全 文 ：张聪子，童巧珍，郭 婷，等． 蛇莓 ＲAPD与 ISSＲ － PCＲ反应体系优化［J］． 江苏农业科学，2014，42(7) :50 － 53．
蛇莓 ＲAPD与 ISSＲ － PCＲ反应体系优化
张聪子，童巧珍，郭 婷，高 昱，蔡嘉洛
(湖南中医药大学，湖南长沙 410208)
摘要:采用单因素试验结合正交试验，对 PCＲ反应体系中的 5 种主要反应因子 Mg2 +、dNTPs、TaqDNA 聚合酶、引
物、模板 DNA浓度进行优化筛选，确立了适合蛇莓基因组 DNA的 ＲAPD和 ISSＲ反应体系，ＲAPD反应体系(20 μL) :
Mg2 + 1． 5 mmol /L、dNTPs 250 μmol /L、Taq 酶 1 U、引物 0． 2 μmol /L、DNA 模板 60 ng;ISSＲ 反应体系(20 μL) :Mg2 +
2． 0 mmol /L、dNTPs 250 μmol /L、Taq酶 0． 5 U、引物 1 μmol /L、DNA模板 60 ng。利用确立的体系对 24 份蛇莓种质进
行扩增，结果条带清晰明亮，多态性好。
关键词:蛇莓;ＲAPD － PCＲ;ISSＲ － PCＲ;单因素;正交设计;体系优化
中图分类号:S567． 201 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2014)07 － 0050 － 04
收稿日期:2013 － 11 － 06
基金项目:湖南省教育厅项目(编号:10C1029)。
作者简介:张聪子(1987—) ，男，湖北咸宁人，硕士研究生，从事中药
资源研究。
通信作者:童巧珍，博士，副教授，硕士研究生导师，从事中药质量与
资源研究。E － mail:qztong88@ 126． com。
蛇莓［Duchesnea indica(Andr．)Focke］为蔷薇科蛇莓属
植物，为民间常用草药，具有清热解毒、消肿散瘀，收敛止血、
凉血之功效［1 － 2］。长期以来，科研工作者对蛇莓开展了大量
研究，近年来，因发现蛇莓具有抗肿瘤活性而更加引起学者们
的关注，蛇莓已成为一种开发前途广阔的植物资源。目前，对
蛇莓的研究主要集中在栽培及药理等领域，分子方面的研究
相对较少。本试验以蛇莓为研究对象，选择对 PCＲ 扩增体系
稳定性影响较大的 5 个因素，包括模板 DNA、Mg2 +、dNTPs、
TaqDNA聚合酶、引物浓度进行优化，以期确立稳定适合于蛇
莓的 ISSＲ 及 ＲAPD分子标记的 PCＲ 反应体系，为蛇莓的资
源鉴定与遗传多样性研究提供技术依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 蛇莓种质 材料取自湖南中医药大学药植园人工栽
培的蛇莓新鲜幼嫩叶片，24 组样本均保存于 － 70 ℃冰箱中。
1 － 24 号分别为邵阳隆回 1 号、邵阳隆回 2 号、邵阳隆回 3
号、邵阳隆回 4 号、邵东、常德 1 号、常德 2 号、常德澧县、大围
山 1 号、大围山 2 号、平江冬塔、平江幕阜山、平江石浆、平江
石浆阜西、衡山、永顺西岐、浏阳周洛、株洲、娄底、长沙植物
园、长沙市含浦 1 号、长沙市含浦 2 号、长沙望城、长沙县。
1． 1． 2 试剂 所用试剂均购于北京鼎国生物公司。ＲAPD －
PCＲ体系优化选用随机引物 P8，序列为 5 －:TCTGGTGAGG －
3;ISSＲ － PCＲ 体系优化选用引物 GＲD205 824，序列为
5 －(TC)8A － 3。
1． 2 基因组 DNA提取
蛇莓植物基因组 DNA 采用试剂盒(北京天根)提取，用
核酸蛋白测定仪和 l%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的纯度和浓
度。将 DNA稀释成 20 ng /μL，贮存于 － 20 ℃冰箱备用。
1． 3 PCＲ扩增及凝胶电泳
ISSＲ扩增程序［3］为 94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 1 min，
53 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1． 5 min，35 个循环;72 ℃再延伸
10 min，4 ℃保存。
ＲAPD 扩增程序［4］ 为 94 ℃ 预变性 5min;94 ℃ 变性
1 min，37 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，40 个循环;72 ℃再
延伸 5 min，4 ℃保存。
PCＲ产物均用含有溴化乙锭的 1． 0% 琼脂糖凝胶在
0． 5 × TBE 中电泳，点样 10 μL，电压 4 V /cm，电泳结束后在凝
胶成像系统上检测拍照。
1． 4 PCＲ反应体系的优化
针对 20 μL 反应体系中的 5 个主要因素 Mg2 +、dNTP、
TaqDNA聚合酶、引物、模板 DNA 浓度，设定 4 个水平，分别
建立单因素及正交设计表(表 1、表 2) ，确立 ＲAPD 和
ISSＲ － PCＲ 反应体系。
1． 5 退火温度的优化
以上述反应体系优化确定的 5 个因素的最佳浓度水平为
基础，对退火温度进行优化。将 ＲAPD 退火温度范围设置为
30 ～ 45 ℃，由梯度 PCＲ仪随机生成 12 个梯度，分别为 30． 0、
30. 3、31． 5、33． 0、34． 8、36． 6、38． 4、40． 2、42． 0、43． 5、44． 6、
45． 0℃。
ISSＲ退火温度设置为 45． 0 ～ 61． 5 ℃，由梯度 PCＲ 仪随
机生成 12 个退火温度。分别为 45． 0、45． 2、46． 1、47． 5、49． 3、
51. 4、53． 6、55． 8、57． 8、59． 6、60． 8、61． 5℃。
1． 6 ISSＲ － PCＲ和 ＲAPD － PCＲ反应体系的验证
利用上述已建立的 ISSＲ及 ＲAPD反应体系，用 ＲAPD随
机引物 P99:5 － GTCCTGGGTT － 3和 ISSＲ引物 GＲD205835:
5 －(TG)8G － 3，对 24 份蛇莓材料 DNA 进行 PCＲ 扩增，对
已确立的 ＲAPD和 ISSＲ反应体系进行验证。
2 结果与分析
2． 1 单因素试验
2． 1． 1 Mg2 + 浓度对 ＲAPD 及 ISSＲ 扩增的影响 ＲAPD －
ＲCＲ体系中，Mg2 +浓度在 1． 0 ～2． 5 mmol /L(图 1，泳道 1至 4)
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表 1 蛇莓 ＲAPD和 ISSＲ － PCＲ体系(20 μL)优化的因素与水平
编号
因素
A:Mg2 +浓度
(mmol /L)
B:dNTPs浓度
(μmol /L)
C:TaqDNA聚合酶
(U)
D:引物浓度(μmol /L)
ＲAPD ISSＲ
E:模板 DNA
(ng)
1 1． 0 100 0． 25 0． 2 0． 5 20
2 1． 5 150 0． 50 0． 4 1． 0 40
3 2． 0 200 1． 00 0． 6 1． 5 60
4 2． 5 250 1． 50 0． 8 2． 0 80
表 2 蛇莓 ＲAPD和 ISSＲ － PCＲ体系(20 μL)优化正交试验 L16(45)设计
编号
A:Mg2 +浓度
(mmol /L)
B:dNTPs浓度
(μmol /L)
C:TaqDNA聚合酶
(U)
D:引物浓度(μmol /L)
ＲAPD ISSＲ
E:模板 DNA
(ng)
1 1． 0 100 0． 25 0． 2 0． 5 20
2 1． 0 150 0． 50 0． 4 1． 0 40
3 1． 0 200 1． 00 0． 6 1． 5 60
4 1． 0 250 1． 50 0． 8 2． 0 80
5 1． 5 100 1． 50 0． 4 1． 0 60
6 1． 5 150 1． 00 0． 2 0． 5 80
7 1． 5 200 0． 50 0． 8 2． 0 20
8 1． 5 250 0． 25 0． 6 1． 5 40
9 2． 0 100 0． 50 0． 6 1． 5 80
10 2． 0 150 0． 25 0． 8 2． 0 60
11 2． 0 200 1． 50 0． 2 0． 5 40
12 2． 0 250 1． 00 0． 4 1． 0 20
13 2． 5 100 1． 00 0． 8 2． 0 40
14 2． 5 150 1． 50 0． 6 1． 5 20
15 2． 5 200 0． 25 0． 4 1． 0 80
16 2． 5 250 0． 50 0． 2 0． 5 60
范围内都可以扩增出条带，在 ISSＲ － PCＲ 体系中(图 2，泳道
1 至 4)，Mg2 +浓度过低时，扩增的条带少而不清晰。
2． 1． 2 dNTPs浓度对 ＲAPD 及 ISSＲ 扩增的影响 dNTP 是
PCＲ反应的原料，浓度过高易产生错配，同时与 Taq 酶竞争
Mg2 +，使 Taq酶不能充分发挥聚合活性，导致扩增失败;dNTP
浓度过低时有缺失的带，且条带明显变暗，较为适宜的 dNTP
浓度在 150 ～ 250 μmol /L之间，条带亮而清晰(图 1、图 2)。
2． 1． 3 Taq 酶浓度对 ＲAPD 及 ISSＲ 扩增的影响 TaqDNA
聚合酶浓度过高易产生非特异扩增产物的积累，条带背景模
糊;浓度过低，酶的催化能力不够则导致合成效率下降，条带
数减少，亮度降低。由图 1 可见，ＲAPD － PCＲ 体系(20 μL)
中，Taq酶用量在 0． 25 U 时，条带较弱，增加至 0． 5 ～ 1． 50 U
时扩增条带多，清晰明亮;增加至 1． 5 U 时条带数减少，背景
模糊不清。ISSＲ － PCＲ体系中 Taq酶用量为 1． 0 U时条带最
清晰、稳定。因此本试验 TaqDNA聚合酶用量 1． 0 ～ 1． 5 U。
2． 1． 4 引物浓度对 ＲAPD及 ISSＲ扩增的影响 引物用量也
影响 PCＲ扩增效果，当 PCＲ 引物量太低(如图 2，ISSＲ 泳道
13)，产物量降低，出现假阴性;引物浓度过高(如图 1，ＲAPD
泳道 16)会促进引物错误引导非特异产物合成，还会增加引
物二聚体的形成。综合结果表明，引物浓度过低或过高时条
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带有缺失和模糊。
2． 1． 5 模板 DNA 浓度对 ＲAPD 及 ISSＲ 扩增的影响
ＲAPD － ＲCＲ 体系(20 μL)中，模板 DNA 量在 20 ～ 80 ng(图
1，泳道 17 至 20)之间都可扩增出较为清晰的条带，对扩增结
果无明显影响。在 ISSＲ － PCＲ 体系(20 μL)中(图 2)，低模
板量(20 ～ 40 ng，泳道 17 － 18)扩增效果差，强带变弱，弱带
则消失，高模板量(80 ng) ，扩增效果也不理想，可见 ISSＲ －
PCＲ对模板浓度的敏感度比 ＲAPD高。
2． 2 正交试验
从图 3 可以看出，第 15、16 泳道扩增条带最理想，条带清
晰，多态性高，重复性好，基本符合 ＲAPD 分析的要求。结合
单因素试验结果，最后选取 1． 5 mmol /LMg2 +、250 μmol /L
dNTPs、1 U Taq 酶、0． 2 μmol /L 引物、60 ng DNA 模板作为
20 μL 反应体系最佳的优化结果。
由图 4 可以看出，正交设计的 16 组试验，由于 5 种因素
的组合不同，扩增效果存在明显差异:1 ～ 4 号组合扩增效果
较差，谱带弱，可能是 Mg2 +浓度过低导致;11 和 16 组合扩增
的条带清晰、完整、明亮且多态性高，基本符合 ISSＲ分析的要
求。结合单因素试验结果，最后选取 2． 0 mmol /L Mg2 +、
250 μmol /L dNTPs、0． 5 U Taq 酶、1 μmol /L 引物、60 ng DNA
模板作为 20 μL反应体系最佳的优化结果。
通过以上分析，确定蛇莓 ＲAPD 及 ISSＲ 反应的最佳体
系。ＲAPD 反应体系(20 μL) :Mg2 + 1． 5 mmol /L、dNTPs
250 μmol /L、Taq酶 1 U、引物 0． 2 μmol /L、DNA 模板 60 ng;
ISSＲ 反 应 体 系 (20 μL) :Mg2 + 2． 0 mmol /L、dNTPs
250 μmol /L、Taq酶 0． 5 U、引物 1 μmol /L、DNA模板 60 ng。
2． 3 引物退火温度对 ＲAPD及 ISSＲ扩增的影响
对 ＲAPD － PCＲ设置的 12 个温度梯度，试验结果(图 5)
表明，退火温度为 36． 6 ～ 42． 0 ℃(泳道 6 至 8)时，扩增的条
带大致相同;温度低于 35 ℃时(泳道 1 至 5)，扩增的条带较
少;在高温 42 ～ 45 ℃(泳道 9 至 12)退火时，虽然出现小片
段，但部分条带不够稳定，扩增的条带少且较弱。综合考虑本
试验结果，使用 37 ℃的退火温度获得的 ＲAPD 标记条带稳
定，多态性合适。
退火温度对 ISSＲ － PCＲ的反应体系影响较大(图 6) ，温
度为 45． 0 ～ 47． 5 ℃(泳道 1 至 4)时，大片段扩增较模糊;当
温度升到 49． 3 ～ 53． 6 ℃(泳道 5 至 7)时，扩增效果好，主带
清晰;当退火温度高于 55． 8 ℃(泳道 8 至 12)时，扩增条带逐
渐模糊，甚至扩增无条带。根据引物对应参考温度，本试验选
用 53 ℃为反应体系的最佳退火温度。
2． 4 最佳体系验证
确定退火温度后，采用优化所得的反应体系，用 ＲAPD随
机引物P99和 ISSＲ引物GＲD205 835对24份蛇莓材料进行
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PCＲ扩增。图 7、图 8 结果表明，优化所得的最佳反应体系在
24 个蛇莓样本中均能扩增出稳定、丰富、清晰可辨、多态性强
的 DNA条带，表明所优化的扩增体系稳定可靠，适合蛇莓种
质资源的 ISSＲ及 ＲAPD分子标记的分析。
3 讨论
当前，仅有姚旭丽等采用单因素试验对蛇莓 ISSＲ － PCＲ
反应体系的主要反应因子进行了优化［5］，但尚未开展 ISSＲ和
ＲAPD分子标记对蛇莓种质资源的研究，由于该方法并没有
考察因素间的相互作用，物种不同反应体系条件也有较大的
变化［6］。本试验选择单因素结合正交试验设计对影响蛇莓
ＲAPD和 ISSＲ反应体系的各个因子进行优化，期望得到最佳
的 PCＲ反应体系。
PCＲ对模板 DNA浓度、TaqDNA聚合酶要求不高，一般来
说，只要提供足够的模板量(＜ 1 000 ng)，1． 0 ～ 1． 5 U(20 μL
体系)都会得到稳定的条带;但 2 者浓度过高不仅浪费还会导
致非特异性扩增产物积累［7］。
PCＲ反应条件中影响最大的是 Mg2 +、dNTPs 与引物的浓
度［7］，在 ＲAPD － PCＲ各因素浓度水平互相作用中，高 Mg2 +、
低 dNTPs浓度，以及低 Mg2 +、高 dNTPs 浓度条件不能扩增出
条带或产生极弱的条带，因为 dNTPs 过早被消耗完，使产物
单链化，甚至得不到产物;而过量的 dNTPs 对 Mg2 +的螯合作
用明显，从而降低了依赖于 Mg2 +的 TaqDNA 聚合酶的活性，
也不能扩增出条带［8 － 10］;而在 ISSＲ － PCＲ 中，Mg2 +浓度太低
时，不管引物和 dNTPs 浓度如何，均不能成功扩增，表明了
Mg2 +在扩增中的重要性。
碱基长度决定了引物的退火温度，ＲAPD 中随机引物大
多为 10 个碱基，退火温度一般为 36 ℃，过低会导致引物与模
板非特异性结合，引起扩增的特异性下降［11 － 12］;但过高，如大
于 40 ℃ 时会抑制反应，导致无片段。ISSＲ 引物大多数为
15 ～ 20 个碱基长度，比随机引物多，适合较高的退火温度，并
且能提高 ISSＲ － PCＲ反应的特异性及精确度。
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