全 文 ：安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2015，21（21）
一株蓝果树科植物内生真菌的分离和抑菌效果测定
柳斌斌
（宿州市土壤肥料站，安徽宿州 234000）
摘 要：实验采用传统植物内生菌分离方法，从一株蓝果树科植物的根、枝、叶片上分离得到 16 株内生真菌；
通过对峙抑菌试验筛选得到 2 株具有抑菌活性的内生真菌，编号为 G-1、G-4，并对这 2 株内生真菌进行发
酵，对发酵液做抑菌试验，结果显示，此 2 株内生菌具有较明显的抑菌作用。
关键词：植物内生真菌；抑制作用；发酵液试验
中图分类号 Q94 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）21-43-03
The Endophytic Fungi Isolated from a Blue Fruit Plant and the Determination of Inhibitory Effect
Liu Binbin
（Soil and Fertilizer Station of Suzhou City，Suzhou 234000，China）
Abstract：In this experiment，we obtained 16 endophytic fungiuse isolated from the roots，branches and leaves of a
blue fruit plant，using the traditional method of endophyte separation；we obtained two endophytic fungi with antibac⁃
terial activity through the antimicrobial test，G-1，G-4，and ferment this two endophytic fungi，test the antibacterial
of the fermentation broth，the results showed that the two endophyte with more pronounced bacteriostasis.
Key words：Endophytic fungi；Inhibited effect；Fermentation broth test
植物内生真菌作为生物防治菌株有多方面的优势，
在防治真菌、细菌引起的病害以保护宿主植物中起着非
常重要的作用。所谓植物内生真菌（endophyte），是存在
于健康植物组织内的对植物组织没有明显病害症状的一
类真菌微生物［1］，近年来研究表明，其通常会产生与其宿
主植物相同或相似的生理活性物质［2］，在宿主的生长发育
和系统演化过程中起重要的作用［3］。真菌产生的生物活
性物质存在极大的多样性（如抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗
真菌、抗虫等物质），利用植物内生真菌来研究开发生物
农药，是解决化学农药‘3R’问题（抗性、残留和再猖獗）的
有效途径之一［4］。植物内生真菌能够产生功能特殊的次
生代谢产物，是新化合物新药物的潜在资源，它们在医
药、工业、农业等领域具有重要的应用前景［5］，利用微生物
防治植物病害就是利用微生物对病原物的抑制作用。为
此，笔者对从植物中分离出的菌株进行液体培养，并对其
发酵产物进行了杀菌活性的测定。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
1.1.1 植物病原菌 番茄灰霉（FQhm），番茄枯萎
（FQkw），茄黑纹（Qhw），苹果轮纹（PGlw），葡萄灰霉
（PThm），梨黑心（Lhx），苹果腐烂菌（PGfl），葡萄黑豆
（PThd），枣炭疽（Ztj），均由安徽农业大学植病实验室
提供。
1.1.2 植物内生菌 G-1、G-4，从一株蓝果树体内分离，
由本实验室保存。
1.2 培养基
1.2.1 分离培养基 PDA 培养基 马铃薯 200g，葡萄糖
20g，琼脂 20g，水 1 000mL，ph 自然。
1.2.2 PDA 培养基制备方法 取新鲜马铃薯 200g 洗
净，去皮，切成 1cm 见方的小块，放入 1 000mL 水中煮
沸 30min，用 2 层纱布过滤。加入称量好的葡萄糖（或
蔗糖）和琼脂，加热搅拌至琼脂完全融化，加蒸馏水配制
成 1 000mL 溶液。趁热用分装漏斗分装于 500mL 三
角瓶中，橡皮纸封口注上标签；高压蒸汽灭菌 121℃灭菌
30min 备用。
1.2.3 发酵培养基 PDA 液体培养基 方法同上，不加
琼脂。
1.3 内生真菌的分离 取样品适当大小（枝条长度 5cm
左右，叶片为全叶的 1/2 大小，种子整粒）按以下步骤处
理：自来水表面清洗 4～5 次→消毒纸巾吸干水分→75%
酒精漂洗 4～5min→无菌水冲洗 2～3 次→消毒纸巾吸
干水分→0.1%升汞漂洗 10～30s→无菌水冲洗 4～5 次，
无菌条件下将枝条韧皮部切去再切成 5mm×5mm 小块，
种子切成 5mm×10mm 大小，叶片 5mm×5mm 大小，置于
平板培养基上 28℃避光恒温培养；最后一次冲洗无菌水
设为对照培养，若无培养物生长说明样品消毒彻底。
作者简介：柳斌斌（1985-），男，安徽宿州人，助理农艺师，从事土壤肥料工作。收稿日期：2015-10-21
43
DOI:10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2015.21.019
安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2015，21（21）
1.4 内生菌的纯化保存
1.4.1 纯化 平板培养 2～3d 后，其边缘长出菌丝，用接
种针挑取边缘生长良好的菌丝，分别接种在新的固体培
养基上，待新接种的菌丝长成菌落后，再挑取其边缘的菌
丝培养，如此反复纯化，得到纯化的菌株。观察记录菌落
的生长情况及特征。
1.4.2 保存 纯化后的内生菌平板活化，取生长旺盛的
内生菌接种到斜面低温保存备用。
1.5 筛选
1.5.1 初筛 将内生菌平板活化，在菌落边缘打取菌碟
（直径 7mm）接种于 PDA 培养基平板中央，采用对峙培
养测定法，在培养基的 4 个角接病原菌，距离 2.5cm 左
右，以不接内生菌的单皿单菌碟的病原菌为对照，28℃下
培养，每天观察，记录下有抑菌作用的内生菌，保存下来
以备复筛。
1.5.2 复筛 将初筛所得的内生菌转接活化 3～4d，采
用对峙培养测定法，把活化好的内生菌置于含供试病原
菌的 PDA 培养基上，内生菌菌碟与病原菌菌碟在培养皿
的直径上，两者相距 2.5cm 左右。设 3 个重复，用只接病
原菌菌碟的 PDA 培养基作对照，28℃培养 3～4d，记录
抑菌半径。
1.6 发酵试验 取活力旺盛的内生真菌 G-4、G-1 的菌
碟（直径 7mm），无菌条件下放入 250mL 装有 100mLPD
培养基的摇瓶里，每瓶 3 块菌碟，3 个重复；28℃，160r/min
摇床发酵 7d。发酵液 8 000r/min 离心，无菌过滤（平行试
验除菌方法为 121℃高压灭菌 30min）上清液 1mL 加入培
养皿，然后把冷却到 50℃左右的 PDA9mL 倒入同一皿中
立即摇匀。凝固后接入病原菌菌碟，以不加上清液的为对
照，28℃黑暗培养 3～4d 测量菌丝直径。
1.7 测量计算方法 用十字交叉法测量菌丝直径 m1、
m2，然后按以下公式计算抑菌率：
菌落半径 m=（m1+m2）/4；
抑菌率（%）=（对照半径-处理半径）/对照半径×100
2 结果与分析
2.1 内生菌分离结果 经分离观察发现，植株根部、茎部
和叶片都发现有内生真菌，但不同部位内生真菌的数量
不同，从表 1 可知：根部比茎部的数量要多，叶片最多。
表 1 同部位内生真菌分离结果
分离部位
根部
枝
叶片
菌株数量
5
3
8
菌株编号
G-1、G-2、G-3、G-4、G-5
Z-1、Z-2、Z-3
Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-7、Y-8
2.2 筛选结果 用平板对峙法，测定了内生真菌各菌株
对病原真菌的拮抗作用。由表 2 可知：G-1、G-4 对 9 种
病原菌均有不同程度的抑制作用。其中 G-4 对番茄灰
霉和苹果腐烂病具有较明显的抑制作用，抑制率分别为
82.8%、79.5%，对茄黑纹抑制作用最强，抑制率达 89.7%，
并产生明显抑菌带；对葡萄黑痘病抑制作用较弱，抑制率
为 40.8%。G-1 对苹果腐烂病抑制率最高，达 77.0%，对
葡萄黑痘病抑制率最弱，为 38.1%。从表 2 可以看出，
G-1、G-4 对番茄灰霉和苹果腐烂病均有较强的一致作
用，对葡萄黑痘病的作用则较弱。
表 2 G-4、G-1 对 9 种病原菌对峙试验结果（cm、%）
处理
ck
G-4
抑制率
G-1
抑制率
番茄枯萎病
3.7
1.70
54.1
1.87
49.5
葡萄灰霉病
3.6
1.00
72.2
1.30
63.9
番茄灰霉病
3.6
0.62
82.8
1.80
50.0
茄黑纹病
3.0
0.31
89.7
0.84
72.0
枣炭疽病
3.9
1.43
63.3
1.34
65.6
苹果腐烂病
3.7
0.77
79.5
0.85
77.0
葡萄黑痘病
2.6
1.54
40.8
1.61
38.1
苹果轮纹病
2.4
0.85
64.6
0.95
60.4
梨黑心病
2.8
1.23
56.1
1.41
49.6
2.3 发酵抑菌试验结果 从发酵试验结果看，G-4 和
G-1 对几种病原菌基本上都有较明显的抑制作用。相对
而言 G-4 的抑制效果更好一点，其中 G-4 对番茄枯纹
病菌、番茄灰霉病菌、早炭疽病菌、葡萄黑豆病菌、梨黑心
病菌的抑制效果更好点，都在 40%以上；G-1 对葡萄灰霉
病菌、葡萄黑豆病菌、苹果螺纹病菌的抑制效果更好点，
都在 40%以上；G-4 和 G-1 对苹果腐烂病菌的抑制效果
最差，都在 20%左右。
表 3 酵抑菌试验试验结果
处理
G-4
G-1
对照
番茄枯纹病
菌落
半径
（cm）
1.05
1.2
1.9
抑制率
（%）
44.74
36.84
葡萄灰霉病
菌落
半径
（cm）
1.7
1.55
2.8
抑制率
（%）
39.29
44.64
番茄灰霉病
菌落
半径
（cm）
1.0
1.15
1.83
抑制率
（%）
45.36
37.16
茄黑纹病
菌落
半径
（cm）
1.2
1.0
1.53
抑制率
（%）
21.57
34.64
枣炭疽病
菌落
半径
（cm）
1.1
1.2
1.9
抑制率
（%）
42.11
36.84
苹果腐烂病
菌落
半径
（cm）
2.2
2.3
抑制率
（%）
21.43
17.86
葡萄黑豆病
菌落
半径
（cm）
0.7
0.8
2.8
抑制率
（%）
49.28
42.03
苹果轮纹病
菌落
半径
（cm）
0.75
0.6
1.23
抑制率
（%）
39.02
51.22
梨黑心病
菌落
半径
（cm）
0.8
0.9
抑制率
（%）
42.03
34.78
44
21卷21期
3 讨论
G-4 菌种可能有某种抑制作用，但希望不大，如果发
酵液亦无抑制效果，将放弃该菌；G-1 菌种的价值较高，但
其孢子体较多，易从菌丝上脱落，接菌时容易同菌株污染。
在筛选时，为了防止漏筛，需要选择合适的供试微生
物，选择供试菌要考虑：（1）是否具有代表性；（2）是否具
有科研价值与经济价值；（3）宿主植物是否对其有明显的
抑制活性；（4）是否为宿主植物的病原菌等。前 2 种因素
可以有效降低漏筛风险，后 2 种因素是基于植物内生真
菌与其宿主植物的次生代谢存在相似性以及植物内生真
菌可以提高宿主植物抗病性的原理。
目前，内生真菌研究的基本步骤为：植物组织的表面
消毒，在营养培养基上培养植物组织，内生真菌的分离和
纯化，根据经典形态学方法鉴定菌种。在内生真菌研究
过程中，存在以下 2 个方面的问题：（1）即使用不同的营
养培养基来培养植物组织，也不能保证所有生活在植物
组织内的真菌全部被分离出来，可能有的内生真菌不能
在人工培养基上生长。另外，虽然在分离营养培养基中
加入一些抑制真菌疯长的化学物质，但还是有一些生长
缓慢的真菌常被生长快的菌所覆盖，同样不能分离到这
类生长缓慢的真菌；（2）有的菌株在人工培养基上不产生
有性孢子或无性孢子，这些不产孢菌株是无法用经典形
态学方法进行鉴定，为了克服现行研究方法带来的缺陷，
就需要应用分子生物学方法来弥补研究方法的不足。
参考文献
［1］郭良栋.内生真菌研究进展［J］.菌物系统，2001，20（1）：148.
［2］谷苏，邵华，蒋晓华，等.药用植物内生真菌多样性及其活性成分
的潜在应用价值［J］.中国药学杂志，2001，36（1）：14.
［3］曾松荣，徐成东，王海坤，等.药用植物内生真菌及其具宿主相同
活性成分的机制初探［J］.中草药，2000，31（4）：306.
［4］Aaevedo J L，MacchemniJ r，W Peceirn J，et al.Endophytic ism
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3（1）：40.
［5］邹文欣，谭仁祥.植物内生菌研究新进展［J］.植物学报，2001，43
（9）：881. （责编：张宏民）
（上接 29 页）
2 休宁传统农耕蔬菜产业发展的思路
2.1 要保护宣传好 要加大生态环境的保护与宣传，把
生态资源作为最大的优势来保护，牢固树立“青山、绿山
就是金山、银山”的理念。同时积极宣传传统农耕蔬菜文
化，在保存较好的传统的蔬菜生产基地，在高山辣椒成熟
采收期间举办传统农耕蔬菜文化节，开展用竹筒腌辣椒、
用石磨手工磨制辣酱等体验活动，向旅客展现原始的传
统农耕蔬菜文化，让旅客体验农耕的乐趣，体验劳动生活
的乐趣。
2.2 要传承利用好 要将传统的农耕蔬菜文化传承利用
好，就要把传统的、原始的、原生态蔬菜生产工艺和流程
传承保存好，要严格规范生产流程。采用原始的农业防
治和物理防治措施，调整好改善作物的生产环境，以增加
作物对病、虫、草害的抵抗力，创造不利于病源物、害虫和
杂草生产发育或传播的条件，以控制、避免或减轻病、虫、
草的危害，不使用农药同样达到病虫害防治的效果；利用
山区夏季气候温润，昼夜温差大，按照自然规律，进行辣
椒等蔬菜的生产种植，不使用农地膜覆盖，蔬菜产量同样
可以得到保证；在肥料上一律采用腐熟的农家肥和草木
灰，不使用化学肥料，在生产过程中，严格控制农药、化
肥、农膜等投入品的使用，严格控制污染源的危害，同时
大大提高了蔬菜产品的品质。
2.3 要发展建设好
2.3.1 抓传统生态基地建设 根据各地地理条件、交通
条件、气候特点以及种植基础，因地制宜，合理布局，适度
发展的要求，用 3～5a 时间分别在有一定种植基础的流
口、溪口、蓝田等乡镇发展生态高山辣椒面积 67hm2以
上，在高山山洼、茶园间隙、高塝田等地连片开发，适度规
模发展，力争通过 5a 的时间全县发展生态高山蔬菜基地
面积 333hm2以上，预计鲜辣椒可产 500 万 kg 以上，可产
带来经济效益 3 000 万元以上。
2.3.2 抓产品品牌的塑造 按照现代生态农业发展要
求，打造传统农耕蔬菜区域公共品牌和企业知名品牌，以
品牌赢得市场，以市场引领消费，以消费倒逼流通、倒逼
加工、倒逼生产、倒逼产地；引导新型经营主体，建立基
地，注册商标，维护好农产品品牌价值，提升品牌社会公
信力。
2.3.3 抓新型经营主体的培育 按照当今建设现代生态
农业产业化发展思路，要着力培育家庭农场、合作社、种
植大户这种新型经营主体 5～10 户，通过这种新型经营
组织有序开展传统农耕蔬菜的生产开发、创新产品包装、
研发产品的深加工，提高产品附加值，同时进行产品品牌
的商标注册，通过互联网现代销售手段，将生产开发的生
态、安全、健康、优质农产品打向市场。2014 年，坐落在
我县海宁村的“安徽省轩辕农业发展有限公司”，在积极
探索发展传统农耕文化，也模式出一套生产、加工、销售
的现代生态农业产业化发展之路。产品主要是开发、生
产、加工豆酱系列，选用当地生产的高山辣椒、当地生产
的六月豆、当地生产的土生姜等为原料，采用原始的手工
制作法、原始的制作流程，在梅季制作黄豆脯、在伏天晒
酱 3 个月，秋冬季加工产品，注册上“程德馨”品牌商标，
通过电子商务销售采用互联网+这种现代的销售手段，目
前全年开发加工销售纯黄豆酱、怪味黄豆酱、辣津津等 5
种豆酱 10 万 kg，全年豆酱销售额可达 600 万元。
（责编：吴祚云）
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