全 文 ：３１卷０１期
Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．０１
草　业　科　学
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ
８３－８８
０１／２０１４
ＤＯＩ：１０．１１８２９＼ｊ
櫧櫧櫧櫧
櫧
櫧
櫧櫧櫧櫧
櫧
櫧
毥
毥毥
毥
．ｉｓｓｎ．１００１０６２９．２０１３００５３
植物
生产层
利用ＳＭＡＲＴ技术构建歪头菜　　
叶片全长ｃＤＮＡ文库　　
韩 瑜，强维亚
（草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学生命科学学院，甘肃 兰州７３００００）
摘要：以歪头菜（Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａ）为研究材料，用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取歪头菜叶片组织总ＲＮＡ，用ＳＭＡＲＴ　ＴＭ　ｃＤＮＡ
Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ构建ｃＤＮＡ文库。经测定，初级文库滴度达到２．３×１０６　ｐｆｕ·ｍＬ－１，扩增后文库总滴度
为６．２×１０９　ｐｆｕ·ｍＬ－１，重组率为９２．７％。从扩增后的文库随机挑取１６个噬菌斑进行ＰＣＲ扩增鉴定，结果显
示，插入片段大多分布在５００～２　５００ｂｐ。用ＰＣＲ法从该文库中扩增出了以往用ＲＡＣＥ法克隆出的歪头菜木质
素合成相关基因ＣＡＤ３′端全序列。通过各项指标验证成功构建了歪头菜叶片全长ｃＤＮＡ文库。
关键词：歪头菜；ｃＤＮＡ文库；ＳＭＡＲＴ技术
中图分类号：Ｓ５４１＋．９０１；Ｑ９４４．５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００１－０６２９（２０１４）０１－００８３－０６＊
Ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ
Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａｗｉｔｈ　ＳＭＡＲＴ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ＨＡＮ　Ｙｕ，ＱＩＡＮＧ　Ｗｅｉ－ｙａ
（Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｌａｓｓｌａｎｄ　ａｎｄ　Ａｇｒｏ－ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ
Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａｎｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｆｏｒ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｖｉｃｉａｕｎｉｊｕｇａｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＳＭＡＲＴＴＭ　ｃＤＮＡ
ｌｉｂｒａｒｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ａｆｔｅｒ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｏｆ　Ｖ．ｕｎｉｊｕｇａｌｅａｖｅｓ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｔｒｉｚｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔ．Ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ
ｌｉｂｒａｒｙ　ｈａｓ　ｔｉｔｅｒ　ｏｆ　２．３×１０６　ｐｆｕ·ｍＬ－１，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｈａｓ　ａ　ｈｉｇｈ　ｔｉｔｅｒ　ｏｆ　６．２×１０９　ｐｆｕ·ｍＬ－１
ａｎｄ　９２．７％ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｒａｔｅ．Ｓｉｘｔｅｅｎ　ｐｌａｑｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｌｉｂｒａｒｙ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉ－
ｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｒａｎｇｅｄ　ｆｒｏｍ　５００ｔｏ　２　５００ｂｐ．Ｔｈｅ　３′
ｅｎｄ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ＣＡＤ，ａ　Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａｇｅｎｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌｉｇｎｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｗｈｉｃｈ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｃｌｏｎｅｄ　ｂｙ
ＲＡＣＥ，ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲ，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｆｏｒ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ
Ｖ．ｕｎｉｊｕｇａｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＳＭＡＲＴ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａ；ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ；ＳＭＡＲＴ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＱＩＡＮＧ　Ｗｅｉ－ｙａ　Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｗｙ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
　　歪头菜（Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａ），多年生豆科牧草，广
泛分布于青藏高原高寒草甸，是甘肃省甘南藏族
自治州主要豆科牧草之一，是当地家畜饲料的重
要植物蛋白质来源之一，同时也是当地用于草地
恢复、进行补播和建立栽培草地采用的优质牧草
之一。其所处的自然地理环境———青藏高原地
区，多年来长期维持在一个臭氧低值状态［１］，紫外
线辐射能量积累很高。该地区的生态稳定性不仅
＊ 收稿日期：２０１３－０１－２１　　接受日期：２０１３－０３－２０
基金项目：国家自然科学基金（３１０７０３５３）；甘肃省科技支撑项目（２００７ＧＳ０４９７６）
第一作者：韩瑜（１９８８－），女，甘肃天水人，在读硕士生，研究方向为植物分子生态学。Ｅ－ｍａｉｌ：２３６７５２５４６＠ｑｑ．ｃｏｍ
通信作者：强维亚（１９５８－），男，甘肃兰州人，副教授，博士，研究方向为生态学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｗｙ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．０１） ０１／２０１４
对草地畜牧业经济发展有重要的战略意义，而且
强烈影响我国西部环境的变化。歪头菜对当地自
然环境有天然适应能力，其潜在的抗逆基因资源
丰富，有待发掘。而目前，国内外对其研究和报道
主要集中在它的药用和食用价值［２］，以及形态组
织鉴定和人工培育技术［３］等方面，对其分子遗传
水平及基因结构水平上的研究鲜见报道，尤其是
其在全球条件变化下的分子遗传水平响应研究更
为鲜见。因此，本试验通过 ＳＭＡＲＴ（Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ
Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ａｔ　５′ｅｎｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，
ＲＮＡ转录５′末端转换机制）技术，构建歪头菜叶
片全长ｃＤＮＡ文库，旨在为进一步筛选和克隆与
紫外辐射增强响应相关的基因序列以及功能基因
组学研究奠定基础。
１　材料与方法
１．１　植物材料
歪头菜种子于２０１１年９月采自甘肃省甘南藏
族自治州卓尼县（海拔２　９２４ｍ，３４°２８．１７８′Ｎ，
１０３°０６．１０５′Ｅ），挑选成熟饱满、熟度一致的歪头菜
种子，在实验室条件下萌发，待萌发的幼苗生长１５～
２０ｄ后，选取生长状况良好、无病虫害的歪头菜叶
片，用无菌去离子水冲洗干净，液氮速冻后置于－７０
℃冰箱备用。
１．２　试剂ＳＭＡＲＴ
ｃＤＮＡ文库构建试剂盒（ＳＭＡＲＴＴＭｃＤＮＡ　Ｌｉ－
ｂｒａｒｙ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，ｃａｔ＃６３４９０１）和 ＬＤ－ＰＣＲ
试剂盒（Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２ＰＣＲ　Ｋｉｔ，ｃａｔ＃６３０２０７）购自
ＣＬＯＴＥＣＨ 公司，ＲＮＡ 提取试剂（ＴＲＩＺＯＬ　Ｒｅａ－
ｇｅｎｔ）和纯化柱（ＵＮＩＱ－１０）购自上海生工生物工程
公司，包装蛋白（Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩＩ　Ｇｏｌｄ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｅｘ－
ｔｒａｃｔ，ｃａｔ＃２００２０１）购自Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司，其它常规
试剂及耗材均为国产。
１．３　总ＲＮＡ提取
按照 ＴＲＩＺＯＬ　Ｒｅａｇｅｎｔ使用说明书提取总
ＲＮＡ，将总ＲＮＡ沉淀用ＤＥＰＣ水溶解，在核酸分析
仪上测定总ＲＮＡ在２３０、２６０、２８０ｎｍ处的光密度
值（ＯＤ值），以检测其浓度和纯度。用１．２％琼脂糖
凝胶电泳检测所提总ＲＮＡ品质，用凝胶成像系统
观察 ＲＮＡ完整性。
１．４　ｃＤＮＡ文库构建
１．４．１　双链ｃＤＮＡ 合成　取１μＬ（约１μｇ）总
ＲＮＡ，以带有ＳｆｉＩ酶切位点的ＳＭＡＲＴ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ－
ｏｔｉｄｅ ［５′－ＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣ－
ＣＡＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＧ－３′］和 ＣＤＳ　ＩＩＩ／３［５′－ＡＴ－
ＴＣＴＡＧＡＧ　ＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ－ｄ（Ｔ）
３０Ｎ－１Ｎ－３′］为引物，在ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ逆转录酶作用
下反转录出ｃＤＮＡ第一链。取２μＬ第一链产物进
行ＬＤ－ＰＣＲ，合成ｃＤＮＡ第二链。１００μＬ反应体系
为第一链ｃＤＮＡ、５′ＰＣＲ引物、ＣＤＳ　ＩＩＩ／３′ＰＣＲ引
物、５０×ｄＮＴＰ混合物和５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２Ｐｏｌｙ－
ｍｅｒａｓｅ　ｍｉｘ各２μＬ，１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ
１０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　８０μＬ。ＰＣＲ反应条件为９５℃预变
性１ｍｉｎ，９５℃１５ｓ，６８℃６ｍｉｎ，２０个循环。反应
结束后取５μＬ产物用１．２％琼脂糖凝胶进行电泳
检测。
１．４．２　ｃＤＮＡ消化及纯化　取５０μＬ　ＬＤ－ＰＣＲ产
物，加入２μＬ　２０ｇ·Ｌ
－１的蛋白酶Ｋ，４５℃温育２０
ｍｉｎ消化残余的Ｔａｑ酶。纯化回收ｃＤＮＡ后，用ＳｆｉＩ
酶于５０℃酶切２ｈ，产生分别带有ＳｆｉＩ　Ａ和ＳｆｉＩ　Ｂ
黏性末端的 ｄｓ　ｃＤＮＡ。将酶切产物全部加入
ＣＨＲＯＭＡ　ＳＰＩＮ－４００层析柱分级分离，回收５００ｂｐ
以上的ｃＤＮＡ片段合并，加入０．１倍体积的 ＮａＡｃ
（３ｍｏｌ·Ｌ－１），２．５倍体积的９５％乙醇和１．３μＬ糖
原，－２０℃过夜后离心去上清，用７μＬ去离子水溶
解ｃＤＮＡ沉淀。
１．４．３　ｃＤＮＡ与载体连接及体外包装　参照ＳＭ－
ＡＲＴＴＭｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ试剂盒使
用说明书，将双链ｃＤＮＡ与λＴｒｉｐＩＥｘ２载体连接，用
Ｔ４ＤＮＡ连接酶于１６℃连接过夜。共设计了３种
不同比例的连接体系（表１）。
　　取３种连接产物各５μＬ，用包装蛋白（Ｇｉｇａ－
ｐａｃｋ　ＩＩＩ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｅｘｔｒａｃｔ）分别进行体外包装，２２
℃包装２ｈ，然后加入２０μＬ氯仿和５００μＬ噬菌体
缓冲液，轻柔混匀后短暂离心，取上清即得到具有侵
染能力的噬菌体颗粒，４℃保存。此为ｃＤＮＡ初级
文库。
１．５　文库品质鉴定
１．５．１　文库滴度测定　用噬菌体缓冲液对上述３
种包装后的连接产物分别做不同倍数稀释，参照徐
刚标等［４］对初级文库滴度测定的方法，测定３种连
接效率的文库滴度，按最高滴度连接的ｃＤＮＡ与载
体比例，放大连接和包装。
１．５．２　文库重组率测定　利用Ｘ－Ｇａｌ显色原理，将
４８
０１／２０１３ 草　业　科　学 （第３１卷０１期）
表１　３种不同比例连接体系
Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｒｅｅ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ
成分
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
１号连接管
Ｎｏ．１ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅ／μＬ
２号连接管
Ｎｏ．２ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅ／μＬ
３号连接管
Ｎｏ．３ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅ／μＬ
ｃＤＮＡ　 ０．５　 １．０　 １．５
载体Ｖｅｃｔｏｒ（５００ｍｇ·Ｌ－１） １．０　 １．０　 １．０
１０×连接缓冲液１０×Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　 ０．５　 ０．５　 ０．５
ＡＴＰ（１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１） ０．５　 ０．５　 ０．５
Ｔ４ＤＮＡ连接酶Ｔ４ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　 ０．５　 ０．５　 ０．５
双蒸水ｄｄＨ２Ｏ ２．０　 １．５　 １．０
总体积Ｔｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅ　 ５．０　 ５．０　 ５．０
菌株涂布于含有ＩＰＴＧ（４００ｇ·Ｌ－１）和Ｘ－Ｇａｌ（２５
ｇ·Ｌ－１）的ＬＢ／ｔｅｔ培养基上，３７℃过夜培养，次日
通过蓝白斑的数量计算文库重组率。
　重组率＝［白斑数／（白斑数＋蓝斑数）］×１００％［５］。
１．５．３　文库插入片段大小检测　参照ＳＭＡＲＴＴＭ
ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ使用说明书，从初
级文库中随机挑取１６个噬菌斑为模板分别进行
ＰＣＲ扩增，以检测插入片段长度。ＰＣＲ反应条件为
９４℃预变性４ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，６８℃２ｍｉｎ，２５个循
环，７２ ℃延伸５ｍｉｎ。每管取５μＬ　ＰＣＲ 产物用
１．２％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
１．６　文库扩增和保存
参照欧阳锋等［６］、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等［７］的方法，在
２００μＬ　ＸＬ－Ｂｌｕｅ菌株过夜悬浮培养液中加入１μＬ
初级文库，于３７℃培养２０ｍｉｎ，后铺于４５℃保温
的ＬＢ／ＭｇＳＯ４ 顶层培养基上，３７℃培养８～１０ｈ，
待长出噬菌斑后，分别在每一个平板中加入１０ｍＬ
噬菌体缓冲液，４℃放置２～１６ｈ洗脱噬菌体，收集
所有噬菌体缓冲液并合并，４℃下２　８００ｇ离心５
ｍｉｎ去除细胞碎片，得到扩增文库。扩增后的文库
中加入ＤＭＳＯ（７％），混合均匀，分装成１ｍＬ的小
份，－７０℃保存。
１．７　歪头菜木质素合成相关基因ＣＡＤ３′端全序列
克隆
取扩增后的歪头菜叶片全长ｃＤＮＡ文库２μＬ，
加入 ＣＡＤ　３′ 端 全 长 正 向 引 物 ［５′－ＣＴＧＡＡＡ－
ＣＡＡＡＧＴＧＧＧＣＴＡＡＧＡＧＧＴＧ－３′］和 反 向 引 物
［５′－ＣＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＧＴＴＡＣＧＴＡＧＣ－３′］、ｄＮＴＰ
ｍｉｘ各１μＬ，２×ｐｒｅｍｉｘ　Ｔａｑ　ｂｕｆｆｅｒ　２５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ
３０μＬ组成５０μＬ　ＰＣＲ反应体系进行扩增反应，反
应条件为９５℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５５℃
退火３０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，３３个循环，７２℃保温１０
ｍｉｎ。扩增产物用１．０％琼脂糖凝胶进行电泳检测，
纯化回收后连接到ｐＵＣ１８－Ｔ载体上并转化大肠杆
菌，挑取阳性克隆测序。
２　结果与分析
２．１　总ＲＮＡ品质鉴定
提取的歪头菜叶片总 ＲＮＡ 经核酸分析仪测
定，总 ＲＮＡ 含量为１　０３５．４ｍｇ·Ｌ－１，ＯＤ２６０ｎｍ／
ＯＤ２８０ｎｍ为２．０９，ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２３０ｎｍ为２．３６，这表明所
得总 ＲＮＡ纯度较高，蛋白质、酚类、盐分等杂质基
本去除干净。１．２％琼脂糖凝胶电泳检测结果（图
１）显示，２８Ｓ、１８ＳｒＲＮＡ特征条带清晰，亮度比接近
２∶１，无明显拖尾，加样孔处无亮带，说明总 ＲＮＡ
较完整，无降解，也无明显基因组ＤＮＡ污染，符合
建库要求。
２．２　初级文库品质鉴定
用１．２％琼脂糖凝胶电泳检测ＬＤ－ＰＣＲ产物，
结果表明（图２）。双链ｃＤＮＡ成一弥散带，长度主
要集中在５００～１０　０００ｂｐ，品质较好，符合构建ｃＤ－
ＮＡ文库的要求［７］。
　　将双链ｃＤＮＡ 经ＳｆｉＩ酶切后加入ＣＨＲＯＭＡ
ＳＰＩＮ－４００层析柱分级分离，按每管１滴收集液滴
（每滴３５～４５μＬ），共收集１６～１８管液滴，每管收
集物取３μＬ用１．２％琼脂糖凝胶进行电泳检测，回
收５００ｂｐ 以 上 的 ｃＤＮＡ 片 段。经 ＣＨＲＯＭＡ
ＳＰＩＮ－４００层析柱分离后的ｃＤＮＡ片段主要集中在
第７管到第１０管（图３），因此合并第７－１０管的
ｃＤＮＡ，用于连接试验。
５８
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．０１） ０１／２０１４
图１　歪头菜叶片总ＲＮＡ电泳检测
Ｆｉｇ．１　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａ
注：Ｍ，２５０ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１，Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ．
图２　双链ｃＤＮＡ
Ｆｉｇ．２　Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔａｎｄｅｄ　ｃＤＮＡ
注：Ｍ，１　０００ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１，ｄｓ　ｃＤＮＡ．
　　将双链ｃＤＮＡ与λＴｒｉｐＩＥｘ２载体按照体积比分
别为０．５∶１、１∶１和１．５∶１进行连接反应，体外包
装后得到３种不同滴度的初级文库，经测定，３种初
级文库滴度分别为０．９×１０６、２．３×１０６ 和１．５×１０６
ｐｆｕ·ｍＬ－１，按１∶１连接的滴度最大，因此按该比
例放大连接和包装，共得到５５０μＬ初级文库。扩增
后的总文库滴度为６．２×１０９　ｐｆｕ·ｍＬ－１，重组率为
９２．７％。文库插入片段在５００～２　５００ｂｐ，平均插入
片段大小在１　０００ｂｐ以上 （图４）。
２．３　ＣＡＤ基因３′端全序列克隆
歪头菜ＣＡＤ基因３′端的全序列是在以往通过
ＲＡＣＥ方法获得的，其序列全长为６９２ｂｐ。以扩增
后的文库为模板，加入ＣＡＤ３′端全长５′、３′引物对
其进行ＰＣＲ扩增，经电泳检测及测序验证其序列正
确（图５），证明通过ｃＤＮＡ文库成功扩增出ＣＡＤ基
因３′端全序列，显示出用歪头菜叶片全长ｃＤＮＡ文
库筛选歪头菜相关基因的可靠性，再次表明所构建
的文库符合后续研究要求。
３　讨论与小结
经典的全长ｃＤＮＡ文库构建方法有Ｃａｐ－ｔｒａｐ－
ｐｅｒ法、Ｏｌｉｇｏ－ｃａｐｐｉｎｇ法、Ｃａｐ－ｔｕｒｅ法、Ｃａｐ－ｊｕｍｐｉｎｇ
法等［８－１１］。常规的文库构建需要在合成的双链
ｃＤＮＡ两端连接上相同或者不同的接头（Ａｄａｐｔｏｒ），
图３　双链ｃＤＮＡ分级分离
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔａｎｄｅｄ　ｃＤＮＡ
注：Ｍ，１　０００ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１～１７，分级分离后的ＬＤ－ＰＣＲ产物。
Ｎｏｔｅ：Ｍ，１　０００ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１～１７，ＬＤ－ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｆｔｅｒ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．
６８
０１／２０１３ 草　业　科　学 （第３１卷０１期）
图４　文库插入片段检测
Ｆｉｇ．４　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｉｎｓｅｒｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｉｂｒａｒｙ
注：Ｍ，２５０ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１～１６，随机克隆ＰＣＲ产物。
Ｎｏｔｅ：Ｍ，２５０ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１～１６，Ｒａｎｄｏｍ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．
图５　ＣＡＤ基因３′端ＰＣＲ扩增图谱
Ｆｉｇ．５　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ＣＡＤｇｅｎｅ　ｉｎ　３′ｅｎｄ
注：１，扩增产物；Ｍ，２００ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ。
Ｎｏｔｅ：１，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ；Ｍ，２００ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ．
酶切后才可以插入载体中。由于连接效率较低，常
导致较长的ｃＤＮＡ或低丰度ｃＤＮＡ信息的丢失，使
文库偏重高丰度和较短的序列，失去应有的代表性。
然而用两个不同的Ａｄａｐｔｏｒ又会涉及双酶切以及双
酶切是否完全的问题，影响产率。本研究选用
ＳＭＡＲＴ技术建库，其基本原理是利用ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ
逆转录酶内源的末端转移酶活性来得到全长
ｃＤＮＡ，只需要２５ｎｇ　ｍＲＮＡ或５０ｎｇ总ＲＮＡ就可
以得到高品质、高产量的ｃＤＮＡ文库［１２］，一步即可
完成，不需要额外的酶反应及ｃＤＮＡ抽提纯化。此
外，该技术在双链ｃＤＮＡ引物５′端引入了ＳｆｉＩ　Ａ和
ＳｆｉＩ　Ｂ位点，因此只需对目的ｃＤＮＡ进行单酶切，就
可以定向插入特定的载体中［１３］。最后，该技术建库
的实验操作简单可行，每一步结果都可以通过电泳
检测，便于及时发现和解决问题。
　　从歪头菜叶片组织中提取高品质的ＲＮＡ是成
功构建歪头菜叶片全长ｃＤＮＡ 文库的必要前提。
目前常用的ＲＮＡ提取方法有Ｔｒｉｚｏｌ法、苯酚法、异
硫氰酸胍法、ＣｓＣｌ梯度离心法等［１４－１５］。本研究中使
用的ＲＮＡ提取办法是Ｔｒｉｚｏｌ抽提试剂加ＵＮＩＱ－１０
吸附柱纯化，简化了 ＲＮＡ提取流程。与经典的异
丙醇沉淀方法相比，柱式纯化方法能更有效地去除
蛋白及其它杂质。并且，其柱膜式设计有效减少了
反应体系与外界的接触，大大减少了外源ＲＮａｓｅ的
污染。在植物组织取材方面，由于植物组织中富含
酚类化合物、多糖、次级代谢产物，且ＲＮａｓｅ的活性
较高［１６］。酚类物质被氧化后会与 ＲＮＡ 不可逆结
合，导致ＲＮＡ活性丧失［１７］；而多糖会与ＲＮＡ形成
难溶的胶状物共沉淀下来［１８］；萜类化合物会造成
ＲＮＡ的化学降解［１９］。这些因素都严重干扰了从植
物组织中成功提取ＲＮＡ。本研究采取了在取材前
先将植物组织暗培养２～３ｄ的方法，以使植物组织
中糖类、蛋白类等物质大量消耗，并且取材尽量选择
幼嫩的植物叶片组织。结果证明用此方法加之Ｔｒ－
ｉｚｏｌ抽提试剂与 ＵＮＩＱ－１０吸附柱结合的办法提取
的歪头菜总ＲＮＡ完整性较好、含量较高、杂质污染
较少，符合建库所用的总ＲＮＡ要求。
文库滴度和插入片段大小是反映文库品质的重
要指标。依据 Ｗｉｌｉａｍｓ［２０］的理论计算，当要求以
９９．９％的概率得到某种低丰富度的ｃＤＮＡ克隆时，
文库的滴度不应低于１．７×１０５　ｐｆｕ·ｍＬ－１。本研
究构建的歪头菜全长ｃＤＮＡ初级文库滴度为２．３×
１０６　ｐｆｕ·ｍＬ－１，扩增后的总文库滴度为６．２×１０９
７８
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．０１） ０１／２０１４
ｐｆｕ·ｍＬ－１，这一结果保证了在通过筛选ｃＤＮＡ文
库而获得目的基因时稀有基因不被漏掉。依据
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，若重组体插入片段的大小各异且平均大
小约为１　０００ｂｐ或更大，则值得继续到下一阶段，
即构建完整的ｃＤＮＡ文库；若插入片段平均大小显
著小于１　０００ｂｐ，则文库的品质不会高。本研究构
建的双链ｃＤＮＡ片段大小在５００～２　５００ｂｐ，平均片
段大小在１　０００ｂｐ以上，由于植物 ＲＮＡ 相对较
短［５］，因此在该范围内的片段大小是有效的。
在今后的工作中，将以本研究为基础，扩增出歪
头菜ＣＡＤ基因全长ｃＤＮＡ，同时钓取歪头菜对紫外
辐照增强响应相关的基因，了解其在长期强紫外辐
射下的分子遗传学机制，筛选高抗紫外辐射的当地
优良牧草品系，这对于恢复草原生态稳定、提高草地
品质和生产力具有重要的意义，也为歪头菜功能基
因组学研究奠定了基础。
参考文献
［１］　周秀骥，罗超，李维亮．中国地区臭氧总量变化与青藏高原低值中心［Ｊ］．科学通报，１９９５，４０（１５）：１３９６－１３９８．
［２］　董然，文连奎，李丹茹，姚玉霞，陈丹．广东菜，歪头菜，螯麻子菜单营养成份及保健作用分析［Ｊ］．中国林副特产，１９９６，
３９（４）：２４－２５．
［３］　丁培俊．野生优良牧草———歪头菜［Ｊ］．中国草地，１９９６，２（１）：７８．
［４］　徐刚标，房学爽，叶翠层．利用ＳＭＡＲＴ技术构建珙桐叶片全长ｃＤＮＡ文库［Ｊ］．中南林业科技大学学报，２００８，２８（６）：４１．
［５］　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ，Ｆｒｉｓｈ　Ｅ　Ｆ，Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｅｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｍ］．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９：１２３１．
［６］　欧阳锋，王东生，郝坡，刘北忠，刘畅，钟梁，金丹婷，王翀．人 Ｋ５２６细胞ｃＤＮＡ文库的扩增、纯化、鉴定和酵母细胞转化
［Ｊ］．重庆医科大学学报，２００８，３３（１）：１４－１５．
［７］　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ，Ｆｒｉｓｈ　Ｅ　Ｆ，Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．分子克隆实验指南［Ｍ］．第二版．北京：科学出版社，１９９６：３９９－４４８．
［８］　Ｓｅｋｉ　Ｍ，Ｃａｒｎｉｎｃｉ　Ｐ，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ　Ｙ，Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ　Ｙ，Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ　Ｋ．Ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｂｙ
ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ＣＡＰ　ｔｒａｐｐｅｒ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９８，１５（５）：７０７－７２０．
［９］　Ｓｕｚｕｋｉ　Ｙ，Ｓｕｇａｎｏ　Ｓ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ａｎｄ　ａ　５′ｅｎｄ　ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｏｌｉｇｏ－ｃａｐｐｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，２２１（１）：７３－９１．
［１０］　Ｅｄｅｒｙ　Ｉ，Ｃｈｕ　Ｌ　Ｌ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ　Ｎ，Ｐｅｌｅｔｉｅｒ　Ｊ．Ａｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａｎ　ｍＲＮＡ　ＣＡＰ－
ｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，１５（６）：３３６３－３３７１．
［１１］　毛新国，景蕊莲，孔秀英，赵光耀，贾继增．几种全长ｃＤＮＡ文库构建方法比较［Ｊ］．遗传，２００６，２８（７）：８６５－８７３．
［１２］　刘卫辉，窦科峰．ＳＭＡＲＴ技术及其应用进展［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００８，２８（６）：１２９－１３２．
［１３］　王家保，徐碧玉，金志强，冯超．利用ＳＭＡＲＴ技术构建荔枝果皮ｃＤＮＡ文库［Ｊ］．热带作物学报，２００９，３０（８）：１１１１．
［１４］　李永明，赵玉琪．实用分子生物学方法手册［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９９：３２８－３３９．
［１５］　赵双宜，吴耀荣，夏光敏．介绍一种简单高效的植物总ＲＮＡ提取方法［Ｊ］．遗传，２００２，２４（３）：３３７－３３８．
［１６］　李宏，王新力．植物组织ＲＮＡ提取的难点及对策［Ｊ］．生物技术通报，１９９９，１５（１）：３６－３９．
［１７］　Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｂａｕｅｒ　Ａ，Ｓａｎｄｅｒｍａｎｎ　Ｈ　Ｊｒ，Ｅｒｎｓｔ　Ｄ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｒｉｃｈ　ｉｎ　ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，１９７（１）：９１－９５．
［１８］　Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎ　Ｅ，Ｓｔｅｅｌｅ　Ｃ　Ｌ，Ｃｒｏｔｅａｕ　Ｒ．Ｓｉｍｐｌｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　ｗｏｏｄｙ　ｓｔｅｍｓ　ｏｆ　ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｔｅｒ，１９９４，１２（１）：２０－２５．
［１９］　Ｇｒａｈａｍ　Ｇ　Ｃ．Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｆｒｏｍＰｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｃｏｎｉｆｅｒｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｒｅｐｏｔｅｒ，１９９３，１１（１）：３２－３７．
［２０］　Ｗｉｌｉａｍｓ　Ｊ　Ｇ．Ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ　ｂａｎｋ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９８１，１２（１）：５５－５９．
（责任编辑　王芳）
８８