全 文 ：　　　　　PTCA(PA RT B:CHEM .ANA L.)　　　　　2011 年月 第 47 卷 5
工作简报
高效液相色谱-质谱法测定尿液中
痕量雷公藤春碱
施跃锦1 , 蔡美强1＊ , 金米聪2
(1.浙江工商大学 环境科学与工程学院 , 杭州 310035;
2.宁波市疾病预防控制中心 宁波市毒物研究与控制重点实验室 , 宁波 315010)
摘　要:提出了尿液中雷公藤春碱的高效液相色谱-质谱测定方法。尿液样品经Waters Oasis?
MCX固相萃取小柱富集 、净化后 ,以Zorbax Eclipse SB C18反相色谱柱(4.6 mm ×250 mm , 5 μm)
为分离柱 ,以乙酸盐缓冲溶液-乙腈(40+60)为流动相 ,采用正离子模式大气压化学电离源 ,在选择
离子监测模式下进行检测 ,雷公藤春碱的定量离子质荷比(m/z)为 874.4。线性范围为 0.2 ～
50.0 μg ·L -1 ,检出限(3S/N)为 0.07 μg · L-1 ,测定下限(10S/ N)为 0.2 μg ·L -1 。回收率在
86.0%～ 92.0%之间 ,日内(n=6)和日间(n=15)相对标准偏差分别小于 7.5%和 10.5%。
关键词:高效液相色谱-质谱法;固相萃取;雷公藤春碱;尿液
中图分类号:O657.63　　　文献标志码:A　　　文章编号:1001-4020(2011)05-0517-03
HPLC-MS Determination of Trace Amount of Wilfortrine in Urine
SHI Yue-jin1 , CAI Mei-qiang1＊ , JIN Mi-cong2
(1.School o f Environmental Science and Engineering , Zhejiang University of Industry and
Commerce , Hangzhou 310035 , China;
2.Ningbo Municipal Key Lab.of Research and Control o f Poisons , Ningbo Munici pal Center f or
Control and Prevention of Disease , Ningbo 315010 , China)
Abstract:A method fo r the de te rmination o f wilfo rtrine in urine by H PLC-MS was propo sed.Wilfo rt rine in
sample w as sepa rated , enriched and purified on the Wa te rs Oasis? MCX SPE co lumn.The eluate w as used for
HPLC-MS determination , in w hich the Zo rbax Eclipse SB C18 co lumn (4.6 mm ×250 mm , 5 μm)was used as
chr omatog raphic column , and a mixture o f acetate buffe r so lution and acetonitrile(40+60)w as used as mobile
phase.Atmospheric pressure chemical ionization sour ce w ith po sitive ionization mode as w ell as selected ion
monito ring mode w as used in the detection.Ion used fo r quantification was m/z 874.4.Linearity range was found
betw een 0.2-50.0 μg· L-1 , and values o f detection limit(3S/ N)and low er limit of determina tion(10S/ N)fo und
were 0.07 μg · L-1 and 0.2 μg · L -1 respectively.Values of recovery we re ranged from 86.0% to 92.0%.Values
of RSD′s (intra-day , n=6)and RSD′s(inter-day , n=15)were less than 7.5% and 10.5%, respectively.
Keywords:HPLC-MS;So lid-phase ex traction;Wilfo rt rine;Ur ine
收稿日期:2010-07-27
基金项目:浙江省分析测试基金项目(2009F70014);浙江省自
　然科学基金面上项目(Y5080099)
作者简介:施跃锦(1977-), 男 ,浙江金华人 ,硕士 ,副教授 ,主
　要从事生物及环境污染物的分析研究。
＊联系人
　　雷公藤春碱属倍半萜类雷公藤生物碱 ,具有一
定的毒性 ,是一种主要的雷公藤活性成分 ,也是目前
应用于临床的雷公藤制剂的主要活性成分之一 ,对
治疗自身免疫性疾病如类风湿性关节炎 、慢性肾炎 、
红斑狼疮 、接触性皮炎等有显著疗效[ 1-3] 。目前对雷
公藤生物活性成分的药理研究较少 ,对雷公藤春碱
·517·
施跃锦等:液相色谱-质谱法测定尿液中痕量雷公藤春碱
单体的研究更少 ,一个主要原因是缺少一种灵敏 、可
靠的痕量雷公藤春碱的测定方法。文献已报道对雷
公藤春碱的测定 ,主要采用液相色谱法紫外检测器
进行检测[ 4-6] ,由于紫外检测器抗干扰能力和灵敏度
相对较差 ,而尿液中雷公藤春碱含量较低 ,且基质复
杂 ,液相色谱法难以准确有效地监测 ,在药物的不良
反应研究中遇到瓶颈 。因此 ,尽快建立一种准确 、灵
敏的雷公藤春碱的测定方法 ,对评价和控制雷公藤
制剂的药物不良反应具有十分重要的现实意义。液
相色谱-质谱联用技术(LC-MS)是近年发展起来的
一种新型检测技术 ,已在药物分析及毒物残留分析
中得到广泛的应用[ 7-10] 。本工作采用高效液相色
谱-质谱法在大气压化学电离质谱正离子模式下检
测 ,利用选择离子监测(SIM)技术 ,建立了尿液中雷
公藤春碱检测方法 ,为进一步深入开展倍半萜类雷
公藤生物碱单体的药理研究奠定技术基础。
1　试验部分
1.1　仪器与试剂
1100 series LC/MSD T rap SL 型高效液相色
谱-质谱联用仪 ,包括四元泵 、在线真空脱气机 、柱温
箱 、自动进样器;全玻璃溶剂过滤器;HGC-24 型氮
吹仪;KQ-2200 型超声波清洗器;12 孔固相萃取仪;
Milli-Q 纯水系统;Waters Oasis? MCX 固相萃取小
柱(3 mL/60 mg)。
雷公藤春碱对照品:取雷公藤春碱对照品(自
制),经液相色谱紫外可见光检测器和质谱检测器测
定[ 6] ,纯度大于 95%。
雷公藤春碱对照品溶液:称取对照品 10.0 mg
于10 mL容量瓶中 ,加入少量乙腈溶解并稀释至刻
度 ,配成质量浓度 1.00 g ·L -1 ,于 4 ℃条件下避光
保存 ,备用 。移取 100 μL 储备溶液于 10 mL 容量
瓶中 ,用乙腈稀释至刻度 ,配成质量浓度 10.0 mg ·
L-1 ,于 4 ℃条件下避光保存 ,备用 。
乙酸盐缓冲溶液:0.5 g · L-1乙酸和5 mmo l·
L
-1乙酸铵溶液的混合溶液。
空白尿液:空白尿液采自健康志愿者(年龄在
20 ～ 25 岁),在-20 ℃下保存。
甲醇 、乙腈和乙酸为色谱纯 ,氨水 、乙酸铵 、盐酸
为分析纯 ,所有的溶剂使用前均用 0.45 μm 滤膜过
滤;试验用水为高纯水。
1.2　仪器工作条件
色谱条件:Zorbax Eclipse SB C18 色谱 柱
(4.6 mm×250 mm , 5 μm),Zorbax Eclipse SB C18
预柱(4.6 mm ×12.5 mm , 5 μm);流量 0.8 mL ·
min-1 ;柱温 30 ℃;流动相为乙酸盐缓冲溶液与乙
腈以体积比 40 比 60 混合而成 , 进样体积为
20.0μL。
质谱条件:大气压化学电离源(APCI),正离子
模式;扫描范围质荷比 m/z 200 ～ 1 000;毛细管电
压+3 100 V ,毛细管出口电压+118 V;干燥温度
325 ℃,雾化温度 425 ℃, 干燥气流量 6.0 L ·
min-1 ;喷雾压力 0.24 MPa;延迟时间 200 ms ,定量
模式为选择离子监测 ,定量离子 m/z 为 874.4 。
1.3　试验方法
移取经预先解冻的尿液试样 5.0 mL 于 10 mL
聚丙烯离心管中 , 加 2.0 mol · L -1 盐酸溶液
1.0 mL ,振摇 ,高速离心后吸取上清液 ,然后再加
2.0 mol·L-1盐酸溶液 2.0 mL ,振摇 ,高速离心后
吸取上清液 ,合并上清液待净化。将上清液全部转
入事先用甲醇 3.0 mL 和水 3.0 mL 活化 、平衡的
MCX 固相萃取小柱后 ,分别用水 3.0 mL , 甲醇
3.0 mL淋洗 ,再用含 10.0 g ·L-1氨水的甲醇溶液
3.0 mL 洗脱 ,收集洗脱液用氮吹仪吹干 ,用甲醇-水
(80+20)溶液定容至 1.0 mL ,过 0.45 μm 滤膜后 ,
取滤液 20.0μL ,按仪器工作条件进行测定 。
2　结果与讨论
2.1　色谱条件的优化
试验了 CLC C8 柱(5.0 mm×150 mm , 5μm),
Diamonsi l C18 柱(4.6 mm ×150 mm , 5 μm),
XBridge
TM
Shield RP18 柱(3.0 mm ×250 mm ,
5 μm)和 Zorbax Eclipse SB C18柱对雷公藤春碱与
基质分离的影响。结果表明:前 3 种色谱柱色谱峰
有一定的拖尾 ,而且保留时间偏长 ,分离效果不理
想 ,而 Zo rbax Eclipse SB C18柱的分离效果较好 ,色
谱峰峰形对称 ,保留时间适宜。试验选择 Zo rbax
Eclipse SB C18柱进行分离与测定。
试验了不同比例的乙腈-水 、甲醇-水 、甲醇-乙酸
铵和乙腈-乙酸铵缓冲溶液作流动相 ,对雷公藤春碱
分离测定的影响。结果表明:不加乙酸铵缓冲溶液 ,
分离效果较好 ,质谱检测的信号和稳定性较差;加入
一定量的乙酸铵溶液 ,可以较好地提高质谱检测的
灵敏度。同时试验表明:乙腈-乙酸铵缓冲溶液的分
离与检测效果优于甲醇-乙酸铵缓冲溶液的分离与
检测效果 。试验采用乙酸盐缓冲溶液与乙腈以体积
·518·
施跃锦等:液相色谱-质谱法测定尿液中痕量雷公藤春碱
比 40 比 60 混合作为流动相 ,雷公藤春碱与杂质得
到较好的分离 ,且保留时间较短 ,见图 1。
图 1　雷公藤春碱色谱图
Fig.1　Ch rom atogram of w il fort rine
由图 1 可知:雷公藤春碱色谱峰的两侧没有出
现明显的色谱峰 ,说明方法具有较好的分离。
2.2　质谱条件的优化
试验了电喷雾正 、负离子模式及 APCI 正 、负离
子模式的 4 种质谱离子化方式 ,结果表明:4 种质谱
离子化方式对雷公藤春碱均有较好的质谱响应信
号 ,但 APCI 正离子模式的质谱响应灵敏度较高 。
图 2 为 1.0 mg ·L-1雷公藤春碱标准溶液在 APCI
正离子模式下直接进样时的质谱图 。
图 2　雷公藤春碱在 APCI 正离子模式下的质谱图
Fig.2　Mass spect rum of wi lfort rin e in APCI(+)mode
由图 2 可知:雷公藤春碱具有强的[ M+H] +准
分子离子峰 m/z 874.4 ,试验选用 APCI 正离子模
式下以其准分子离子进行分析 ,选用选择离子监测
模式进行检测。
2.3　样品提取与净化条件的优化
雷公藤春碱具有较强的碱性 ,加入盐酸溶液后
形成盐酸盐 ,有助于其在水溶液中溶解。试验采用
选择离子监测技术进行检测 ,在一定程度上减轻了
基质对测定的干扰作用 ,但尿液基质成分复杂 ,共存
基质成分易对雷公藤春碱的质谱信号产生抑制和增
敏作用 ,且不同人群的尿液 ,基质存在明显的差异 ,
从而导致对质谱信号的影响也存在差异 ,影响检测
结果的准确度和精密度 。因此 ,针对复杂基质中雷
公藤春碱的分析 ,需事先进行一定程度的净化处理
才能保证检测结果的重复性 。试验采用 MCX 阳离
子交换柱进行净化 ,为了使雷公藤春碱能在固相萃
取小柱上以离子的形式得到保留 ,事先需对样品进
行酸化 ,使雷公藤春碱分子转变成雷公藤春碱阳离
子 ,在通过 MCX 阳离子交换柱时被保留在柱上。
然后采用适宜的淋洗液对杂质进行淋洗 ,有利于更
好地发挥固相萃取的功效。试验分别采用甲醇和水
进行淋洗 ,最后用含 10.0 g · L-1氨水的甲醇溶液
3.0 mL 洗脱 ,从而提高检测的灵敏度与准确度 ,减
少干扰物对质谱测定的影响 。
2.4　校正曲线和检出限
按试验方法配制质量浓度分别为 0.20 , 0.50 ,
1.0 ,2.0 ,5.0 ,10.0 ,20.0 ,50.0μg ·L-1雷公藤春碱
加标尿液按仪器工作条件对此标准溶液系列进行测
定。结果表明:尿液中雷公藤春碱质量浓度在0.2 ～
50.0μg ·L-1范围内呈线性关系 ,以雷公藤春碱的
峰面积对质量浓度进行线性回归 ,线性回归方程为
A=1 392.75 ρ+43.75 ,相关系数为 0.999 1。
在空白尿液中加入一定量的雷公藤春碱标准溶
液 ,使其质量浓度为 0.50 μg ·L-1 ,按试验方法平
行测定 8 次 ,以 3 倍信噪比计算雷公藤春碱的检出
限(3S/N)为 0.07μg ·L-1 ,以 10 倍信噪比计算雷
公藤春碱的测定下限(10S/N)为 0.2 μg ·L -1 。
2.5　精密度和回收率
对含雷公藤春碱质量浓度分别为 0.50 , 2.0 ,
20.0μg ·L-1的 3 个尿液样品进行测定 ,在同一天
内平行测定 6 次 ,计算其日内精密度;分别在两周内
选择 5d ,每天重复测定 3 次 ,计算其日间精密度 ,结
果见表 1。由表 1 可知:尿液中雷公藤春碱测定值
的日内相对标准偏差小于 7.5%,日间相对标准偏
差小于 10.5%。
表 1　加标尿样中雷公藤春碱测定值的日内与
日间相对标准偏差
Tab.1　Intra-day and inter-day RSD′s of determined values of
wil fortrine in urine sample with addi tion of standard solution
标准加入量
ρ/(μg· L -1)
日内 日间
平均测定值
ρ/(μg· L-1)
RSD
/ %
平均测定值
ρ/(μg· L -1)
RSD
/ %
0.50 0.46±0.03 6.5 0.47±0.04 8.5
2.0 1.72±0.12 7.0 1.68±0.15 8.9
20.0 17.46±1.45 7.3 16.98±1.71 10.1
通过表 1 中 3 个尿液加标样品的日内平均测定
值与标准加入量比较 ,雷公藤春碱的回收率分别为
92.0%, 86.0%,87.3%。 (下转第 522页)
·519·
刘建波等:微波消解样品-火焰原子吸收光谱法测定美白化妆品中铅和铜
2.3　标准曲线和检出限
按试验方法对铅 、铜的标准溶液系列进行测定 ,
铅和铜的质量浓度分别在 9.0 mg · L-1 和
11.0 mg ·L-1以内与其吸光度呈线性关系 ,线性回
归方程分别为 APb =0.030 4 ρ-0.000 6 ,相关系数
为 0.998 3;ACu =0.186 4 ρ+0.000 3 ,相关系数为
0.999 5。对 11 份空白溶液进行测定 ,铅和铜的检
出限(3s)分别为 21.8 μg ·L -1和 16.2μg ·L-1 。
2.4　方法精密度和回收率
取 9 种美白化妆品样品按试验方法各平行测定
6 份 ,铅的相对标准偏差在 0.58%～ 1.9%之间 ,铜
的相对标准偏差在 0.32%～ 1.5%之间。称取散
粉 、乳液 、美白水各一份做加标回收试验 ,试验结果
见表 2。
表 2　回收试验结果(n=6)
Tab.2　Resul ts of test for recovery
样品 元素 测定值　　　　　w/(μg· g -1)
标准加入量 测定总量
w/(μg· g -1)
回收率
/ % 样品 元素
测定值
　　　　　w/(μg· g -1)
标准加入量 测定总量
w/(μg· g -1)
回收率
/ %
散粉 Pb 8.5 9.0 17.6 101.2 散粉 C u 2.4 3.0 5.3 96.7
乳液 Pb 3.6 4.0 7.7 102.5 乳液 C u 1.6 2.0 3.6 100.0
美白水 Pb 4.1 5.0 9.0 98.0 美白水 C u 2.0 2.0 4.1 105.0
参考文献:
[ 1] 　陆蓉.化学与化妆品及化妆品的选择[ J] .高等函授学
报:自然科学版 , 2007 , 21(5):57-59.
[ 2] 　顾宇翔 ,徐红斌 ,葛宇 ,等.消解方法对电感耦合等离子
体原子发射光谱法测定化妆品中锑镉铬钕的影响[ J] .
理化检验-化学分册 , 2010 , 46(9):1031-1036.
[ 3] 　杨启霞 ,孙海燕 ,秦绍艳 , 等.微波消解原子吸收光谱法
测定土壤中的铅 、镉[ J] .环境科学与技术 , 2007 , 28
(5):47-48.
[ 4] 　杨启霞 , 韩吉衢 ,杜旭昌.土壤中铅 、镉测定的试样预处
理方法的改进[ J] .理化检验-化学分册 , 2007 , 43(12):
1024-1027.
[ 5] 　GB/ T 17141-1997　土壤质量铅 、镉的测定石墨炉原
子吸收分光光度法[ S] .
[ 6] 　傅明 , 袁智能 , 黄志强.火焰原子吸收光谱法测定茶叶
中的铅[ J] .光谱实验室 , 2002 , 19(1):66-68.
(上接第 519页)
本工作提出的固相萃取富集净化 ,高效液相色
谱-质谱法测定尿液中痕量雷公藤春碱的方法 ,具有
准确 、快速 、灵敏的特点 ,能满足雷公藤春碱的药理
研究测定要求。
参考文献:
[ 1] 　马伟光 ,张滔 , 张超 ,等.有毒药物雷公藤的研究及展望
[ J] .中华中医药杂志 , 2006 , 21(2):117-120.
[ 2] 　舒孝顺 ,高中洪 ,杨祥良 , 等.雷公藤生物碱的化学和药
理活性研究进展[ J] .广东药学院学报 , 2003 , 19(2):
150-152.
[ 3] 　BEROZA M.Alkaloids from T riptery gium wilfo rdii
hook.f.The structure of w ilforine , wilfo rdine , wil-
for gine and w ilfor trine[ J] .J Am Chem Soc, 1953 , 75
(1):44-49.
[ 4] 　陈列忠 , 王开金 , 陈建明 ,等.RP-H PLC 法同时测定不
同产地雷公藤根皮中 3 种生物碱的含量[ J] .药物分析
杂志 , 2007 , 27(2):191-193.
[ 5] 　OUYANG Xiao-kun , JIN M i-cong , HE Chao-hong.
Simultaneous de te rmination o f four sesquiterpene alka-
loids in T ripteryg ium w ilfordii Hook.f.ex tracts by
high-pe rfo rmance liquid chroma to g raphy [ J] .Phy to-
chem Anal , 2007 , 18(4):320-325.
[ 6] 　OUYANG Xiao-kun , JIN M i-cong , HE Chao-hong.
Prepara tive separation o f four majo r alkaloids from
medicinal plant of T riptery gium w ilfordii Hook.f.u-
sing high-speed counte r-current chromatog raphy [ J] .
Sep Purif T echno l , 2007 , 56(3):319-324.
[ 7] 　金米聪 , 马建明 ,姚浔平 , 等.全血中痕量雷公藤红素的
液相色谱/质谱联用法测定研究[ J] .中国卫生检验杂
志 , 2008 , 18(7):1242-1244.
[ 8] 　OUYANG Xiao-kun , JIN M i-cong , HE Chao-hong.
Simultaneous determination o f tripto lide and tripdiolide
in ex tr act of T riptery gium w ilfordii Hook.f.by LC-
APCI-M S[ J] .Chromatog raphia , 2007 , 65(5/ 6):373-
375.
[ 9] 　陈晓红 , 姚浔平 , 金米聪.尿液中杀它仗的高效液相色
谱-串联质谱测定研究[ J] .中国卫生检验杂志 , 2007 ,
17(8):1423-1424.
[ 10] 　金米聪 ,马建明 , 李小平 , 等.全血中杀鼠迷的高效液
相色谱-电喷雾电离质谱联用法测定研究[ J] .中国卫
生检验杂志 , 2005 , 15(6):656-658.
·522·