全 文 ：第３５卷第４期　　　　　　　　　 西 南 大 学 学 报 （自然科学版）　　　　　　　　　　　２０１３年４月
Ｖｏｌ．３５　Ｎｏ．４ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ａｐｒ．　２０１３
文章编号：１６７３－９８６８（２０１３）０４－００３２－０７
通江百合ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系优化及引物筛选
①
智　丽１，　滕中华２，　李先源１，
眭顺照１，　李名扬１
１．西南大学 园艺园林学院，重庆市花卉工程技术研究中心，南方山地园艺学 教育部重点实验室，重庆４００７１６；
２．西南大学 农学与生物科技学院，重庆４００７１６
摘要：利用正交设计和单因素试验相结合的方法，从模板ＤＮＡ，引物，ｄＮＴＰｓ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，Ｍｇ２＋等５因素４
水平来优化通江百合ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系，优化后的反应体系为 Ｍｇ２＋２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．２５Ｕ，
ｄＮＴＰｓ　０．２５μｍｏｌ／Ｌ，引物０．２５μｍｏｌ／Ｌ，模板ＤＮＡ　５０ｎｇ，总体积为２５μＬ．依据优化后的体系从１４４对引物中筛
选出扩增条带清晰，多态性丰富的引物组合２４对，体系验证结果表明，优化后的体系具有较高的稳定性和重复性．
关　键　词：通江百合；体系优化；ＳＲＡＰ
中图分类号：Ｑ９４９．７１＋８．２３；Ｓ６８２．２＋９ 文献标志码：Ａ
通江百合（Ｌｉｌｉｕｍ．ｓａｒｇｅｎｔｉａｅ　Ｗｉｌｓｏｎ）又名泸定百合，为百合科百合属多年生草本植物，花白色、喇叭
花型，植株高大，具珠芽，其分布区域广，生态适应性强，居群间多型性明显［１］．在我国主要分布于四川、
重庆、云南等地，生长于海拔６００～２　５００ｍ山地灌丛或溪边岩石上［２］．鳞茎富含淀粉和多种生物碱，可鲜
食亦可用于加工制作保健品，干燥肉质鳞叶入药，清热润肺，治阴虚久咳，痰中带血，虚烦惊悸［３］．药用和
园林应用前景广阔．
相关序列扩增多态性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＲＡＰ）技术发表于２００１年［４］，现已
广泛应用于多种植物的指纹图谱构建［５－６］、遗传关系分析［７］、ＱＴＬ定位［８－９］等多个领域，其稳定、便捷、高
效等优点得到了一致公认［１０］，而其在通江百合研究中的应用少见报道［１１］．ＳＲＡＰ标记是一种基于ＰＣＲ扩
增的分子标记技术，扩增结果受反应条件影响较大，因此针对不同的反应条件及不同试验材料需优化试验
体系．正交试验能分析各因素之间的内在规律，快速查找到各因素的最佳组合［１２］，本试验先采用正交设
计，从 Ｍｇ２＋，Ｔａｑ　ＤＮＡ酶，ｄＮＴＰｓ，引物，模板ＤＮＡ等５因素４个水平对体系进行优化，由于正交试验在
试验结果评价上主观性较强，容易忽视单一因子的客观影响［１３］，因此在此正交试验基础上，结合单因素的
试验方法进行体系优化以求获得最优反应体系是十分必要的，同时对ＰＣＲ试验中已筛选出的引物的退火
温度进行检测，利用不同地理分布居群样品对优化后的体系进行验证，以求为通江百合遗传多样性研究和
指纹图谱构建等提供科学参照．
① 收稿日期：２０１２－０８－０３
基金项目：国家自然科学基金（３０８７２０６３）；中央高校基本科研业务费专项资金（ＸＤＪＫ２０１０Ｃ０７７）；西南大学博士启动基金项目
（ｓｗｕ１１２０２３）资助．
作者简介：智　丽（１９７３－），女，黑龙江桦南人，博士，讲师，主要从事园林植物种质资源与遗传育种研究．
通信作者：李名扬，教授，博士生导师．
DOI:10.13718/j.cnki.xdzk.2013.04.030
１　材料和方法
１．１　材　料
试验所用材料为自然生长的通江百合［１１］，体系优化、引物筛选及退火温度检测以金佛山居群通江百合
为模板．体系检验所用模板源自重庆范围内不同地理分布居群．
１．２　方　法
１．２．１　ＤＮＡ提取与ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增
取幼嫩叶片，采用改良ＣＴＡＢ法［１４－１５］提取基因组ＤＮＡ．引物设计参照Ｌｉ的原则［４］由上海英俊公司
合成，引物序列见表１，ｄＮＴＰｓ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司（ＴａｋａＲａ）．ＰＣＲ扩增
在ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ　ＰＣＲ仪上进行，扩增程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，３７℃复性
１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，５个循环，９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃复性１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，４０个循环，
７２℃延伸１０ｍｉｎ．４℃保存．扩增产物经１．５％琼脂糖电泳分离（１×ＴＡＥ，８０Ｖ，１００ｍｉｎ），Ｂｉｏ－ｒａｄ凝
胶成像系统观察、照相．
表１　用于遗传关系分析的ＳＲＡＰ引物序列
引物 正向引物序列（５′～３′） 引物 反向引物序列（５′～３′）
ＭＥ１ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡ　 ＥＭ１ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＴ
ＭＥ２ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ　 ＥＭ２ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣ
ＭＥ３ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＴ　 ＥＭ３ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣ
ＭＥ４ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣ　 ＥＭ４ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡ
ＭＥ５ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧ　 ＥＭ５ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣ
ＭＥ６ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡ　 ＥＭ６ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＡ
ＭＥ７ ＴＧＡＧＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣＣ　 ＥＭ７ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＧ
ＭＥ８ ＴＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＡＡＧ　 ＥＭ８ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＣ
ＭＥ９ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＧ　 ＥＭ９ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧ
ＭＥ１０ ＣＴＧＧＴＧＡＡＴＧＣＣＧＣＴＣＴ　 ＥＭ１０ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＧ
ＭＥ１１ ＴＧＡＧＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＴＧＣ　 ＥＭ１１ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧ
ＭＥ１２ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＴ　 ＥＭ１２ ＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡ
１．２．２　ＳＲＡＰ体系优化
选用Ｌ１６（４５）正交表，各因素水平和正交试验设计分别见表２，Ｍ６ＥＭ１１为扩增引物，各处理重复２
次，总体积为２５μＬ，各处理的ｂｕｆｆｅｒ用量均为２．５μＬ，不足部分用ｄｄＨ２Ｏ补足，在正交试验筛选出的最
佳体系基础上，进行单一因素优化，即在保持其它几个因素不变的前提下，设置单一因素浓度梯度（表３），
以获得最优的反应体系．
１．２．３　引物退火温度筛选及最佳体系验证
采用优化后的体系对反应程序中第一步退火温度设置１２个梯度：３２．０，３２．１，３２．６，３３．５，３４．６，３５．９，
３５．９，３８．６，３９．９，４１．０，４１．９，４２．４，确定已筛选出引物的最佳退火温度，除退火温度不同外，反应程序与正
交试验设计相同．在引物最适退火温度下对体系进行验证，随机选取任意已筛选出的２对引物对不同产地
样品进行ＰＣＲ扩增，检验体系稳定性．
２　结果与分析
２．１　正交试验
正交试验１６个组合的ＰＣＲ产物均能扩增出条带，组合６扩增的条带最多且清晰，组合８扩增的条
带最少，根据桂腾琴等的方法［１６］对ＰＣＲ扩增结果进行打分，分值在１．５～１０之间，极差分析可以客观
反应出各因素对反应体系影响的大小，由表２结果可知，正交试验所涉及的５个因素对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ影响
３３第４期　　　　　　　　　智　丽，等：通江百合ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系优化及引物筛选
从小到大依次为：模板ＤＮＡ，引物浓度，ｄＮＴＰｓ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，Ｍｇ２＋．正交试验初步确定体系各因素
用量为组合６．
表２　ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系（４５）正交试验结果
编号
Ｍｇ２＋
／（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
ｄＮＴＰｓ
／（μｍｏｌ·Ｌ
－１）
Ｔａｑ　ＤＮＡ酶
／（Ｕ·２５μＬ
－１）
引物
／（μｍｏｌ·Ｌ
－１）
模板ＤＮＡ
／（ｎｇ·２５μＬ
－１）
平均得分
１　 ２．００　 ０．２０　 ０．２０　 ０．１０　 １０．００　 ４．５
２　 ２．００　 ０．２５　 ０．２５　 ０．１５　 ２０．００　 ３．５
３　 ２．００　 ０．３０　 ０．３０　 ０．２０　 ３０．００　 ２．５
４　 ２．００　 ０．３５　 ０．３５　 ０．２５　 ４０．００　 ３．５
５　 ２．５０　 ０．２０　 ０．２５　 ０．２０　 ４０．００　 ６．５
６　 ２．５０　 ０．２５　 ０．２０　 ０．２５　 ３０．００　 １０．０
７　 ２．５０　 ０．３０　 ０．３５　 ０．１０　 ２０．００　 ５．０
８　 ２．５０　 ０．３５　 ０．３０　 ０．１５　 １０．００　 １．５
９　 ３．００　 ０．２０　 ０．３０　 ０．２５　 ２０．００　 ７．０
１０　 ３．００　 ０．２５　 ０．３５　 ０．２０　 １０．００　 ７．５
１１　 ３．００　 ０．３０　 ０．２０　 ０．１５　 ４０．００　 ６．０
１２　 ３．００　 ０．３５　 ０．２５　 ０．１０　 ３０．００　 ４．５
１３　 ３．５０　 ０．２０　 ０．３５　 ０．１５　 ３０．００　 ６．５
１４　 ３．５０　 ０．２５　 ０．３０　 ０．１０　 ４０．００　 ６．０
１５　 ３．５０　 ０．３０　 ０．２５　 ０．２５　 １０．００　 ９．０
１６　 ３．５０　 ０．３５　 ０．２０　 ０．２０　 ２０．００　 ７．５
ｋ１　 ３．５０　 ６．１２５　 ７．００　 ４．１２５　 ５．６２５ －
ｋ２　 ５．７５　 ６．７５　 ５．８７５　 ４．３７５　 ５．７５ －
ｋ３　 ６．２５　 ５．２５　 ４．２５　 ６．００　 ５．８７５ －
ｋ４　 ７．２５　 ４．２５　 ５．６２５　 ６．１２５　 ４．５０ －
Ｒ　 ３．７５　 ２．５０　 ２．７５　 ２．００　 １．３７５ －
　　＊ｋ１－ｋ４：各因素水平的得分数据平均值：Ｒ：极差．
表３　ＳＲＡＰ－ＰＣＲ单因素实验各因素水平
因　　　素
水平（终浓度）
１　 ２　 ３　 ４
Ｔａｑ　ＤＮＡ酶（Ｕ·２５μＬ
－１） ０．２０　 ０．２５　 ０．３０　 ０．３５
Ｍｇ２＋／（ｍｍｏｌ·Ｌ－１） ２．００　 ２．５０　 ３．００　 ３．５０
ｄＮＴＰｓ／（μｍｏｌ·Ｌ
－１） ０．２０　 ０．２５　 ０．３０　 ０．３５
模板ＤＮＡ／（ｎｇ·２５μＬ
－１） ２０．００　 ３０．００　 ４０．００　 ５０．００
引物／（μｍｏｌ·Ｌ
－１） ０．１０　 ０．１５　 ０．２０　 ０．２５
２．２　单因素试验
在组合６的基础上，选用引物组合 ＭＥ５ＥＭ１设置各因素梯度．结果如图１所示．
２．２．１　Ｍｇ２＋浓度对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增效果的影响
Ｍｇ２＋浓度不仅影响Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶活性，还会影响引物退火温度，从而影响ＰＣＲ产物特异性
和产量，因此确定最佳 Ｍｇ２＋浓度十分必要．体系 Ｍｇ２＋浓度在２．０～３．０ｍｍｏｌ／Ｌ之间时，均有扩增
条带，高于３．０ｍｍｏｌ／Ｌ时无扩增条带，低于２．５ｍｍｏｌ／Ｌ时，主带和弱带之间界限不清晰，Ｍｇ２＋浓
度高于２．５ｍｍｏｌ／Ｌ时，扩增出的条带数目明显减少，因此确定２．５ｍｍｏｌ／Ｌ为体系最佳 Ｍｇ２＋浓度．
２．２．２　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增效果的影响
Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量过高，扩增条带背景深，浓度低，扩增条带少，影响试验结果．当Ｔａｑ　ＤＮＡ聚
合酶用量为０．２０Ｕ时，扩增条带模糊，０．３０Ｕ和０．３５Ｕ时，虽条带清晰、背景浅，但扩增条带数目较少，
只有用量为０．２５Ｕ时，不仅条带数目较多，且背景清晰，因此选择０．２５Ｕ为体系Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量．
４３ 西南大学学报（自然科学版）　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｂｊｂ．ｓｗｕ．ｃｎ　　　　　第３５卷
Ｍ：标准分子量ＤＮＡ，１～４Ｍｇ２＋梯度（２．０ｍｍｏｌ／Ｌ～３．５ｍｍｏｌ／Ｌ），５～８　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶梯度（０．２０Ｕ～０．３５Ｕ），９～１２模板ＤＮＡ梯
度（２０ｎｇ～５０ｎｇ），１３～１６引物梯度（０．２０μｍｏｌ／Ｌ～０．３５μｍｏｌ／Ｌ），１７～２０ｄＮＴＰｓ梯度（０．２０μｍｏｌ／Ｌ～０．２５μｍｏｌ／Ｌ）．
图１　单因素梯度变化的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ电泳检测图谱
２．２．３　模板ＤＮＡ对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增效果的影响
２５μＬ体系中，模板ＤＮＡ用量在２０～５０ｎｇ时，扩增条带数目基本相同，说明此范围模板ＤＮＡ用量
对结果无明显影响，用量为５０ｎｇ时背景最清晰，因此选用５０ｎｇ为体系最终模板ＤＮＡ用量．
２．２．４　引物浓度对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增效果的影响
引物浓度对ＰＣＲ结果影响较大，引物浓度过高或过低，都会降低ＰＣＲ产量，引物浓度在０．２０μｍｏｌ／Ｌ，
０．２５μｍｏｌ／Ｌ时扩增条带数目较多，高于０．２５μｍｏｌ／Ｌ，扩增条带明显减少．引物浓度为０．２５μｍｏｌ／Ｌ时，扩
增结果明显好于其他３个水平，扩增条带数目多且背景清晰，说明０．２５μｍｏｌ／Ｌ为最佳引物浓度．
２．２．５　ｄＮＴＰｓ浓度对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增效果的影响
ｄＮＴＰｓ对试验结果影响较大，当ｄＮＴＰｓ浓度过低时，会影响到Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶活性，从而影响
ＰＣＲ结果，单因素试验结果表明，体系ｄＮＴＰｓ浓度为０．２０μｍｏｌ／Ｌ和０．２５μｍｏｌ／Ｌ两水平的扩增结果明
显好于０．３０μｍｏｌ／Ｌ和０．３５μｍｏｌ／Ｌ两水平，且后两个水平之间无显著差异，当ｄＮＴＰｓ浓度为０．２５
μｍｏｌ／Ｌ时，扩增条带数目多且清晰，明显好于０．２０μｍｏｌ／Ｌ，故本试验采用的最适ｄＮＴＰｓ浓度为０．２５
μｍｏｌ／Ｌ．
２．３　引物筛选及退火温度确立
以金佛山居群通江百合为模板建立起的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系可用于引物筛选（图２）．退火温度影响
ＰＣＲ特异性，一定范围内降低退火温度能够促使模板与引物的稳定结合，升高退火温度则可以增加两者的
特异性，降低非特异性结合，采用筛选出的体系，以通江百合为模板进行梯度ＰＣＲ试验（图３），结果表明，
引物 ＭＥ３ＥＭ１１在退火温度低于３２．６℃时无扩增条带或扩增结果不理想，退火温度３３．５℃～４２．４℃之
间均有较为丰富的条带，但温度高于３９．９℃以上，扩增条带不清晰，温度为３５．９℃（泳道７）时扩增条带最
清晰，因此引物 ＭＥ３ＥＭ１１的最佳退火温度为３５．９℃，已筛选出的引物组合及其退火温度如表４所示．
Ｍ：标准分子量ＤＮＡ，１～１８为不同引物组合．
图２　ＳＲＡＰ引物筛选电泳图谱
５３第４期　　　　　　　　　智　丽，等：通江百合ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系优化及引物筛选
图３　引物组合 ＭＥ３ＥＭ１１的温度梯度ＰＣＲ电泳图谱
表４　已筛选出的引物组合及其最佳退火温度
引物组合 退火温度／℃ 引物组合 退火温度／℃
ＭＥ１１ＥＭ４　 ４２．４ ＭＥ１０ＥＭ４　 ３７．０
ＭＥ２ＥＭ１１　 ３２．６ ＭＥ１０ＥＭ３　 ３７．０
ＭＥ６ＥＭ１１　 ３５．９ ＭＥ１２ＥＭ１　 ４２．４
ＭＥ１２ＥＭ４　 ３５．９ ＭＥ３ＥＭ１１　 ３５．９
ＭＥ１２ＥＭ１２　 ３８．６ ＭＥ１ＥＭ３　 ３７．０
ＭＥ３ＥＭ１２　 ３９．９ ＭＥ７ＥＭ８　 ３８．６
ＭＥ５ＥＭ１　 ３４．６ ＭＥ１１ＥＭ１０　 ３９．９
ＭＥ９ＥＭ７　 ３９．９ ＭＥ１１ＥＭ８　 ３７．０
ＭＥ１１ＥＭ１　 ３９．９ ＭＥ１０ＥＭ１１　 ４１．０
ＭＥ６ＥＭ４　 ３３．５ ＭＥ８ＥＭ７　 ３７．０
ＭＥ８ＥＭ４　 ３７．０ ＭＥ６ＥＭ５　 ３９．９
ＭＥ７ＥＭ９　 ３８．６ ＭＥ８ＥＭ８　 ３７．０
２．４　体系验证
利用优化后的最佳反应体系，采用筛选出的任意２对引物在最适退火温度下对通江百合不同分布区样
品进行ＳＲＡＰ扩增，结果显示扩增条带清晰，多态性明显，稳定性良好（图４、图５）．表明该反应体系适合
于通江百合ＳＲＡＰ－ＰＣＲ遗传多样性检验．
Ｍ：标准分子量ＤＮＡ，１～２３材料来源：１～６江津，７～１２南川，１３～１８巫山，１９～２３巫溪．
图４　引物组合 ＭＥ１０ＥＭ４ＳＲＡＰ电泳检测图谱
６３ 西南大学学报（自然科学版）　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｂｊｂ．ｓｗｕ．ｃｎ　　　　　第３５卷
Ｍ：标准分子量ＤＮＡ，１～１１材料来源：１～２南川，３～４江津，５～６石柱，７～８巫溪，９～１１巫山．
图５　引物组合 ＭＥ５ＥＭ１ＳＲＡＰ电泳检测图谱
３　讨　论
ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应中的影响因素较多，各因素之间存在相互影响，试验过程中，各因素的不同水平组合
对扩增多态性及扩增片段大小都有明显的影响，因此建立最适反应体系是获得稳定、高效、可靠的标记的
前提条件．体系优化一般采用正交或单因素变量分析设计试验．正交试验设计能快速分析各因素之间的内
在规律，能很好考虑到各因素之间的相互影响，对试验结果的分析较完善，但对试验效果的评价上主观性
较强，尤其在各因素浓度梯度的设计上，跨度较大，很难判定各因子水平对试验结果的影响；单因素试验
设计往往忽略各因素之间的相互影响，忽视互作效应［１２］，两种方法都很难在短时间内得到最佳ＰＣＲ反应
体系，因此在进行体系优化时，应结合两种方法综合分析各影响因子，利用正交试验先分析影响体系的关
键因子，摸索各影响因子的大致浓度范围，然后利用单因素试验，逐个优化各影响因子，充分发挥单因素
试验快捷、准确的特点，即结合两种方法优势优化ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系．
本研究采用正交试验和单因素设计相结合的方法优化了通江百合ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系，对影响
ＰＣＲ扩增的模板ＤＮＡ，引物浓度，ｄＮＴＰｓ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，Ｍｇ２＋进行了优化，极差分析表明５个因素
中 Ｍｇ２＋对扩增结果影响最大，这与李梅的研究结果一致［１７］．单因素试验结果表明，不同浓度的引物，
ｄＮＴＰｓ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，Ｍｇ２＋的扩增谱带在亮度、数目、清晰度上差异较大，而一定范围内模板ＤＮＡ
浓度变化对扩增结果影响不明显．正交设计和单因素试验结果两者在Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量上有差异，
可能因为单因素试验易凸显单一因子的作用有关．本研究经优化后的２５μＬ反应体系中，各因素的最终
用量为：２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋，０．２５ＵＴａｑ　ＤＮＡ聚合酶，０．２５μｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ，０．２５μｍｏｌ／Ｌ引物，５０ｎｇ
模板ＤＮＡ，总体积为２５μＬ．优化后的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系经验证具有较高的稳定性和可重复性，可应
用于通江百合种质资源鉴定及遗传多样性研究等领域．
参考文献：
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［２］　陈心启，许介眉，梁松筠．中国植物志１４卷 ［Ｍ］．北京：科学出版社，１９８０：１２７．
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［４］　ＬＩ　Ｇａｎｇ，ＱＵＩＲＯＳ　Ｃ　Ｆ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ），ａ　Ｎｅｗ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａ　Ｓｉｍｐｌｅ
ＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｉｔｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｔａｇｇｉｎｇ　ｉｎ　Ｂｒａｓｓｉｃａ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１
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［６］　ＷＡＮＧ　Ｇｕａｎｇ，ＰＡＮ　Ｊｕｎ－ｓｏｎｇ，ＬＩ　Ｘｉａｏ－ｚｕｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｕｃｕｍｂｅｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｌｉｎｋａｇｅ　Ｍａｐ　ｗｉｔｈ　ＳＲＡＰ　Ｍａｒｋｅｒｓ
ａｎｄ　Ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　Ｌａｔｅｒａｌ　Ｂｒａｎｃｈ　Ｔｒａｉｔｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ　ｓｅｒｉｅｓ　Ｃ：ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，４８（３）：２１３－２２０．
［７］　ＦＥＲＲＩＯＬ　Ｍ，ＰＩＣＢ，Ｎｕｅｚ　Ｆ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ａ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　Ｃｏｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｕｃｕｂｉｔａ　Ｐｅｐｏ　Ｕｓｉｎｇ　ＳＲＡＰ　ａｎｄ　ＡＦＬＰ
７３第４期　　　　　　　　　智　丽，等：通江百合ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系优化及引物筛选
Ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００３（１０７）：２７１－２８２．
［８］　ＺＨＡＮＧ　Ｆｅｉ，ＣＨＥＮ　Ｓｕ－ｍｅｉ，ＣＨＥＮ　Ｆａ－ｄｉ，ｅｔ　ａｌ．ＳＲＡＰ－Ｂａｓｅｄ　Ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　ＱＴＬ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ
Ｔｒａｉｔｓ　ｉｎ　Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ （Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ　ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２０１１，２７（１）：１１－２３．
［９］　ＬＩＮ　Ｚｈｏｎｇ－ｘｕ，Ｈｅ　Ｄｅ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｎ－ｌｏｎｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｌｉｎｋａｇｅ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍａｐｐｉｎｇ　ＱＴＬ　ｆｏｒ　Ｃｏｔｔｏｎ　Ｆｉｂｒｅ　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｕ－
ｓｉｎｇ　ＳＲＡＰ，ＳＳＲ　ａｎｄ　ＲＡＰＤ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００５，２４（２）：１８０－１８．
［１０］于　晖，赵　泓，王力超，等．百合杂交后代的亲本基因型鉴定 ［Ｊ］．西南大学学报：自然科学版，２０１０，３２（６）：
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［１６］桂腾琴，孙　敏，乔爱民，等．正交设计优化果梅ＩＳＳＲ反应体系 ［Ｊ］．果树学报，２００９，２６（１）：１０８－１１２．
［１７］李　梅，侯喜林，郝日明．桂花ＳＲＡＰ－ＰＣ体系的确立及验证 ［Ｊ］．植物资源与环境学报，２００９，１８（２）：１５－２１．
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＲＡＰ－ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｌｉｌｉｕｍ　ｓａｒｇｅｎｔｉａｅ
ＺＨＩ　Ｌｉ　１，　ＴＥＮＧ　Ｚｈｏｎｇ－ｈｕａ２，　ＬＩ　Ｘｉａｎ－ｙｕａｎ１，
ＳＵＩ　Ｓｈｕｎ－ｚｈａｏ１，　ＬＩ　Ｍｉｎｇ－ｙａｎｇ１
１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｓｃａｐｅ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｆｌｏｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，
　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｏｕｓ　Ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４００７１６，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４００７１６，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｗｅｒｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ
ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　４ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ，ｐｒｉｍｅｒｓ，ｄＮＴＰｓ，Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ａｎｄ　Ｍｇ２＋ ｏｎ　ＳＲＡＰ－ＰＣＲ
ｆｏｒ　Ｌｉｌｉｕｍ　ｓａｒｇｅｎｔｉａｅ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｇ２＋ ｗａｓ　ｓｈｏｗｎ　ｔｏ　ｂｅ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ
ＳＲＡＰ－ＰＣＲ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｆｒｏｍ　２０ｎｇ　ｔｏ　５０ｎｇ　ｈａｄ　ａｌｍｏｓｔ　ｎｏ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｉｔ．Ａｎ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ＳＲＡＰ－ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｌ．ｓａｒｇｅｎｔｉａｅ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋，
０．２５ＵＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．２５μｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ，０．２５μｍｏｌ／Ｌ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　５０ｎｇ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｉｎ　ａ
ｔｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　２５μＬ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ，２４ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　１４４ｐｒｉｍｅｒ
ｐａｉｒｓ，ｗｈｉｃｈ　ｈａｄ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｂａｎｄｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉ－
ｎａｔｉｏｎｓ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｓｔａｂｌｅ　ａｎｄ　ｒｅｐｅａｔａｂｌｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｌ．
ｓａｒｇｅｎｔｉａｅ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｒｅｇｉｏｎｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｌｉｌｉｕｍ　ｓａｒｇｅｎｔｉａｅ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍ；ＳＲＡＰ
责任编辑　欧　宾　　　　
８３ 西南大学学报（自然科学版）　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｂｊｂ．ｓｗｕ．ｃｎ　　　　　第３５卷