全 文 ：白簕总黄酮、多糖的体外抑菌作用研究
王　艳，石瑛翘，潘育方＊
（广东药学院，广东 中山５２８４５８）
摘　要：目的：研究白簕总黄酮提取液醇洗脱、水洗脱部分和多糖提取部分对常见菌种的抑菌活性。方
法：通过白簕的总黄酮提取液醇洗脱部分与水洗脱部分、多糖提取物对枯草杆菌、痢疾杆菌等５种常见
临床细菌进行纸片扩散法实验、试管稀释法实验，研究药物不同成分的抑菌作用。结果：白簕总黄酮提
取液醇洗脱部分对枯草杆菌、伤寒杆菌的最低抑菌浓度为０．１３１　３ｍｇ／ｍＬ，对痢疾杆菌、大肠杆菌、金葡
萄球菌的最低抑菌浓度为０．２６２　５ｍｇ／ｍＬ；白簕总黄酮水洗脱部分对伤寒杆菌、金葡萄球菌、痢疾杆菌、
大肠杆菌、枯草杆菌的最低抑菌浓度均为０．２９６　０ｍｇ／ｍＬ。白簕多糖的体外抗菌实验结果出现杂菌，未
能探究出结果。结论：白簕总黄酮提取液醇洗脱部分抑菌作用强于水洗脱部分，多糖无明显抗菌作用。
关键词：白簕；总黄酮；多糖；体外抑菌；最低抑菌浓度
中图分类号：Ｒ２８５．５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７３－２１９７（２０１５）１１－００３７－０３
ＤＯＩ：１０．１１９５４／ｙｔｃｔｙｙ．２０１５１１０１５
收稿日期：２０１５－０１－０６
作者简介：王艳（１９８１－），女，广东药学院实验师，研究方向为生物活性物质。
通讯作者：潘育方（１９６６－），男，广东药学院教授，研究方向为天然植物生物活性。Ｅ－ｍａｉｌ：２７９８６４３３５＠ｑｑ．ｃｏｍ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｅｓｔ　ａｂｏｕｔ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
ｆｒｏｍＡｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ　Ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓ
Ｗａｎｇ　Ｙａｎ，Ｓｈｉ　Ｙｉｎｇｑｉａｏ，Ｐａｎ　Ｙｕｆａｎｇ＊
（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ　５２８４５８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ａｎｄ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ　Ｔｒｉｆｏｌｉａ－
ｔｕｓ，ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｅｌｕｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｌｃｏｈｏｌ，ｗａｔｅｒ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｏｍｍｏｎ　ｓｔｒａｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｉｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｕｓｅｄ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｌ－
ｃｏｈｏｌ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｐａｒｔｓ，ｗａｔｅｒ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ　Ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｔｏ　ｃｏｎｄｕｃｔ　ｄｉｓｃ　ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｅｓｔ
ｔｕｂｅ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａ，ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ
Ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ａｎｄ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（ｍｉｃ）ｗａｓ
０．１３１　３ｍｇ／ｍＬ，ｂｕｔ　０．２６２　５ｍｇ／ｍＬ　ｆｏｒ　Ｓｈ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ），Ｓ．ａｕｒｅｕｓ；Ｗａｔｅｒ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｐａｒｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａ－
ｖｏｎｏｉｄｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（ｍｉｃ）ｗｅｒｅ　０．２９６　０ｍｇ／ｍＬ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｌｕｔｉｏｎ，ｗａｔｅｒ　ｅｌｕ－
ｔｉｏｎ　ｐａｒｔ　ｏｆ　Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ　Ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓ　ｈａｄ　ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ　ａｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ａ　ｖａｒｉｅｔｙ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｃｌｉｎｉｃａｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ　Ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓ；Ｔｏｔａｌ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｅｓｔ；Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
　　白簕（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ　Ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓ）又称鹅掌簕、三叶五
加、三加皮、苦刺，为五加科攀援状灌木。白簕味苦，性辛、
凉，气微香，具有疏风、消肿、止痒等功效，此外还具有多种
食疗功效［１］。白霸嫩叶枝梢中含有丰富的氨基酸和人体必
需的矿物质元素，氨基酸总含量达２０．８％，其中谷氨酸含量
最高，具有健脑和增强脑细胞呼吸作用的功能。白簕中含
有黄酮、皂苷、香豆素、多糖、强心苷等药用成分，薄层色谱
结果显示白簕总黄酮中含芦丁、金丝桃苷等黄酮醇单体。
白簕作为蔬菜和药材有着悠久历史，其体外抑菌作用集中
在对白簕黄酮的研究［２－４］。近年来，越来越多的多糖被发现
有抑菌活性。本试验采用琼脂扩散法定性研究中药白簕总
黄酮两种洗脱物和粗多糖对临床常用菌种抑菌活性的强
弱；采用连续稀释法定量它们的抑菌浓度（ＭＩＣ）、最低杀菌
浓度（ＭＢＣ）；评价白簕的药用价值，为深入开发利用白簕提
供一定的理论依据。
１　材料与方法
１．１　仪器与药品
ＵＶ－１８００紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限
公司）；ＨＰＤ－６００（极性）大孔树脂（沧州宝恩吸附材料科技
有限公司）；ＡＢ－８（弱极性）大孔树脂（沧州宝恩吸附材料科
—７３—
技有限公司）；ＬＤＺＸ－５０ＦＡＳ型立式压力蒸汽灭菌器（上海
申安医疗器械厂）；ＺＨＪＨ－Ｃ１２０９Ｃ型超净工作台（上海智诚
分析仪器制造有限公司）；白簕叶、白簕茎（广东省恩平市大
人山簕菜茶）均经广东药学院中药学院中药资源系刘基柱
副教授鉴定为五加属，标本保存于广东药学院中药学院标
本室；木瓜蛋白酶（上海蓝季科技发展有限公司）；注射用青
霉素钠（河南新乡华星药厂，国药准字 Ｈ４１０２０８１７）；注射用
硫酸链霉素（深圳华药南方制药有限公司，国药准字
Ｈ２００５４１４０）；其余均为国产分析纯。
１．２　细菌
伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草
杆菌均由广东药学院化工学院实验中心提供，经分离培养，
无污染。
１．３　白簕总黄酮的制备
经响应面优化和验证实验后，确定采用回流提取法从
白簕叶中提取黄酮。称取白簕叶粉末２ｇ，提取白簕叶总黄
酮的方法为固液比１∶４５，提取液为浓度５０％的乙醇，温度
为５０℃，采用回流法提取，共提取２次，每次提取３ｈ。提取
液经过 ＨＰＤ－６００大孔树脂洗脱提纯，装柱的大孔树脂为
６００ｍＬ，上样量为３００ｍｇ；上样后待大孔树脂吸附１２ｈ左右；
采用１滴／８ｓ的流速，先用水进行洗脱，待洗脱下的溶液为
接近无色时，分别用３０％乙醇、５０％乙醇、７０％乙醇，直至洗
脱下的溶液呈无色。分别收集、挥去部分溶剂后，记录体
积。紫外可见分光光度计测得白簕总黄酮纯化液水洗脱部
分浓度为１．１８４ｍｇ／ｍＬ，醇洗脱部分浓度为０．５２５ｍｇ／ｍＬ。
总黄酮提取物于４℃冰箱中保存。
１．４　白簕多糖的制备
采用热水浸提法，称取白簕茎粉末５００ｇ，加入４０倍水，
８０℃恒温水浴锅中浸提６ｈ，提取多糖后，去除药渣，最后旋
转蒸发器５５℃下浓缩至原来溶液体积的１／１０。酶法除蛋
白，加入２％木瓜蛋白酶，５０℃水浴４ｈ，加热到１００℃，１０ｓ灭
酶，得酶解液，置于３　５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ去蛋白。取上层
清液，按照４∶１的比例加入９５％乙醇进行醇沉，置于冰箱
４℃中过夜。第２天３　５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，合
并沉淀，于６０℃烘箱中烘干，即得到白簕粗多糖。粗多糖于
干燥器中常温保存。
１．５　抑菌实验
采用纸片扩散琼脂法：吸取有不同药液的圆滤纸片（直
径６ｍｍ，每片吸取黄酮药液５００μＬ，青霉素３３．３μＬ，链霉素
２５μＬ；根据菌种类型选择阳性对照药液）贴于 ＭＨ 琼脂平
板表面，３７℃恒温箱培养１６～１８ｈ。重复４次，培养完成后
用游标卡尺测量抑菌圈直径（精确到０．１ｍｍ），记录实验结
果。
试管稀释法：取１０支无菌小试管排于试管架上，编号，
如表１加入后，置于３７℃恒温箱内培养１６ｈ。凡澄清透明的
的管判定为无菌生长，以无菌生长的最高药物稀释度为该
药液对细菌的 ＭＩＣ。从上述无菌生长的试管中挑取培养
液，划线接种于 ＭＨ 肉汤琼脂平板上，３７℃恒温箱培养
２４ｈ。平板上无菌落说明对应管中细菌全被杀死，重复３
次，以无菌生长的最高药物稀释浓度为该药对细菌的ＭＢＣ。
试管稀释法见表１。
表１　试管稀释法
１．６　统计学方法
采用ＳＰＳＳ　１７．０统计软件进行数据处理，计量资料采用（珔ｘ
±ｓ）表示，采用配对ｔ检验。Ｐ＜０．０５表示差异有统计学意义。
２　实验结果
２．１　白簕叶不同成分纸片琼脂扩散法抑菌结果
白簕叶总黄酮醇洗脱部分对枯草杆菌的抑菌效果比水
洗脱部分强，但２种提取物都比阳性对照药液的抑菌作用
弱。白簕多糖纸片无抑菌作用。纸片扩散法结果见表２。
表２　白簕叶不同成分纸片琼脂扩散法抑菌结果 （珚ｘ±ｓ，ｃｍ）
组别
抑菌直径
金葡萄球菌 伤寒杆菌 枯草杆菌 痢疾杆菌 大肠杆菌
总黄酮醇洗脱部分 ０．６±０．００３＊ ０．６±０．０１２＊ １．９１４±０．２０６＊ ０．６±０．００３＊ ０．６±０．００５＊
总黄酮水洗脱部分 ０．６±０．００２＊ ０．６±０．００９＊ １．１４３±０．１０１＊ ０．６±０．００８＊ ０．６±０．００２＊
抗生素 １．７３７±０．０７９　 １．８０１±０．１１５　 ３．８９７±０．１４　 １．７７±０．０８８　 １．７６９±０．１１２
注：与抗生素比较，＊Ｐ＜０．０１。
２．２　白簕总黄酮醇洗脱部分试管稀释法抑菌结果
白簕叶总黄酮醇洗脱部分与白簕叶总黄酮水洗脱部分
对各种供试菌液都有不同程度的抑菌作用，并且这种抑菌
作用随着黄酮提取液浓度的升高而增强。详见表３、表４。
２．３　白簕总黄酮水和醇洗脱部分 ＭＢＣ
白簕叶总黄酮水洗脱部分对金葡萄球菌、伤寒杆菌、
枯草杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌的最低杀菌浓度均为
０．５９２ｍｇ／ｍＬ；白簕总黄酮醇洗脱部分对伤寒杆菌、痢疾
杆菌、大肠杆菌的最低杀菌浓度均为０．２６２　５ｍｇ／ｍＬ，对
枯草杆菌的最低杀菌浓度为０．１３１　３ｍｇ／ｍＬ。总黄铜醇
洗脱部分对金葡萄菌未体现出最低杀菌浓度，结果见
表５。
—８３—
表３　白簕总黄酮醇洗脱部分试管稀释法抑菌结果
菌株
稀释浓度（ｍｇ／ｍＬ）
０．２６２５　 ０．１３１３　 ０．０６５６　 ０．０３２８　 ０．０１６４　 ０．００８２　 ０．００４１　 ０．００２１
对照
阴 阳
金葡萄球菌 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
伤寒杆菌 － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
枯草杆菌 － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
痢疾杆菌 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
大肠杆菌 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
注：“＋”表示细菌生长，“－”表示细菌未生长。
表４　白簕总黄酮水洗脱部分试管稀释法抑菌结果
菌株
稀释浓度（ｍｇ／ｍＬ）
０．５９２　 ０．２９６　 ０．１４８　 ０．０７４　 ０．０３７　 ０．０１８５　 ０．００９２５　 ０．００４６２５
对照
阴 阳
金葡萄球菌 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
伤寒杆菌 － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
枯草杆菌 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
痢疾杆菌 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
大肠杆菌 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
注：“＋”表示细菌生长，“－”表示细菌未生长。
表５　白簕总黄酮水和醇洗脱部分 ＭＢＣ （ｍｇ／ｍＬ）
洗脱方式 金葡萄球菌 伤寒杆菌 枯草杆菌 痢疾杆菌 大肠杆菌
总黄酮水
洗脱部分
０．５９２　 ０．５９２　 ０．５９２　 ０．５９２　 ０．５９２
总黄酮醇
洗脱部分
－ ０．２６２５　 ０．１３１３　 ０．２６２５　 ０．２６２５
注：－表示 ＭＩＣ最高稀释浓度有细菌生长。
３　讨论
本实验应用体外抗菌试验测定白簕总黄酮醇洗脱部分
和水洗脱部分、多糖的抑菌作用强弱。该方法简便经济，是
很便捷的初步筛选方法，但抗菌试验的结果易受外界因素
影响。为了避免纸片琼脂扩散法抑菌物浓度不同对扩散的
影响和比浊法受中药颜色的影响等因素，本实验采用纸片
琼脂扩散法和试管稀释法同时进行抑菌实验研究［５－６］。纸片
法通过不断将药物水分挥发，增大纸片载药量，实验结果最
终有抑菌圈出现，但与试管稀释法对比，其结果有出入，原
因为纸片载药量达到饱和，载药量达不到设计的载药量［７］。
本抑菌实验误差来源主要有：①方法误差，选用纸片法在试
验过程上受纸片的质量、纸片含药的准确性和均匀性影响
较大，这是导致实验数据出现误差的最重要因素；②比浊法
容易受药物颜色的影响，导致实验数据出现误差。
本实验在对白簕多糖进行抑菌研究过程中发现，白簕
多糖样品含有杂菌。本研究严格按照微生物实验操作规
定，经过４次重复实验，此现象仍旧存在。将白簕多糖进行
试管稀释法实验后，肉眼观察均发现每组试管都呈混浊状
态，将每组前３支试管分别在固体培养基上划线进行分离
培养，结果通过肉眼可直接发现固体培养基上均长满细菌，
且可明确看到所长的菌非原来所培养的细菌种类。将白簕
多糖样品单独滴于在平板固体培养基上，经２４ｈ培养后，培
养基上生长出细菌，证明样品本身含有细菌。白簕多糖出
现此结果可以排除体外抗菌实验的操作问题。根据实验探
究结果和近代多糖研究方法进展［１２］，白簕多糖体外抑菌实
验出现此结果的因素可能有以下４点：①在提取白簕的过
程中，白簕多糖受到外界细菌的污染，且提取温度只有
８０℃，未达到１００℃，不能满足灭菌规定的温度；酶法除蛋白
过程中温度虽达１００℃，时间却只有１０ｓ，不足以将细菌杀
灭，导致在体外抗菌实验中出现杂菌；②药材自身存在细
菌；③滤纸片法采用倒置培养，培养基表面的水分能满足细
菌的生长，而多糖作为大分子扩散所需水分多，培养基表面
的水分不能让多糖扩散，使其留在纸片上，不能对微生物生
长产生作用；④琼脂培养基可能对多糖分子有一定的吸附
作用，多糖不能摆脱而扩散不好。所以，白簕多糖的体外抗
菌实验仍旧需要进行探究。
由纸片扩散法和试管稀释法实验结果可知，白簕总黄
酮的醇洗脱物与水洗脱物皆对实验的５种细菌有抑菌活
性，但皆远弱于抗生素的抑菌活性。是否用大剂量的药材
就能发挥相应的效果呢？因没有继续研究随着浓度的增
大，其抑菌能力的强弱变化，这需要今后进一步深入研究。
本实验结果尚不能完全代表白簕总黄酮对其他致病菌有抑
制作用，因此白簕总黄酮对其他致病菌有无抑制作用有待
于进一步研究。
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（责任编辑：宋勇刚）
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