全 文 ：响应面法优化白簕叶总黄酮的回流提取工艺
杨慧文，张旭红，程轩轩，刘婷瑜，潘育方
(广东药学院 药科学院，广东广州 510006)
摘要:目的 采用响应面法对白簕叶总黄酮的回流提取工艺进行优化。方法 通过单因素试验选取因素
和水平;以白簕叶总黄酮质量分数为指标，选取乙醇体积分数、提取时间和料液比 3 个因素进行 Box-
Behnken中心组合设计。结果 白簕叶总黄酮的最佳提取工艺条件为:提取时间为 76 min，乙醇体积分数
为 49%，液料比为 42∶ 1(mL∶ g)。在此条件下，白簕叶总黄酮的质量分数达 5． 12%。结论 响应面法对
白簕叶总黄酮的回流提取方法有较好的预测性，可为白簕叶总黄酮的高效提取提供参考。
关键词:白簕;总黄酮;回流提取;响应面法
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标志码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1006-8783． 2015． 03． 007
文章编号:1006-8783(2015)03-0316-05
Optimization of reflux extraction conditions of total flavonoids from Acanthopanax
trifoliatus (Linn．)Merr． leaves by surface response methodology
YANG Huiwen，ZHANG Xuhong，CHENG Xuanxuan，LIU Tingyu，PAN Yufang
(School of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)
Abstract:Objective To investigate the reflux extraction conditions of total flavonoids from Acanthopanax
trifoliatus (L．)Merr． leaves by surface response methodology． Methods On the basis of single factor
experiments，the concentration of total falvonoids was set as response value，and the surface response
methodology was used to optimize extraction of total flavonoids from Acanthopanax trifoliatus (L．)Merr．
leaves with three factors which were ethanol concentration，extraction time，and liquid-solid ratio． Ｒesults
The optimal extraction condition was as follows:the ethanol concentration was 49%，the extraction time was
76 min，the liquid-solid ratio was 42∶ 1(mL∶ g)，and the average total flavonoid concentration was 5． 12% ．
Conclusions Surface response methodology has good predictability on the optimization of reflux extraction of
total flavonoids from Acanthopanax trifoliatus(L．)Merr． leaves，and the optimal extraction condition can
provide reference for high-performance extraction of the total flavonoids．
Key words:Acanthopanax trifoliatus(Linn．)Merr．; flavonoids;reflux extraction;surface response
methodology
收稿日期:2014-11-19
基金项目:建设中医药强省科研课题(粤中医［2015］11号);广东药学院药科学院青年教师科研培育基金(药科学院［2014］05号)
作者简介:杨慧文(1983—)，女，硕士，实验师，从事药理及中药新药开发研究，Email:halley_yang@ hotmail． com;通信作者:
潘育方(1966—)，男，教授，主要从事药物新剂型及安全性评价的研究，Email:p34074683@ 126． com。
网络出版时间:2015-05-22 17:52 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /44． 1413． Ｒ． 20150522． 1752． 003． html
白簕 Acanthopanan trifoliatus (L．)Merr．为五加
科五加属的植物，又名鹅掌簕、三加皮、苦刺等，白簕
叶可疏风、消肿、止痒，具有舒筋活血、消肿解毒的功
效［1-2］。白簕叶化学成分丰富，含有黄酮、糖苷、石吊
兰素、咖啡酰奎宁酸等成分［3-6］。国内外研究表明，
白簕叶总黄酮具有良好的抗氧化、抗菌、抗感染等作
用［7-9］，其提取工艺的优化研究对白簕叶的开发具有
指导意义。蔡凌云等［10］采用正交法优化微波提取
白簕各部位黄酮，得出白簕叶黄酮质量分数最高的
结论，质量分数达 3． 17%。李文芳等［11］同法研究
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Jun． 2015，31(3)
微波提取不同采摘时期的白簕叶黄酮，质量分数最
高为 4 月，达 4． 06%。本课题组前期采用正交设计
法优化超声辅助提取白簕叶总黄酮［9］，虽然采用该
法最终筛选出最优提取方案，但所选的 4 个因素经
考察后仅有 1 个因素的影响有统计学意义，其余因
素水平均凭经验选择。另外，预试验中比较了回流
提取法和超声辅助提取法对白簕叶总黄酮的提取效
果，结果表明回流提取法得到的质量分数高于优化
后的超声辅助提取法。
响应面法(surface resbounce methodology，ＲSM)
也称响应曲面法，是采用多元二次回归方程来拟合
响应值与因素之间关系的一种优化统计方法，通过
对响应曲面及等高线的分析来寻求最优工艺参数。
由于实际应用中优化问题的影响因子和响应值之间
往往是高度非线性的关系，因此，响应面法采用非线
性模型拟合具有精度高、预测性好的特点［12-14］。本
文在单因素试验的基础上，进一步采用 Box-Behnken
设计响应面试验，对白簕叶总黄酮的回流提取条件
进行优化，有利于白簕叶的进一步开发利用。
1 仪器与材料
DL-360A超声仪(上海之信仪器有限公司);
FA2104A万分之一天平(上海精天电子仪器有限公
司);ＲE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);
UV-1200 紫外可见光分光光度计(上海美谱达仪器
有限公司);LD4-2A离心机(北京医用离心机厂)。
芦丁对照品(质量分数≥98%，中山优诺生物
科技发展有限公司，批号:11040302);白簕叶(经广
东药学院中药学院刘基柱副教授鉴定为五加属植物
白簕的叶，标本保存于广东药学院中药学院标本室，
恩平响山簕菜茶厂);95%乙醇(广东光华化学厂有
限公司);其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2． 1 白簕叶总黄酮的测定方法［10］
2． 1． 1 芦丁对照品溶液的制备 精密称取芦丁对
照品 10． 00 mg于 10 mL容量瓶中，加适量 70%(体
积分数，下同)乙醇，超声振荡使溶解，再加 70%乙
醇定容到 10 mL，充分摇匀，即得 1． 00 mg /mL 的芦
丁对照品溶液。
2． 1． 2 标准曲线的制备 精密量取新鲜配制的芦
丁对照品溶液 0、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0 mL 于 10
mL容量瓶中，70%乙醇定容，各取 1 mL于试管中，加
70%乙醇 1 mL，摇匀后，加入质量分数 5%的 NaNO2
溶液 0． 3 mL，6 min 后加入质量分数 10% 的 Al
(NO3)3 溶液 0． 3 mL;6 min后再加入质量分数 4%
NaOH溶液 2 mL，10 min 后于 510 nm 处测定吸光
度(A)，以 70%乙醇加试剂作为空白对照。以吸
光度为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，
得标准曲线 A = 2 ． 58ρ － 0 ． 021 2，r = 0． 999 9，表明
芦丁的质量浓度在 0． 10 ～ 0． 30 mg /mL 范围内与
吸光度呈良好线性关系。
2． 1． 3 供试品溶液的制备与测定方法 新鲜白簕
叶 50 ℃烘干，粉碎过 60 目筛，石油醚(30 ～ 60 ℃)
脱色素后，烘干密封保存。精密称取白簕叶粉末 2．
0 g，加入 70%乙醇 120 mL，80 ℃下回流提取 2 次，
提取 60 min，趁热抽滤，合并 2 次提取液;55 ℃挥去
一半体积溶剂，再加入石油醚萃取 3 次，保留水层，
再加入水层体积一半量的无水乙醇复溶，稀释 4 倍
后，得供试品溶液。
精密量取供试品溶液 1． 0 mL，按“2． 1． 2”项下
标准曲线制备方法测定吸光度(A)，根据回归方程
及公式:Y = ρ ×M × VW 计算白簕叶总黄酮的质量分
数，式中:Y 为提取液总黄酮质量分数，mg /g;ρ 为根
据标准曲线得出的供试品溶液质量浓度，mg /mL;V
为定容体积，mL;M 为稀释倍数;W 为所用药材质
量，mg。
2． 2 单因素考察白簕叶总黄酮提取工艺
2． 2． 1 乙醇体积分数的考察 固定“2． 1． 3”项下
其他因素不变，分别选用不同体积分数(30%、
40%、50%、60%、70%、80%)乙醇，考察乙醇体积分
数对提取白簕叶总黄酮的影响，结果见图 1。可见，
乙醇体积分数在 30% ～ 50%之间时，随着乙醇体积
分数的增加，总黄酮质量分数迅速增加，50%时达到
最大;乙醇体积分数大于 50%时，所得的总黄酮质
量分数呈下降趋势，原因可能是乙醇体积分数增加，
对白簕叶总黄酮这类极性较高的化合物提取率降
低，而脂溶性成分提取率增加，造成总黄酮质量分数
下降。因此，选择乙醇体积分数为 50%较为合适。
2． 2． 2 提取时间的考察 将乙醇体积分数设为
50%，固定“2． 1． 3”项下其他因素不变，设定提取时
间分别为 30、60、90、120、150 min，考察不同提取时
间对提取白簕叶总黄酮的影响，结果见图 2。可见，
随着提取时间的延长，总黄酮质量分数呈现先升高后
降低的趋势，在 60 min时达到最大，60 min 后随着时
间的延长，其他杂质也陆续被提取出来，影响到总黄
酮的质量分数。因此，选择 60 min为最佳提取时间。
713第 3 期 杨慧文，等．响应面法优化白簕叶总黄酮的回流提取工艺
图 1 乙醇体积分数对提取白簕叶总黄酮的影响
Figure 1 The effects of ethanol concentration on the yields of
total flavonoids from Acanthopanax trifoliatus(L．)Merr．
图 2 提取时间对提取白簕叶总黄酮的影响
Figure 2 The effects of extraction time on the yields of total
flavonoids from Acanthopanax trifoliatus (L．)Merr．
2． 2． 3 料液比的考察 将乙醇体积分数设为
50%，提取时间设为 60 min，设定提取液料比(mL∶
g)分别为15 ∶ 1、25 ∶ 1、35 ∶ 1、45 ∶ 1、55 ∶ 1、65 ∶ 1，固定
“2． 1． 3”项下其他因素不变，考察液料比对提取白
簕叶总黄酮的影响，结果见图3。可见，在液料比低于
45∶ 1时，白簕叶总黄酮不能被完全提取出来;随着液
料比的增大，总黄酮质量分数呈现逐渐增高的趋势，
在45∶ 1时达到最大;此时，白簕叶总黄酮已被完全提
取，液料比继续增大，总黄酮质量分数趋于平缓。因
此，选择45∶ 1(mL∶ g)为最佳液料比。
图 3 料液比对白簕叶总黄酮提取含量的影响
Figure 3 The effects of ratio of liquid to material on the yields
of total flavonoids from Acanthopanax trifoliatus (L．)
Merr．
2． 3 响应面法优化提取工艺
在单因素考察试验基础上，采用 Box-Behnken
试验设计原理，选取乙醇体积分数、提取时间和液料
比 3 个因素作为自变量，以总黄酮质量分数为响应
值，设计三因素三水平共 17 个试验点的响应面分析
试验，因素及水平见表 1，设计方案与总黄酮质量分
数的响应值见表 2。
表 1 响应面分析优化白簕叶总黄酮提取工艺的因素与水
平表
Table 1 Factors and levels of response surface design of total
flavonoids from Acanthopanax trifoliatus (L．)Merr．
水平
因素
A
乙醇体积分数 /%
B
提取时间 /min
C
液料比 /(mL:g)
－ 1 40 30 35∶ 1
0 50 60 45∶ 1
1 60 90 55∶ 1
表 2 响应面分析优化白簕叶总黄酮提取工艺的设计方案
与结果
Table 2 The experimental design and results of response
surface analysis of total flavonoids from Acanthopanax
trifoliatus (L．)Merr
No． A B C w(总黄酮)/%
1 0 0 0 5． 02
2 1 0 1 4． 84
3 0 0 0 5． 04
4 0 1 1 5． 09
5 0 － 1 1 4． 54
6 1 0 － 1 4． 69
7 1 － 1 0 4． 24
8 0 － 1 － 1 4． 68
9 0 0 0 5． 22
10 0 0 0 5． 17
11 － 1 － 1 0 4． 32
12 0 0 0 5． 15
13 － 1 0 － 1 5． 02
14 1 1 0 4． 83
15 0 1 － 1 5． 06
16 － 1 1 0 4． 93
17 － 1 0 1 4． 69
采用 Design-Expert 8． 0． 6 对表 2 中的数据进行
二次回归拟合，建立回归模型以寻找最优条件，分析
结果见表 3。
813 广东药学院学报 第 31 卷
表 3 响应面法对白簕叶总黄酮提取量的 ANOVA分析结果
Table 3 Analysis of variance (ANOVA)of regression model on extraction yield of total flavonoids from Acanthopanax trifoliatus (L．)Merr．
项目 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 1． 320 9 0． 147 25． 525 0． 000 2
A 0． 015 1 0． 015 2． 698 0． 144 5
B 0． 571 1 0． 571 99． 381 ＜ 0． 000 1
C 0． 011 1 0． 011 1． 868 0． 214 0
AB 0． 000 1 0． 000 0． 051 0． 827 1
AC 0． 056 1 0． 056 9． 745 0． 016 8
BC 0． 007 1 0． 007 1． 245 0． 301 4
A2 0． 350 1 0． 350 60． 919 0． 000 1
B2 0． 264 1 0． 264 46． 011 0． 000 3
C2 0． 002 1 0． 002 0． 328 0． 584 9
残差 0． 040 7 0． 006
失拟项 0． 010 3 0． 003 0． 416 0． 751 6
误差 0． 031 4 0． 008
总离差 1． 360 16
模型确定系数 0． 970 4
模型的调整确定系数 0． 932 4
回归拟合得到的总黄酮质量分数(Y)与提取温
度(A)、乙醇体积分数(B)、提取时间(C)之间的二
次多项数学模型为 Y = 5． 117 － 0． 044 0A + 0． 267B
－ 0. 036 6C － 0． 008 59AB + 0． 118AC + 0． 042 3BC －
0. 288A2 － 0. 250B2 － 0． 021 1C2。
由表 3 可知，回归模型 P = 0． 000 2，表明该法建
立的模型有意义;失拟项表示所用模型与试验拟合
的程度，本文中的失拟项 P = 0． 751 6(P ＞ 0. 05)，表
明模型拟合较好，因此，可用该回归方程对试验结果
进行分析;同时，该模型的 Ｒ2 = 0． 970 4 和 Ｒ2Adj =
0. 932 4，表明 93． 24%的试验数据适用与该模型拟
合，进一步说明该模型与实际情况拟合较好，可用于
白簕叶总黄酮提取的试验预测。
影响总黄酮提取质量分数的因素主次关系为提
取时间 ＞乙醇体积分数 ＞液料比，其中提取时间为
高度显著的影响因素。二次项 A2、B2 达到高度显著
水平，交互项 AC具有显著影响，说明各因素对响应
值的影响并非简单线性关系。各交互因素响应曲面
图见图 4。
A．提取时间和乙醇体积分数的响应面图;B．液料比和乙醇体积分数的响应面图;C．提取时间和液料比的响应面图。
图 4 各因素两两交互作用对总黄酮提取质量分数的响应曲面图
Figure 4 Ｒesponse surface plots showing the effect of ethanol concentration，extraction time and ratio of liquid to material on the
extraction yields of total flavonoids from Acanthopanax trifoliatus(L．)Merr．
913第 3 期 杨慧文，等．响应面法优化白簕叶总黄酮的回流提取工艺
2． 4 优化条件的验证试验
利用 Design-expert 8． 0． 6 模拟得出的白簕叶总
黄酮最优提取工艺为乙醇体积分数为 48． 5%，提取
时间为 76 min，液料比为 41． 7∶ 1(mL∶ g)，所得总黄
酮质量分数的预测值为 5． 20%。为了验证响应面
法结果的可靠性，从实际生产出发，设定提取时间为
76 min，选用 49%的乙醇，在液料比为 42∶ 1(mL∶ g)
的提取条件下进行 3 次平行验证试验，得到的实际
平均总黄酮质量分数为 5． 12%，ＲSD 为 2． 08%，模
型对总黄酮质量分数的预测值为 5． 20%，实际值与
预测值相比误差仅为 1． 58%，相差较小，说明模型
是可行的，响应面法优化得到的白簕叶总黄酮提取
工艺具有实际生产价值。
3 讨论
本文在考察白簕叶总黄酮提取的单因素时，对
温度的影响也进行了考察，发现随着温度的提高，白
簕叶总黄酮的质量分数逐渐增大，而 70%乙醇的沸
点约为 80 ℃，因此，最终将 80 ℃确定为提取温度。
本文采用响应面法对白簕叶总黄酮提取方法进
行优化，结果显示，提取时间为高度显著的影响因
素，且乙醇体积分数和料液比 2 个因素之间有交互
作用，结果细致描述了每个考察因素对总黄酮质量
分数的影响，且能很好地预测提取最优方案，经过验
证试验发现响应面法优化回流提取后得到的白簕叶
总黄酮提取质量分数为 5． 12%，与前期正交试验法
优化提取得到的提取质量分数(3． 70%)相比［9］，有
明显提高;相比已报道的微波提取法［10-11］，响应面
法优化后的回流提取法提取质量分数也较高。响应
面法的优化为寻找白簕叶总黄酮更高效的提取方法
提供了参考，也为扩大白簕的开发和应用奠定了一
定的基础。
本文采用石油醚(30 ～ 60 ℃)对白簕叶进行脱
色素处理的时长往往多达 6 ～ 8 d，间接印证了文献
［15］报道的白簕叶中叶绿素质量分数较高(达 1． 07
mg /g)的结果，由于叶绿素具有造血功能、脱臭作用
和一定的抑菌作用，可对消炎药起辅助作用，因
此，在对白簕叶黄酮进行研究的同时，也可开展
对叶绿素的研究，有利于白簕叶的全面开发，提
高资源的利用效率。
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(责任编辑:陈翔)
023 广东药学院学报 第 31 卷