全 文 ：半边莲生物碱粗提物对骨髓瘤细胞 U266的影响
何　珊1 ,吴国欣＊(福建师范大学生命科学学院 福州 350108)
摘要:目的　探讨半边莲生物碱对骨髓瘤细胞 U266体外增殖的影响。方法　采用溶剂萃取对半边莲中的总生物碱进行了粗提取和纯化;采
用细胞排染法 、MT T 比色法研究半边莲生物碱对 U266细胞的体外增殖的影响;采用 DNA凝胶电泳检测半边莲生物碱对细胞凋亡的影响。结
果　台盼蓝染色法和 MT T 结果表明半边莲生物碱对 U266细胞有明显的抑制作用 ,且呈现浓度依赖效应;DNA 凝胶电泳结果出现明显的梯形
条带。结论　半边莲生物碱能抑制骨髓瘤细胞 U266的体外增殖 ,其作用机制可能是通过促进细胞发生凋亡。
关键词:半边莲;生物碱;骨髓瘤细胞;抑制作用
中图分类号:R282.71　文献标识码:A　文章编号:1006-3765(2012)-09-0237-03
作者简介:何　珊 ,女(1987.8-)。福建师范大学生命科学学院, 硕
士在读。联系电话:18259066946 , E-mail:heshan198733@163.com
＊通讯作者:联系电话:0591-83431462 , E-mail:gxw u@fjnu.edu.cn
基金项目:福建省科技厅科技项目基金(No.2010J01142)
Extract of alkaloids from Lobelia chinensis Lour and their inhibitory
effects on growth of Myeloma Cells U266
HE Shan ,WUGuo-xin＊(College of life sciences ,Fujian Normal University ,Fuzhou 350108 ,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To investigate the effects of alkaloids f rom Lobelia chinensis Lour on the g row th of
M yeloma cells U266.METHODS　Rough alkaloids w ere ex tracted from Lobelia chinensis Lour by solvent ex t rac-
tion;their inhibitory ef fects on the grow th of four different kinds leukemia cells w ere tested by M TT and Trypan
blue staining;the influence of U266 cells′apoptosis w as detected by DNA agarose gel electropho resis RESULTS　
The alkaloids of Lobelia chinensis Lour had the inhibitory effects on the g row th of all kinds of leukemia cells , and
the inhibition agg ravated wi th the increase of alkaloids concentration;and DNA gel elect rophoresis results showed
obvious ladder.CONCLUSION　The alkaloids of Lobelia chinensis Lour had the inhibitory effects on the g row th
of U266 cells , and w ould be provided with favorable exploitation perspective.
KEY WORDS:Lobelia chinensis Lour;Alkaloids;Myeloma cells;Inhibitory effects
　　半边莲(Lobelia chinensis Lour), 又名急解索 、细米草 、蛇
舌草等 ,属桔梗科半边莲属植物(见图 1), 始载于《滇南本
草》 , 后李时珍在《本草纲目》中亦有记载 ,可以全草入药。性
辛 、平 ,归心 、小肠 、肺经。其主要生物碱成分有山梗菜碱 、山
梗菜酮碱 、山梗菜醇碱 、异山梗菜酮碱等〔3〕 , 具有清热解毒 、利
水消肿 、活血化疲之功效 , 临床上常用以治疗晚期血吸虫腹
水 、肝炎和肾炎水肿 、毒蛇咬伤 、肝硬化腹水及动脉粥样硬化
等〔4 ～ 6〕。近来也有医学研究表明半边莲生物碱还具有抗癌作
用。迄今为止 , 报道出来的已用于半边莲生物碱抗肿瘤药理
研究的癌细胞有宫颈癌〔7〕、肝癌〔8〕、肺癌 、胃癌〔9〕等 , 但是关
于其对于骨髓瘤细胞 U266的影响尚未见报道。本实验采用
台盼蓝染色 、MT T 比色法及 DNA凝胶电泳 ,探讨了半边莲生
物碱对 U266 细胞体外增殖的影响 , 为临床上用半边莲生物
碱治疗骨髓瘤提供了基础实验数据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　细胞株:骨髓瘤细胞 U266 来自于福建医科大学附属
协和医院血液科。
图 1　半边莲形态图
1.1.2　试剂和器材:①实验仪器:电子天平(d=0.01g , YB ,
上海力能电子仪器公司),真空旋转蒸发仪(GKC , 上海亚荣生
化仪器公司),二氧化碳培养箱(HF90 型 , 香港 Hdal Force De-
velopment , L td 有限公司), 高速台式离心机(TGL-16M , 上海
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Strait Pharmaceutical Journal Vol 24 No.9 2012
安亭科学仪器厂), 超净工作台(SW-CJ-1CU , 苏州净化设备有
限公司),全自动酶标仪(Synergy HT 型 , 美国 Biotek 有限公
司),电热恒温水浴锅(DK-8D 型 , 上海跃进医疗器械厂), 电
泳仪(DYY-BC 北京六一仪器厂), 成像系统(美国 syngene公
司), 移液枪等②实验药品:半边莲(购于福建省福州市), RP-
MI1640 培养基(赛默飞世界生物化学制品有限公司 , 批号
NWL0504), 胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),
DMSO(二甲基亚砜)(sig am 分装 , 上海生工生物工程有限公
司), 台盼蓝(上海科兴科技有限公司), 四甲基偶氮唑盐
(MTT)(加拿大 BIO BASIC INC 有限公司), UNIQ-10 柱式
动物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司),
三氯甲烷 、乙醇 、乙醚 、氨水均为国产分析纯。
1.2　半边莲生物碱的制备　称取半边莲干燥全草 , 粉碎机粉
碎 ,药粉置圆底烧瓶中 , 按 1∶8 的固液比加入 90%乙醇置于
75℃恒温水浴锅中浸提 1h(重复 3 次),过滤后合并滤液 , 置
于旋转蒸发仪中回收乙醇得膏状物质 ,用 3%盐酸溶解 , 过滤
除掉不溶于酸水的杂质 , 滤液置于于分液漏斗中用乙醚脱色
(重复 3 次), 下层水溶液用氨水调 pH 至 10 ～ 11 ,用氯仿对水
溶液进行萃取(重复 3 次), 合并氯仿液并置于旋转蒸发仪中
回收氯仿 ,自然干燥 , 得半边莲总生物碱。 用 DMSO 将生物
碱溶解 , 再用无血清培养液稀释配制成浓度为 1mg·mL-1的
母液 ,过滤除菌 , 于 4℃保存备用〔9〕。
1.3　半边莲生物碱对 U266 细胞体外增殖的影响
1.3.1　细胞排染实验:取长至对数期细胞 , 于 1000rpm 离心
5min ,去掉旧培养液 , 用新鲜的 1640 培养基重悬制成单细胞
悬液 , 用细胞计数板对细胞进行计数 , 以 1.0×105 个/ mL 的
浓度接种于 96 孔板中 , 每孔 160μL 的细胞悬液。实验设:对
照组;给药组 ,浓度分别为 200μg·mL-1 、100μg·mL-1、50μg·
m L-1、25μg·mL -1、12.5μg·mL-1。 细胞悬液培养 24h 后 , 每
孔给药 40μL ,对照组细胞中则加入 40μL 的无血清培养液。
每组设四个平行 , 药物处理培养 48h。处理结束后取 100μL
细胞悬液加等量的 0.4%台盼蓝染液混合后滴入血球计数板
计数 ,计数未染色细胞数并计算细胞存活率和抑制率。
细胞存活率=〔未染色细胞数/总细胞数〕×100%
细胞抑制率=〔(对照组活细胞数-实验组活细胞数)/对
照组活细胞数〕×100%
1.3.2　MTT 实验:取长至对数期细胞 , 于 1000rpm 离心
5min ,去掉旧培养液 , 用新鲜的 1640 培养基重悬制成单细胞
悬液 , 用细胞计数板对细胞进行计数 , 以 1.0×104 个/ mL 的
浓度接种于 96 孔板中 , 每孔 160μL 的细胞悬液。实验设:对
照组;给药组 ,浓度分别为 200μg·mL-1 、100μg·mL-1、50μg·
m L-1、25μg·mL-1 、12.5μg·mL -1 , 细胞悬液培养 24h 后 , 每
孔给药 40μL ,对照组细胞中则加入 40μL 的无血清培养液。
每组设四个平行 , 药物处理培养 48h。药物处理培养终止之
前 4h 时 , 向 96 孔板中每孔细胞培养液中加入 20μL的 MTT
溶液(5mg·mL -1), 于 37℃培养箱中孵育 4h , 结束后将 96 孔
板置于孔板离心机上离心 5min , 弃去上清 , 每孔加入 150μL
的 DMSO , 轻轻震荡以便充分溶解孔底的结晶。 于酶标仪上
检测 490nm 处的吸光值。重复 3 次。按以下公式计算抑制
率:抑制率=1 -(OD实验组 -OD空白组/OD对照组-OD空白组)×
100%
1.3.4　半边莲生物碱对 U266细胞生长的抑制:重复上述步
骤 , 同时接种三块 96孔板 , 分别药物处理培养 24h 、48h 、72h ,
并计算不同作用时间下对应的抑制率。
1.3.5　统计学处理:实验数据均以(x±s)表示 , 采用 SPSS
13.0统计分析软件处理 ,进行方差分析比较组间差异性。
1.4　琼脂糖凝胶电泳　取处于对数生长期的细胞制成1.0×
107 个/ mL 细胞悬液 , 接种于 6 孔板中 , 每孔 1mL , 于二氧化
碳培养箱中培养 24h。培养之后 , 于超净工作台中每孔给药
并使得药物终浓度为 200μg·m L-1、100μg·mL-1 、50μg·
mL -1、25μg·mL-1 、12.5μg·m L-1 , 对照组则加等量的无血清
培养液 , 加药物处理培养 48h。 1000rpm 下离心 5min 收集对
照组和各药物处理组的细胞 , 按照 DNA 抽提步骤提取各组
细胞的 DNA。取提取出的 DNA 溶液 5μL 上样于 0.5%琼脂
糖凝胶上 , 45V 电压下电泳 0.5h , 结束电泳后取出胶带置于
凝胶电泳处理系统成像 。
2　结果
2.1　细胞排染法检测不同药物浓度半边莲生物碱对 U266
细胞的影响　通过台盼蓝染色 ,即可观察到高浓度药物组中
多数细胞被染成蓝色 , 而低剂量组则只有部分细胞能够被染
成蓝色 , 对照组则大部分细胞能够拒染。血球计数板计数结
果如表 1 所示 , 对照组中活细胞率达到 98%以上 , 药物浓度
为 50μg·mL-1 、100μg·mL-1 、200μg·mL-1时 , 活细胞率分别
为 54.09%、39.52%和 17.77%, 与对照组比存在极显著差
异;计算抑制率发现 , 抑制率随着药物浓度的加大而逐渐增
大 , 半边莲生物碱浓度为 100μg·mL-1 、200μg·mL-1时抑制率
分别达到了 66.49%和 82.81%,说明药物对 U266 的增殖有
抑制作用 , 且存在剂量依赖性。
2.2　M TT 实验　MTT 结果表明半边莲生物碱在体外对
U266 细胞具有明显的抑制作用。半边莲生物碱作用 48h 后 ,
200μg·mL-1和 100μg·mL-1剂量组抑制率分别达到 89.97%
与 69.42%, 50μg·mL-1剂量组的抑制也达到了 39.93%。
25μg·mL -1和 12.5μg·mL-1 剂量组的抑制率也分别为
27.61%与 9%, 计算其 IC50为 54.51μg·m L-1。
图 1　半边莲生物碱对 U266细胞生长的影响
2.3　半边莲生物碱对 U266 细胞生长的抑制　半边莲生物
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海峡药学　2012年　第 24卷 第 9期
碱浓度在 12.5μg·mL-1～ 200μg·mL-1时 ,各浓度半边莲生物
碱对 U266肿瘤细胞的抑制率(72h)>抑制率(48h)>抑制率
(24h),对 U266 细胞抑制作用随着作用时间的延长而逐渐加
强;在同一作用时间下 , 半边莲生物碱对 U266 的抑制率都随
着浓度的增大而逐渐增大(见图 1)。
表 1　不同药物浓度半边莲生物碱对 U266细胞活性的影响　(x±s ,
n=3)
半边莲生物碱浓度
/(μg·mL-1) 活细胞率/ % 抑制率/%
200 17.77±1.09＊＊ 82.81
100 39.52±1.19＊＊ 66.49
50 54.09±2.19＊＊ 49.79
25 86.08±3.87＊＊ 26.73
12.5 94.68±1.94 15.52
对照组 98.28±0.60 -
与对照组比较:＊＊P<0.01
表 2　MT T 法检测不同浓度半边莲生物碱对 U266细胞的影响　(x
±s , n=3)
半边莲生物碱浓度
/(μg·mL-1) 抑制率/ % IC50值/(μg·mL -1)
12.5 9±1.829＊＊
25 27.61±3.822＊＊
50 39.93±3.043＊＊ 54.51
100 60.42±2.319＊＊
200 89.97±0.793＊＊
Control --
与对照组比较:＊＊P <0.01
2.4　DNA 琼脂糖凝胶电泳结果　空白对照组的细胞 DNA
表现为靠近加样空的完整的基因组 DNA , 而与对照组想比较
个给药组的细胞的 DNA 均出现不同程度的降解 , 可见有不
同程度的梯状条带(见图 2)。
图 2　DNA琼脂糖凝胶电泳图
1.Marker 2.对照组 3.12.5μg·mL -1组 4.25μg·mL -1组 5.50μg
·mL -1组 6.100μg·mL-1组 7.200μg·mL -1组
3　讨论
多发性骨髓瘤是一种多发生于老年人的恶性浆细胞肿
瘤〔10〕 , 特征是体内的单克隆浆细胞出现恶性增殖并分泌大量
异常的单克隆免疫球蛋白 , 主要是通过侵染人体的骨髓或者
侵染髓外组织 , 从而引起广泛的骨质破坏 、反复感染 、贫血 、高
钙血症 、高粘滞血症及肾功能不全等等一系列的临床表
现〔11〕。目前 , 随着社会人口的老龄化增多 , MM 发病率呈逐
渐增高趋势。最近几十年来对 MM 的治疗一直是采用激素
和细胞毒性药物联合治疗 , 虽然近年来随着医学的发展 , 在治
疗过程会加用反应停来抑制血管新生或是直接采用自体骨髓
移植治疗 , 但仍然很难治愈〔10〕 , 而且细胞毒性药物对自身细
胞也具有一定的毒副作用 , 也会对身体造成很大的损害。现
今有研究表明某些中草药提取物具有抗肿瘤作用 , 同时与传
统单药化疗进行联合化疗还能减轻化疗的毒副作用 , 从而减
轻对身体的损害〔12〕 ,因此研究开发出高效低毒的植物药作为
联合化疗的辅助药物显示出了较强的潜在临床应用价值。
本实验通过细胞排染和 MTT 实验评价了中草药半边莲
的生物碱粗提物对骨髓瘤细胞增殖抑制的效果 , 从实验结果
可知 , 半边莲生物碱对 U266 具有明显的抑制作用 , 且呈现药
物浓度-时间依赖效应。 DNA凝胶电泳结果表明在药物作用
下 , 细胞的 DNA 广泛断裂 , 形成大小不一的 DNA片段 , 在琼
脂糖凝胶上呈现明显的梯形条带 , 由此可以初步推测半边莲
生物碱对 U266 细胞的抑制作用可能是通过促进细胞凋亡来
实现的。但是对于其促进细胞凋亡的作用机制还不明确 , 有
待进一步的深入研究。
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