芽苗转接到生根培养基培
养 得到健壮的再生植株 。
用流式细胞仪进行倍性分析 二取对照组和处理组的含叶片
茎节 海个材料长度为 一 。 用 。 公司的
试剂盒进行样品处理 标记 总量 ,然后用 ,
进行荧光检测 , 波长 的紫外光激发 肠 士 收集发射
光 得到检测样品得 含量图 。
结果与分析
秋水仙素诱导处理
■基金项目 科技部援藏项目 厦门市科技项目 `培育多倍体鸡蛋参的
研究 ”
, 厦门市医学高等专科学校
, , 福建省道地药材生物工程重点实验室
年 月 日收稿
秋水仙素浓度 处理时间 死亡率 芽苗形成率
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刀 注
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实验发现 秋水仙素浓度增大高 所处理材料死亡率增高 芽
苗形成率降低 。 对于低浓度的秋水仙素 浓度 蕊 死亡率最
高出现在处理了 之后 而对于高浓度的秋水仙素 浓度
材料处理了 的死亡率最低 。 对于芽苗的诱导率 随着
秋水仙素浓度升高 苗芽的诱导率降低 。 低浓度秋水仙素 浓度 蕊
处理时 诱导时间对苗芽形成率的影响没有明显的规律性 。
高浓度秋水仙素 浓度 处理时 诱导时间越长 蔺芽的形
成率越低。
多倍体植株的筛选鉴定 经过秋水仙素处理的材料 经过继代
及生根培养产生了新的再生植株 。 用流式细胞术对再生植株进行
筛选和鉴定 。 仪器设定相 同参数 ,以正常二倍体植株 含量的
荧光值作为对照 ,图一 、 图二为所获取的峰图 其中 横坐标为荧
光强度 纵坐标为粒子数 。 用公式 计算需检测样品的倍性水
DOI :10.16040/j.cnki .cn15-1101.2014.05.058
5 6 内蒙古中医药
平。 公式
待测样本的 倍性水平 一参照样本的倍性水平 ,
表 不同秋水仙素处理对多倍体植株诱导的影响
待侧样本 。或 峰的荧光值
参照 样本肠或 峰的荧光值 秋水仙素浓度
处理时间 四倍体
诱导率
嵌合体
诱导率
八倍体
诱导率丝
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伪,未经秋水仙素诱导的鸡蛋参 参照样本 含量图
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图二 秋水仙素诱导后鸡蛋参 待测样本 的 含量图
如图一所示 ,已知参照样本为 其 。期 期的平均荧光
密度 一 值为 周二所示 持测样本 。期 , 期的平均
荧光密度 一 值为 ,根据公式 可得 ,待测样品的
含量为 。
用同样的方法对诱导后的材料进行检测 。 有芽苗长出的
棵材料中 洪筛选到 四倍体材料 株 八倍体材料 株 ,嵌合体
材料 株 。 详细结果见表 。 综合考虑 秋水仙素处理后材料的
存活率 分化率 、 再生植株的数量和多倍体的诱导率及嵌合体的
诱导率等因素 , 认为以带芽茎节作为材料 众 秋水仙素处理
诱导效果最佳 四倍体植株的诱导率为 。
对多倍体植物进行继代培养的过程中发现 ,四倍体植株表现
出一些与二倍体植株不同的性状 二二倍体植株茎干正常 叶片较
小 叶色正常 四倍体植株更为健壮 茎干稍粗 ,叶片较大较厚 数
量较多 ,叶色更深
图 四倍体与二倍体组培苗比较
讨 论
近年来 生态环境破坏严重 栽培品种品质退化严重 野生资
源也逐年减少 , 通过多倍体育种技术对药用植物进行种植改良
对于改善药用植物的紧缺现状具有重要意义
秋水仙素诱导是多倍体诱导 中应用最广泛的方法 , 浓度
住 一 之间的秋水仙素均有诱导成功的报道 。 由于不同
植物对秋水仙素的敏感程度不同 适合诱导的秋水仙素浓度和处
理时间也不同 。 一般来讲 秋水仙素的浓度越高处理时间越长 材
料的死亡率越高 苗芽生成率越低 。 本实验的统计数据显示 鸡蛋
参对秋水仙素浓度变化很敏感 。 随着秋水仙素浓度增加 鸿蛋参
死亡率增加 芽苗生成率降低 。 而对于低浓度秋水仙素
的处理时间没有表现出很强的规律性 。 但是 对于较高浓度的秋
水仙素 一 随着处理时间的增加 鸿蛋参死亡率成升高趋
势 芽苗形成率成下降趋势 。 以芽为材料 诱导后的存活植株中通
常含有较多的嵌合体 遗传物质的多样会引起后代植株遗传的不
稳定 。 因此 对于诱变条件的选择 必须要综合考虑诱变率 、 芽苗
形成率以及嵌合体形成率等各个因素 。 对于鸡蛋参而言 瓜 秋
水仙素处理 、 住 秋水仙素处理 、 住 秋水仙素处理
和 其四倍体的诱导率均在 以上 但把芽苗的生成率
以及嵌合体的诱导率这两个因素考虑其中 ,即筛选到最合适的诱
导条件为 住 诱导 四倍体诱导率为 ,苗芽发生率为
科 在该浓度得到的多倍体大多为纯合体 后代植株的遗传稳
定 河以较快地应用于生产 。
如何从大量的鸡蛋参诱导株中筛选到四倍体植株是本实验
的关键环节 。 多倍体的鉴定有很多种方法 包括传统的形态学 、 气
孔观察 、 染色体核型染色等方法 ,以及近年来发展的流式细胞术
分析法阴 经秋水仙素处理后的刚形成鸡蛋参芽苗 很难从外部形
态上判断是二倍体植株还是多倍体 多次继代后 多倍体植株才
表现出茎干加粗 叶片增厚增大 数量增多 叶色加深 。 但是 这种
形态表征只能作为多倍体植株筛选的辅助指标 。本实验中选用流
式细胞术检测诱导植株的 含量 并对其倍性进行分析 。 与传
统的染色体核型染色法相比 流式细胞术分析法并不局限于分裂
期 细胞检测材料可选范围大 并且步骤简单、 方便快捷降 。 每一
个鸡蛋参待检样品从准备到检测结束只需要 一 分钟 。 这对于
需要筛选大量材料的多倍体诱导而言 具有非常重要的意义 。 随
2 0 14年 月
着流式细胞仪的应用普及 ,以及样品制备技术越来越成熟 措助
流式细胞术进行 含量检测和倍性分析 , 必将成为多倍体鉴
定的最主流方法。
多倍体药用植物的细胞和器官通常会表现出 “ 大型性 ” 对
不良环境的抵抗力更强 周 。 植物的倍性变化往往会引起植株中
次生代谢物的含量改变 。 本研究成功得到了鸡蛋参四倍体 这
在鸡蛋参的研究中为首次报道 ,为选育产量高 、抗逆性强 、 有效成
分含量高的鸡蛋参优质新品种提供了充足的材料 对于保护濒危
藏药鸡蛋参和缓解其紧缺现状具有重要意义 。
参考文献
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唐宁 , 高山林 白术同源 四倍体株系的鉴定和有效成分的含量
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田永生 , 赵晓明 蒲公英二倍体和四倍体的几个生理指标比较
中国农学通报 , , 一
热感宁胶囊中黄等普含量的测定
彭小 萍
摘 要 泪 的 建立热感宁胶囊中黄答井含量的测 定方法 。 方法 采用 测 定黄答中黄答井的含量 。 结果 黄答井在 一 哪
内呈 民好的线性关 系 , 。 平均回收率为 , 。 结论 该方法简便易行 , 重复性好 , 可作 为该制剂的质量控制方法 。
关键词 二热感宁胶囊 黄答井
中图分类号 丑 文献标识码 八 文章编号 一 一 一
, ,
丁 丁
忍 一 林 卿 乡 , 翔
石 , 石 丁
丑 尹 赶
热感宁胶囊是本院临床医师根据中医理论 经过实践总结成 林 流动相 二甲醇一 磷酸 脸测波长 才主温 二
而的临床验方 油黄等 、 柴胡 、 板蓝根 、 大黄 、 水牛角 、 连翘等药材 ℃ 。 理论板数按黄等苔峰计应不低于
组成 肩清热解毒 泻火利咽功效 。 用于小儿外感风热所致的感 对照品溶液的制备 精密称取黄等苔对照品 ,置
冒 症见高热 、头痛 、 咽喉肿痛 、 鼻塞流涕 。 处方中君药黄等具清热 量瓶中 加 乙醇适量 超声 放冷 加 乙醇定容至
燥湿 、 泻火解毒作用 庄要成分为黄等苔 、 汉黄等苔 、黄等素 、 汉黄 刻度 摇匀 ,即得 。
等素等黄酮类化合物 黄等药材中主要活性成分为黄等苔 。 为更 供试品溶液的制备 取本品适量 研细 取约 住 精密称定 ,
好地控制该产品的质量 保证临床用药安全 本实验采用高效液 精密加入 乙醇 ,超声处理 放冷 再称定重量 ,用
相色谱法测定了热感宁胶囊中黄等苔的含量 为制订和完善制剂 乙醇补足损失的重量 ,摇匀 几 林 微孔滤膜滤过 ,取续滤
的质量控制体系提供参考依据 。 液 即得 。
仪器与试药 阴性样品溶液的制备 取缺黄等阴性样品 ,精密称定 胺
岛津 一 高效液相色谱仪 四元梯度泵 ,自动进样器 , “ ” 项同法制得缺黄等阴性样品溶液 。
电子天平 瑞士梅特勒公 司 术 超声波清洗 专属性试验 二取对照品溶液 、 供试品溶液和阴性样品溶液各
机 昆山市超声波仪器厂 颇率 劝率 。 时 在上述色谱条件下进行测定 。 结果表明 缺黄等阴性溶液
黄等苔对照品 批号 一 购于 中国药品生物制 对黄等苔的测定无干扰 黄等苔色谱峰与相邻色谱峰分离度大于
品检定所 。 热感宁胶囊样品 本院 自制 , 批号 二 、 、 见图 。
用醇为色谱纯 水为重蒸馏水 其他试剂均为分析纯 。 石 线性关系考察 胺 “ ” 项下色谱条件 ,分别精密吸取对照品
方法与结果 溶液 、 、 、 、 、 闪进样 测定黄等苔峰面积 。 以黄等苔进样
色谱条件 二色谱柱 八 一 柱 , 量 为横坐标 相对应的峰面积 为纵坐标绘制标准曲线 得
, 重庆医科大学附属第二医院 回 归方程 一 厂 ,结果表明 ,黄等苔进
年 月 日收稿 样量在 一 林 范围内具有良好的线性关系 。