全 文 ：１９９９，１５（２）：８６－８９．
［７］　Ｋｉｍ　Ｓ，Ｉｚｕｍｉ　Ｙ，Ｉｚｕｍｉｙａ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｏｍ－
ｂｉｎｅｄ　ｂｌｏｃｋａｄｅ　ｏｆ　ＡＣＥ　ａｎｄ　ＡＴ１ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｏｎ　ｉｎｔｉｍａｌ　ｈｙｐｅｒｐｌａ－
ｓｉａ　ｉｎ　ｂａｌｏｏｎ－ｉｎｊｕｒｅｄ　ｒａｔ　ａｒｔｅｒｙ［Ｊ］．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｖａｓｃ
Ｂｉｏｌ，２００２，２２（８）：１２９９－１３０４．
［８］　Ｏｋａｄａ　Ｋ，Ｈｉｒａｎｏ　Ｔ，Ｒａｎ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｌｍｅｓａｒｔａｎ　ｍｅｄｏｘｏｍｉｌ，ａｎ
ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ＩＩ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｌｏｃｋｅｒ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ａｎｄ　ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｆｅｄ　ｒａｔｓ［Ｊ］．
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ｂｌｏｃｋｅｒ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ　ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒｉ－
ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｏｆ　Ｚｕｃｋｅｒ　ｆａｔｔｙ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｅｎ－
ｄｏｔｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ，２００４，２８７（２）：２２７－２３２．
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ｏｎ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｌｉｐｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｉｎ　ｎｏｎｄｉａｂｅｔｉｃ，ｉｎｓｕｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔ－
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ｈｅｐａｔｉｃ　ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｖｉａ　ｉｔｓ　ｔｙｐｅ　２ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ｒａｔｓ
［Ｊ］．Ｊ　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ，２００５，２３（８）：１５２５－１５３０．
［１４］Ｆｉｅｌｄｉｎｇ　Ｂ．Ｔｒａｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆａｔｅ　ｏｆ　ｄｉｅｔａｒｙ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄｓ：ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ　ｌｉｐａｅｍｉａ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ
Ｎｕｔｒ　Ｓｏｃ，２０１１，７０（３）：３４２－３５０．
［１５］Ｚｈａｎｇ　Ｘ，Ｌｉ　ＺＺ，Ｌｉｕ　ＤＦ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎ－
ｚｙｍｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅａｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６ａｎｄ　ａｄｉ－
ｐｏｎｅｃｔｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２ｉｎ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｙｐｅ　２ｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９，３６（７）：６３１－６３６．
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血压、血肌酐及尿白蛋白的影响［Ｊ］．中华医学实践杂志．２００９，
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ｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｕｇｍｅｎｔｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔ　ｅｌａｓ－
ｔａｓｅ－２，ａｎ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ＩＩ－ｆｏｒｍｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ
Ｈｅａｒｔ　Ｃｉｒｃ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１１，３０１（２）：Ｈ５６５－Ｈ５７０．
［１８］Ｃｈｅｎｇ　Ｊ，Ｚｈａｎｇ　Ｘ，Ｔｉａｎ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｔｈｅｒａｐｙ　ａｎ
ＡＣＥ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ａｎｄ　ａｎ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｌｏｃｋｅｒ　ｆｏｒ　ＩｇＡ　ｎｅ－
ｐｈｒｏｐａｔｈｙ：ａ　ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｐｒａｃｔ，２０１２，６６
（１０）：９１７－９２３．
［１９］Ｔｙｌｉｃｋｉ　Ｌ，Ｌｉｚａｋｏｗｓｋｉ　Ｓ，Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ　Ｂ．Ｒｅｎｉｎ－ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ａｌ－
ｄｏｓｔｅｒｏｎｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂｌｏｃｋａｄｅ　ｆｏｒ　ｎｅｐｈｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：ｃｕｒｒｅｎｔ　ｅｖｉ－
ｄｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｆｕｔｕｒｅ　ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｎｅｐｈｒｏｌ，２０１２，ｄｏｉ：１０．
５３０１／ｊｎ．５０００１３４．
［２０］Ｔｈａｔｃｈｅｒ　Ｓ，Ｙｉａｎｎｉｋｏｕｒｉｓ　Ｆ，Ｇｕｐｔｅ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ａｄｉｐｏｓｅ　ｒｅ－
ｎｉｎ－ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｓｙｓｔｅｍ：ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｍｏｌ
Ｃｅｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２００９，３０２（２）：１１１－１１７．
［收稿日期］２０１２－１０－１７
［作者简介］雷湘，女，博士，副教授，研究方向天然药物生物活性物质基础，电话：１８９７１４８７３２０，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｅｉｘｉａｎｇ１９７０＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ　［通讯作者］
阮金兰，男，教授，博士生导师，研究方向：天然药物生物活性物质基础。
渐尖毛蕨黄酮对３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞增殖与分化的影响
雷湘１，杨娴２，陈镜楼２，阮金兰１，２　（１．武昌理工学院生命科学学院，湖北 武汉４３０２２３；２．华中科技大学同济药学院，湖
北 武汉４３００３０）
［摘要］　目的：探索渐尖毛蕨对３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞增殖与分化的影响。方法：通过检测细胞存活率和检测细胞乳酸脱氢酶
（ＬＤＨ）分泌量来评价渐尖毛蕨是否存在细胞毒性，通过检测细胞的油红Ｏ染色程度，ＬＤＨ分泌量和细胞葡萄糖消耗来综合
评价渐尖毛蕨给药对前脂肪细胞增殖分化的影响。结果：渐尖毛蕨给药组的细胞 ＭＴＴ值和ＬＤＨ分泌值未有明显改变，而给
药组油红染色程度和甘油三酯（ＴＧ）含量均显著性下降了，同时葡萄糖消耗明显上升。结论：渐尖毛蕨具有抑制３Ｔ３－Ｌ１前脂
肪细胞增殖与分化的活性。
［关键词］　渐尖毛蕨；３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞；增殖；分化
［中图分类号］Ｒ９６３　　［文献标识码］Ａ　　［文章编号］１００１－５２１３（２０１３）１０－０７７５－０４
Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　３Ｔ３－Ｌ１　ｐｒｅａｄｉｐｏ－
ｃｙｔｅｓ
ＬＥＩ　Ｘｉａｎｇ１，ＹＡＮＧ　Ｘｉａｎ２，ＣＨＥＮ　Ｊｉｎｇ－ｌｏｕ２，ＲＵＡＮ　Ｊｉｎ－ｌａｎ１，２（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｗｕｃｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕｂｅｉ　Ｗｕｈａｎ　４３０２２３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｔｏｎｇｊｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕｂｅｉ　Ｗｕｈａｎ　４３００３０，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｈｅ　ａｉｍ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗａｓ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　３Ｔ３－Ｌ１ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ　ａｎｄ
ＬＤＨ　ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｏｉｌ　ａｎｄ　ｒｅｄ　Ｏ　ｓｔａｉｎｉｎｇ，ＴＧ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔａｋｅｎ
ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｎｏ　ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｏｉｌ　ａｎｄ　ｒｅｄ　Ｏ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ＴＧ　ｏｆ　Ｃｙ－
ｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔａｋｅｎ　ｗａｓ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｃｙ－
·５７７·中国医院药学杂志２０１３年第３３卷第１０期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，２０１３Ｍａｙ，Ｖｏｌ　３３，Ｎｏ．１０
DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2013.10.008
ｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　３Ｔ３－Ｌ１ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：Ｃｙｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ；３Ｔ３－Ｌ１ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
　　渐尖毛蕨Ｃｙｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ（Ｈｏｕｔｔ）Ｎａ－
ｋａｉ是金星蕨科毛蕨属渐尖毛蕨干燥根茎或全草，
药用名黑舒筋，牛肋巴，小叶凤凰尾巴草等。《中华
本草》记载其具有治疗消化不良、小儿疳积，痢疾泄
泻，热淋，烧烫伤，狂犬咬伤，咽喉肿痛，风湿痹痛等
药用价值［１］。文献报道其具有改善小鼠高血糖和糖
尿病肾病的作用，其作用机制与调控ＰＰＡＲ家族和
细胞因子分泌有关［２］。报道显示脂肪组织是人体重
要的分泌器官，３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞在分化为脂肪
细胞过程中分泌的细胞因子将诱导胰岛素抵抗的形
成，而该分化过程亦受ＰＰＡＲ家族调控［３］。因此，
本实验重点探讨渐尖毛蕨对３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞
增殖与分化的影响。
１　材料
荧光倒置显微镜（日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，Ｏｌｙｍ－
ｐｕｓ－Ｃｋｘ４１型）；酶标仪（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　Ａｓｅｎｔ　Ｖ１．２３
型，美国）；ｐＨ仪（美国 Ｍｅｔｔｌｅｒ　Ｔｏｌｅｄｏ公司，ＤＥＬ－
ＴＡ３２０型）；超低温冰箱（美国Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　Ｓｃｉ－
ｅｎｔｉｆｉｃ公司，Ｖ４１０型）；０．２２μｍ膜式过滤器（美国
Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司，Ｍｉｌｅｘ　ＧＰ型）。
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ
（ＤＭＥＭ）培养基购于美国Ｇｉｂｃｏ化学试剂公司；链
霉素、青霉素、胰蛋白酶购自于美国 Ａｍｒｅｓｃｏ化学
试剂公司；３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）２，５－ｄｉｐｈｅ－
ｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）、ＤＭＳＯ、３－异丁基－１－
甲基黄嘌呤（３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，ＩＢＭＸ）、
地塞米松、胰岛素（牛）购于美国Ｓｉｇｍａ化学试剂公
司；格列本脲（山西云鹏制药有限公司）。
细胞与药材３Ｔ３－Ｌ１小鼠前脂肪细胞来源于
武汉市同济医院；渐尖毛蕨全草采至江西九江，由江
西省九江林科所高级工程师谭策铭教授鉴定为金星
蕨 科 毛 蕨 属 渐 尖 毛 蕨 Ｃｙｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ
（Ｈｏｕｔｔ）Ｎａｋａｉ。渐尖毛蕨冻干粉末按照已报道的
工艺用溶剂热回流提取、萃取法制备得到［２］，总黄酮
含量用芦丁等量法检测［４］，其总黄酮含量为２８．
７７％。
２　方法［５－７］
２．１　细胞 ＭＴＴ检测　取ＤＭＥＭ 培养基，灭活胎
牛血清，链霉素，青霉素配置培养基含１０％胎牛血
清，１００μｇ·ｍＬ
－１链霉素和１００Ｕ·ｍＬ－１青霉素。
３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞于３７℃、５％ 二氧化碳／９５％空
气环境下培养２４ｈ。取９６孔细胞板１块，将３Ｔ３－
Ｌ１前脂肪细胞以５×１０４个／ｍＬ的密度接种于９６
孔板Ｂ２－１１、Ｃ２－１１、Ｄ２－１１、Ｅ２－１１、Ｆ２－１１和Ｇ２－１１各
孔，每孔０．２ｍＬ。Ａ１－１２、Ｈ１－１２、１Ａ－Ｈ 和１２Ａ－Ｈ
各孔加入ＰＢＳ每孔０．２ｍＬ。放入培养箱培养１２ｈ。
取出９６孔板，换液，Ｂ到Ｆ行２－１１列分别加药使得
各行终质量浓度为Ｂ：渐尖毛蕨２５μｇ·ｍＬ
－１，Ｃ：５０
μｇ·ｍＬ
－１，Ｄ：１００μｇ·ｍＬ
－１，Ｅ：２００μｇ·ｍＬ
－１，Ｆ：格
列本脲２５μｇ·ｍＬ
－１，放入培养箱培养２４ｈ，进行细
胞 ＭＴＴ检测。用酶标仪在４９０ｎｍ波长下检测吸
光度，记录为 Ａ。如下计算细胞存活率：存活率＝
（Ａ测定孔－Ａ空白孔）／（Ａ正常孔－Ａ空白孔）。
２．２　细胞分化试剂准备　取０．２ｍＬ浓盐酸，加入
新制超纯水９．８ｍＬ，充分混合均匀，精密称量胰岛
素５ｍｇ，溶解于该酸化水中。分装后于－２０℃保
存。得胰岛素储备液，质量浓度为０．５ｍｇ·ｍＬ－１。
取１ｍＬ经过０．２２μｍ微孔滤膜过滤的无水乙醇，精
密称量地塞米松５ｍｇ溶解于无水乙醇中，加入新制
超纯水９９ｍＬ，充分混合均匀。质量浓度为０．０５
ｍｇ·ｍＬ－１，分装后于－２０℃保存，得地塞米松储备
液。精密称量ＩＢＭＸ５ｍｇ溶解于１００μＬ二甲亚砜
中，充分混合均匀。得ＩＢＭＸ储备液，质量浓度为
５０ｍｇ·ｍＬ－１。用该储备液和已配制的正常ＤＭＥＭ
培养基配制３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞生长各阶段所需
的分化型（Ｉ型，ＩＩ型）培养基。其中Ｉ型培养基含
１０％的胎牛血清、１００μｇ·ｍＬ
－１的链霉素、１００Ｕ·
ｍＬ－１的青霉素、０．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１的ＩＢＭＸ、１μｍｏｌ·
Ｌ－１的地塞米松和５μｇ·ｍＬ
－１的胰岛素，ＩＩ型培养
基含１０％的胎牛血清，１００μｇ·ｍＬ
－１的链霉素，１００
Ｕ·ｍＬ－１的青霉素和５μｇ·ｍＬ
－１的胰岛素。
２．３　油红Ｏ染色　取６孔细胞培养板和灭菌过的
盖玻片。仔细将盖玻片平整铺入细胞培养板的每个
孔内，每孔一片，铺于正中央，并且仔细排尽气泡，以
制备细胞爬片。将３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞以５×１０４
个／ｍＬ的密度接种于到６孔板爬片上。分别加药
使得各孔终质量浓度为渐尖毛蕨２５，５０，１００，２００
μｇ·ｍＬ
－１，和格列本脲２５μｇ·ｍＬ
－１。之后放入培养
箱培养２ｄ。取出换液，每孔加入分化ＩＩ型培养基
２ｍＬ，放入培养箱培养２ｄ后取出换液操作。之后
每隔２ｄ换液，每孔加入正常培养基２ｍＬ（含１０％的
胎牛血清，１００μｇ·ｍＬ
－１的链霉素和１００Ｕ·ｍＬ－１的
青霉素）直到第８天。正常对照组细胞在显微镜下
观察可见油脂小滴存在，标志３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞
·６７７· 中国医院药学杂志２０１３年第３３卷第１０期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，２０１３Ｍａｙ，Ｖｏｌ　３３，Ｎｏ．１０
分化为脂肪细胞成功。然后取出６孔板，对细胞进
行油红染色实验，具体操作如下。精密称量６００ｍｇ
的油红Ｏ染色剂溶解于１００ｍＬ的异丙醇，在５０℃
溶解１ｈ至完全溶解。避光静置过夜，过滤后室温保
存。取出６孔板，用ＰＢＳ清洗２次后用２ｍＬ　ＰＢＳ
新鲜配制的３．７％的甲醛溶液固定１ｈ。然后用注射
用水仔细清洗３次，自然避光晾干，用１～２ｍＬ的油
红Ｏ染色剂染色１ｈ。弃去多余油红Ｏ染色剂。并
用双蒸水仔细清洗２次，晾干。显微镜下观察染色
成功后。细胞的油脂小滴用适量６０％的异丙醇溶
解，在５２０ｎｍ波长下检测吸光度。
２．４　ＬＤＨ检测　取２４孔细胞板１块，将３Ｔ３－Ｌ１
前脂肪细胞以５×１０４个／ｍＬ的密度接种于２４孔细
胞板各孔，每孔０．５ｍＬ，放入培养箱培养２４ｈ。取
出２４孔细胞板，换液。分别加药使得各列终质量浓
度为渐尖毛蕨２５，５０，１００，２００μｇ·ｍＬ
－１，和格列本
脲２５μｇ·ｍＬ
－１。之后放入培养箱继续培养，分别在
１２，２４，４８ｈ时间点收集上清液。２　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心
１０ｍｉｎ，取上清液５０μＬ在－８０℃保存，用于ＬＤＨ
检测。操作如下。ＬＤＨ 工作液配制：精密称量
１２．１ｇ三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）于１　０００ｍＬ量瓶
中，用超纯水充分溶解，定溶。得０．１ｍｏｌ·Ｌ－１的
Ｔｒｉｓ溶液。取１０ｍＬ浓盐酸于１００ｍＬ量瓶中，加
入超纯水９０ｍＬ，混合均匀得０．１ｍｏｌ·Ｌ－１的盐酸溶
液。精密量取 Ｔｒｉｓ溶液５０ｍＬ和盐酸溶液４２ｍＬ
于１００ｍＬ容量瓶中，调节为ｐＨ　７．４，定容，得５０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ｐＨ　７．４的Ｔｒｉｓ缓冲液。精密称量烟酰
胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤＨ）２．８８ｍｇ和１４６ｍｇ
ＥＤＴＡ，充分溶解于１００ｍＬ的５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ｐＨ
７．４的 Ｔｒｉｓ缓冲液中，混合均匀。得ＬＤＨ 工作液
（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ－ＮＡＤＨ；５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　Ｔｒｉｓ缓冲液－
１５０μｍｏｌ·Ｌ
－１　ＮＡＤＨ－５ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＥＤＴＡ，ｐＨ　７．４，
３７℃。取５０μＬ待测样品，加入２ｍＬ的ＬＤＨ工作
液，混合均匀后于３７℃恒温孵育１２ｍｉｎ。取出，加
入在３７℃预热的１３．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１的丙酮酸钠２００
μＬ，混合均匀，记录为第０ｍｉｎ。在３７℃，３４０ｎｍ波
长下检测第１，２，３ｍｉｎ时的吸光度 Ａ１，Ａ２和 Ａ３。
对照组的吸光度记录为Ａ１＇，Ａ２＇，和Ａ３＇。ＬＤＨ释放
率＝（Ａ１／Ａ１＇＋ Ａ２／Ａ２＇＋ Ａ３／Ａ３＇）／３
２．５　ＴＧ检测　取２４孔细胞板１块，将３Ｔ３－Ｌ１前
脂肪细胞以５×１０４个／ｍＬ的密度接种于２４孔细胞
板各孔。分别加药使得各列终浓度为渐尖毛蕨２５，
５０，１００，２００μｇ·ｍＬ
－１，和格列本脲２５μｇ·ｍＬ
－１。
培养２ｄ。取出换液，每孔加入分化ＩＩ型培养基２
ｍＬ（含１０％胎牛血清，１００μｇ·ｍＬ
－１链霉素，１００Ｕ
·ｍＬ－１青霉素和５μｇ·ｍＬ
－１胰岛素），放入培养箱培
养２ｄ。之后每隔２天换液，每孔加入正常培养基２
ｍＬ（含１０％的胎牛血清，１００μｇ·ｍＬ
－１的链霉素和
１００Ｕ·ｍＬ－１的青霉素）直到第８天。细胞在显微镜
下观察可见油脂小滴存在。标志３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细
胞分化为脂肪细胞成功。分化后超声破碎细胞，收
集细胞液检测ＴＧ。
２．６　葡萄糖消耗实验　取２４孔细胞板１块，将
３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞以５×１０４个·ｍＬ－１的密度接种
于２４孔细胞板各孔。每孔０．５ｍＬ。进行分化操
作。分别加药使得各列终质量浓度为渐尖毛蕨２５，
５０，１００，２００μｇ·ｍＬ
－１，和格列本脲２５μｇ·ｍＬ
－１。
之后放入细胞培养箱继续，第９天取出换液同法给
药，第１０天取出，换液。此时改用不含葡萄糖的培
养基，在１Ａ－Ｄ，２Ａ－Ｄ，３Ａ－Ｄ，和４Ａ－Ｄ分别加入含药
培养基使得渐尖毛蕨终质量浓度为２５，５０，１００，２００
μｇ·ｍＬ
－１，每孔２ｍＬ。５Ａ－Ｄ加入含药培养基使得
格列本脲终浓度为２５μｇ·ｍＬ
－１，５Ａ－Ｄ加入不含药
的正常培养基，放入细胞培养箱继续１ｈ，取出，换
液，此时改用含８ｍｍｏｌ·Ｌ－１的葡萄糖的培养基，在
１Ａ－Ｄ，２Ａ－Ｄ，３Ａ－Ｄ，和４Ａ－Ｄ分别加入含药培养基
使得渐尖毛蕨终浓度为２５，５０，１００，２００μｇ·ｍＬ
－１，
每孔２ｍＬ。５Ａ－Ｄ加入含药培养基使得格列本脲终
质量浓度为２５μｇ·ｍＬ
－１，５Ａ－Ｄ加入不含药的正常
培养基放入细胞培养箱继续１ｈ。取出２４孔细胞培
养板，收集上清液，检测培养基剩余葡萄糖的含量。
细胞葡萄糖消耗率＝（８ｍｍｏｌ／Ｌ－剩余葡萄糖量）／
８ｍｍｏｌ·Ｌ－１。
３　结果
实验首先利用检测细胞存活率和检测细胞分泌
ＬＤＨ水平来考察渐尖毛蕨是否有潜在的细胞毒作
用，结果如图１Ａ和Ｃ所示，梯度浓度（２５～２００μｇ·
ｍＬ－１）的各渐尖毛蕨黄酮给药组，阳性组和正常组
之间均没有显示出３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞的细胞毒
性，说明该浓度范围的渐尖毛蕨干预是安全可靠的。
随后采用经典诱导分化法，对３Ｔ３－Ｌ１细胞进行诱
导分化。分化成功后，用油红 Ｏ染色，异丙醇溶解
检测吸光度，定量反映细胞内脂肪的含量来判断细
胞的分化程度。从图１Ｂ可以看出，成熟的脂肪细
胞中油脂含量较高（染色后吸光度高），而渐尖毛蕨
呈剂量依赖性的抑制了前脂肪细胞分化为脂肪细胞
（Ｐ＜０．０５）。图１Ｄ－Ｅ表示了分化成熟的脂肪细胞
其ＴＧ含量上升而葡萄糖利用率降低。同样的，渐
尖毛蕨呈剂量依赖性的抑制了这种改变（Ｐ＜
０．０５）。其中２００μｇ·ｍＬ
－１渐尖毛蕨给药增强葡萄
·７７７·中国医院药学杂志２０１３年第３３卷第１０期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，２０１３Ｍａｙ，Ｖｏｌ　３３，Ｎｏ．１０
糖利用率的生理活性比阳性对照更为显著（Ｐ＜
０．０５）。图中，ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ为统计学显著性标示。
标注有相同数标（ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ）的组没有显著性
差异，不同数标组之间具有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。
图Ａ和Ｃ中各组之间均没有显著性差异。数据统
计使用ＳＰＳＳ软件完成。
图１　渐尖毛蕨对３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞分化的影响（ｎ＝１０）
Ａ．渐尖毛蕨对３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞存活率的影响图；Ｂ．渐尖毛蕨
对３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞油红Ｏ染色的影响图；Ｃ．渐尖毛蕨对３Ｔ３－
Ｌ１前脂肪细胞ＬＤＨ分泌的影响图；Ｄ．渐尖毛蕨对３Ｔ３－Ｌ１前脂肪
细胞ＴＧ分泌的影响图；Ｅ．渐尖毛蕨对３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞葡萄糖
利用率的影响图
Ｆｉｇ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ　ｏｎ　３Ｔ３－Ｌ１（ｎ＝１０）
Ａ．ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　３Ｔ３－Ｌ１ｖｉａｂｉｌｉｔｙ；Ｂ．
ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｉｌ　ｒｅｄ　Ｏ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　３Ｔ３－
Ｌ１；Ｃ．ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＬＤＨ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ
３Ｔ３－Ｌ１；Ｄ．ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＴＧ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ
ｏｆ　３Ｔ３－Ｌ１；Ｅ．ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏｓｏｒｕｓ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ
ｔａｋｅｎ　ｏｆ　３Ｔ３－Ｌ１
４　讨论
渐尖毛蕨在民间药用已有相当长的历史。近年
来多种结构新颖的黄酮类化合物首次从该植物中提
取分离得到［８］。研究报道亦显示渐尖毛蕨具有显著
性的调节血脂混乱，抑制糖尿病等药用潜力［２］。
３Ｔ３－Ｌ１细胞株广泛应用于肥胖和糖尿病的细胞层
面研究中，其作为前脂肪细胞在分化为脂肪细胞的
过程中会分泌多种促炎症因子（例如ＩＬ－６等），从而
诱发胰岛素抵抗［７］。本实验首先分别采用 ＭＴＴ法
检测渐尖毛蕨对３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞是否存在细胞
毒作用；采用检测分化后的脂肪细胞分泌ＬＤＨ 量
的方法评价渐尖毛蕨对分化后的脂肪细胞是否存在
细胞毒作用。结果显示渐尖毛蕨对正常的３Ｔ３－Ｌ１
前脂肪细胞和已经分化成的脂肪细胞均无杀细胞作
用。在排除假阳性结果的同时亦提示了其药用的安
全性。随后，本文利用经典胰岛素诱导法诱导３Ｔ３－
Ｌ１前脂肪细胞增殖和分化，并在分化过程中进行进
行梯度浓度的渐尖毛蕨给药干预。结果显示渐尖毛
蕨能够呈剂量依赖性的明显抑制３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细
胞增殖和分化，给药后脂滴聚集程度明显减轻，ＴＧ
分泌量显著性减少。同时葡萄糖转运加强，说明渐
尖毛蕨给药能够抑制３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞增殖和分
化诱导的胰岛素抵抗形成。该结果显示渐尖毛蕨对
糖尿病的控制具有深远的意义，并且其作用环节可
能集中在３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞的分化过程中。
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Ｎａｔ　Ｐｒｏｄ，２００６，６９（１１）：１６４１－１６４４．
［收稿日期］２０１２－１２－０１
·８７７· 中国医院药学杂志２０１３年第３３卷第１０期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，２０１３Ｍａｙ，Ｖｏｌ　３３，Ｎｏ．１０