全 文 :川续断皂苷 Ⅵ溶出量与其绝对含量无显著性差异 ,
即在该条件下超微粉和细粉中川续断皂苷 Ⅵ均能充
分溶出 。但超微粉溶出速率常数 T0.9仅为 0.23
min,而细粉 T0.9为 10.41 min,有显著性差异(P﹤
0.05),说明续断超微粉可显著增大川续断皂苷 Ⅵ
的溶出速度 。其原因可能是超微粉碎过程击碎川续
断细胞壁 ,药材比表面积增大 ,导致其溶出速率增
大 。实验结果显示 ,超微粉饮片具有 “速释 ”的特
点 ,如果想要药物迅速发挥药效 ,则应采用 “超微粉
饮片 ”;如果想让药物缓慢发挥药效 ,则应采用 “普
通饮片”。但是 ,药物的粒径和溶出速率之间的相
关性 ,尚需要深入进行研究。超微粉碎过程会使某
些活性成分提高溶出速率 ,是否也会让某些具有毒
性作用的化学成份提高溶出速率也需要深入进行研
究。
表 2 川续断超微粉和细粉中川续断皂苷Ⅵ 体外溶出拟合函数
Table2 ThefittingfunctionofvitrodissolutionofasperosaponinⅥ intheultra-micropowderand
thefinepowderofRadixDipsaci
数学模型 川续断超微粉 r 川续断细粉 r
零级动力学函数 F=0.001 2t+0.953 3 0.400 7 F=0.006 5t+0.783 1 0.679 8
Higuchi分布 F=0.011 3t1/2 +0.934 1 0.517 5 F=0.057 1t1/2 +0.692 3 0.807 0
威布尔分布 Lnln(1 /(1-F))=
0.151 3lnt+1.044 6 0.743 0
Lnln(1 /(1-F))
=0.393 3lnt+0.098 7 0.951 7
对数正态函数 F=0.049 2logt+0.929 5 0.667 3 F=0.221 0logt+0.688 4 0.927 5
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大叶白麻叶多糖提取及组分分析
史俊友 1, 2 , 索有瑞 1 , 李国梁 1, 2 , 孙志伟1, 2 , 刘永军1*
(1.中国科学院西北高原生物研究所 ,青海 西宁 810001;2中国科学院研究生院 ,北京 100039)
收稿日期:2009-06-14
基金项目:中国科学院百人计划项目资助(0729011211)
作者简介:史俊友(1981-),男 ,博士研究生 ,主要从事天然产物化学研究。 Tel:(0971)6143857。 E-mail:shijunyou123@ 126.com
*通讯作者:刘永军(1964-),男 ,研究员 ,博士生导师 ,主要从事天然产物化学研究。 Tel:(0971)6143857 E-mail:yongjunliu123@ 163.
com
关键词:大叶白麻;多糖;单糖;蒽酮-硫酸法;毛细管电泳
摘要:目的:从大叶白麻中提取多糖 ,测定多糖含量并分析其单糖组成。方法:采用热水法提取大叶白麻叶多糖 , 乙醇沉
淀 , Sevage法脱蛋白 ,活性碳脱色 , 采用蒽酮-硫酸比色法 620 nm处测定多糖含量 , 高效毛细管电泳分析其单糖组分。
结果:经蒽酮-硫酸比色法测定大叶白麻叶中多糖含量为叶重的 0.97%;经高效毛细管电泳分析发现 ,大叶白麻含至少有
9种单糖 ,其中含量较多的为半乳糖 、阿拉伯糖 、甘露糖。结论:本法分离大叶白麻叶多糖在 HPCE上易实现 9个单糖基
线分离具有灵敏度高的特点。单糖种类丰富 ,具有较高的研究和开发价值。
中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1001-1528(2010)01-0102-05
ExtractionofpolysaccharidefromPoacynumHendersonileavesandcomponent
analysis
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SHIJun-you1, 2 , SUOYou-rui1 , LIGuo-liang1, 2 , SUNZhi-wei1, 2 , LIUYong-jun1*
(1.NorthwestInstituteofPlateauBiology, ChineseAcademyofSciences, Xining810001 , China;2.GraduateSchooloftheChineseAcademyofSciences,
Beijing, 100039 , China)
KEYWORDS:Poacynumhendersoni;polysaccharide;monosaccharide;anthrone-H2SO4 colorimetry;HPCE
ABSTRACT:AIM:ToextractandisolatepolysaccharidefromPoacynumHendersonileaves, determineitscon-
tentandanalyzethemonosaccharidecomposition.METHODS:PoacynumHendersonileaveswasextractedwith
hotwater, crudepolysaccharidewasprecipitatedwithethanol, deproteinatedaccordingtoSevagemethod, coloured
withacticarbon.Thenofpolysaccharidecontentsweremeasuredbyanthrone-H2SO4 colorimetryatthewavelengthof
620nm.ThemonosaccharidecompositionwasdeterminedbyHPCE.RESULTS:Thepolysaccharidecontentwas
0.97% ofleafweight, andGal, Ara, andMancontentswerethreehighermonosaccharides.CONCLUSION:The
methodiseasytocaryoutthebaselineresolutioninHPCEandhashighlysensitivity.
大叶白麻(Poacynumhendersoni(Hook.f)Wod-
son.),俗称大花罗布麻 ,夹竹桃科白麻属多年生草
本植物 ,是一种优质的纺织纤维材料。由于大叶白
麻具有延缓衰老 、降压 、降脂 、抗感冒 、镇静安神等功
效 [ 1 ~ 5] ,大叶白麻已被广泛应用于药用保健业 。大
叶白麻叶中的黄酮 、木脂素 、香豆素 、萜类和维生素
等成分已有研究[ 6 ~ 9] ,但对大叶白麻叶中多糖的提
取分离和相关成分的研究尚未见报道 。多糖的分析
方法主要包括化学方法 、气相色谱法(或气相色谱-
质谱法)、液相色谱法和毛细管电泳法 ,其中化学方
法只能测定含糖量且结果准确度较差 ,高效液相色
谱法具有同时分离检测多种糖 [ 10]等优点 ,但该方法
须有专门的分离柱 ,价格昂贵 ,操作较繁琐且主要利
用分离物质的紫外吸收特性进行检测 ,灵敏度较低 。
毛细管电泳(CE)作为一种新兴的分离分析技术已
在食品分析中已引起广泛关注。 CE的主要优点是
分离效率高 、速度快 ,仅需要价廉的石英毛细管 ,试
剂 、样品消耗也很小 ,因而成本低。本文首先采用硫
酸 -蒽酮法对大叶白麻的多糖含量进行了测定 ,然后
用本课题组自制的衍生试剂 1-(2-萘基)-3-甲基 -5-
吡唑啉酮(NMP)[ 11, 12]对该多糖中的单糖组分进行
了柱前衍生毛细管电泳分析 , 以期为大叶白麻多糖
的开发利用提供参考 。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
实验用大叶白麻叶于 2008年 8月中旬采摘于
青海格尔木地区;1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮
(NMP)(自制);单糖标准品:葡萄糖(Glc)、半乳糖
(Gal)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)(国
药集团化学试剂公司), 葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳
糖醛酸(GalUA)、阿拉伯糖 (Ara)(Fluka公司),
岩藻糖(Fuc)(Sigma公司);硼砂(分析纯 ,徐州试
剂二厂),其它试剂皆为分析纯。纯水由 Mili-Q超
纯水系统制备 。
1.2 主要仪器
752型紫外分光光度计(上海光谱仪器厂);HP-
3D毛细管电泳仪(美国 Agilent公司);毛细管:总长
58.5 cm,有效柱长为 50cm,内径为 50 μm(河北省
永年锐沣色谱器件有限公司);PHS-3C精密 pH计
(上海精密科学仪器有限公司)。
2 方法与结果
2.1 大叶白麻多糖提取纯化
将自然风干的大叶白麻叶粉碎 ,过 40目筛。称
取 50 g, 置于圆底烧瓶中 , 依次用石油醚(60 ~ 90
℃)、乙醚提取 4 h,挥干溶剂 , 加 80%乙醇 400 mL
回流提取 2次 , 2 h/次 , 滤纸过滤 , 滤渣置圆底烧
瓶中 ,加蒸馏水 600 mL,沸水浴回流提取 2 h,滤纸
过滤 ,再以 600mL蒸馏水重复提取一次 ,合并滤液 ,
真空浓缩 (60 ℃, 真空度 0.095MPa)至 200 mL,
Sevage法除蛋白 ,反复进行至无蛋白层 ,按固液比 1
∶5加入活性炭 40g, 80℃条件下对多糖进行脱色 ,
加入无水乙醇使乙醇浓度达到 80%,冰箱中过夜 ,
离心(6 000 r/min, 5 min),多糖沉淀依次用无水乙
醇 、丙酮 、乙醚各洗两次 , 60 ℃干燥至恒重 ,即得大
叶白麻精制多糖 ,称重备用。
2.2 大叶白麻多糖的含量测定
2.2.1 样品溶液的制备
精密称取各样品粉末(过 40目筛)1 g,分别置
于圆底烧瓶中 ,加 80%乙醇 100 mL,回流提取 1 h,
趁热过滤 ,滤渣用 80%热乙醇洗涤(8 mL×3)。滤
渣连同滤纸置于烧瓶中 ,加蒸馏水 50 mL,沸水浴提
取 1 h,趁热过滤 ,滤渣用热蒸馏水洗涤(10 mL×
3),洗液并入滤液中 ,放冷后 ,定容至 100 mL,制得
各样品溶液。
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2.2.2 标准曲线的绘制
精确称取干燥至恒重的葡萄糖标准品 24.6
mg,置于 100mL量瓶中 ,以蒸馏水定容至刻度 ,配
成 0.246 mg/mL的标准液 。分别精确吸取标准液
1、2、3、4、5mL置 10mL量瓶中 ,以蒸馏水稀释定容
得系列标准溶液 。精确吸取各标准溶液 1 mL,置 10
mL具塞试管中 ,加入 0.2%硫酸-蒽酮试液 4 mL,摇
匀 ,冰水浴 10 min,立即置于沸水浴加热 15 min,取
出用冷水冷却至室温并放置 10min,于 620nm处测
定吸光度。另精密吸取蒸馏水 1 mL,同法操作 ,作
为空白对照 。以吸收度 A为纵坐标 , 葡萄糖浓度 C
(μg/mL)为横坐标作标准曲线 , 得回归方程为:A
=0.094 8 C+0.038 2, 其中 r=0.998 7。
2.2.3 换算因子的测定[ 13]
称取干燥至恒重的大叶白麻精制多糖 22.2
mg,置于 100 mL的量瓶中 ,加入蒸馏水定容(可以
稍微加热助溶多糖), 制得大叶白麻多糖贮备液 。
按照 2.2.2项的方法测定大叶白麻多糖贮备液的吸
光度(A),由回归方程求出大叶白麻多糖贮备液中
葡萄糖浓度 ,按下式计算换算因子 f:f=W/CD,式中
W为称取多糖的重量(mg);C为精制大叶白麻多糖
贮备液中葡萄糖的浓度(mg/mL);D为多糖的稀释
因素。实验测得换算因子为 3.53。
2.2.4 精密度试验
平行取 6份葡萄糖稀释液和大叶白麻粗多糖试
液 ,蒽酮 -硫酸法显色后测定吸光度 ,计算结果表明
葡萄糖与大叶白麻多糖的 RSD分别为 1.2%和
1.7%。
2.2.5 重复性试验
取同一批样品 ,按粗多糖贮备液的制备方法平
行制备 6份 ,按上述方法进行含量测定 ,分别测定吸
光度并计算浓度 。RSD为 0.8 %,表明该方法重复
性良好 。
2.2.6 稳定性试验
精确量取 1.0 mL葡萄糖稀释液和大叶白麻粗
多糖试液 ,置于具塞试管中 ,各加入 0.2%蒽酮试剂
4.0mL,按 2.2.2项的方法操作 ,于室温自然光下放
置 2h,每 10min测定一次 。结果表明样品溶液在 2
h内显色稳定 , RSD=3.78%。
2.2.7 样品中多糖含量测定
吸取样品贮备液 1 mL,按照 2.2.2项的方法测
定吸光度(A),由回归方程计算样品液中葡萄浓度
(C),按照下式计算样品中大叶白麻多糖的含量:多
糖含量(%)=CDfW ×100%。式中 C为样品贮备液
中葡萄糖的浓度(mg/mL);D为多糖的稀释因素;f
为换算因子;W为称取样品的重量(mg)。按照此公
式计算 ,大叶白麻多糖含量为 0.97%。
2.3 单糖组成的分析
2.3.1 衍生试剂的配制:准确称量 NMP0.112 g,
用乙腈定容至 10 mL,其浓度为 0.05mol/L。
2.3.2 标准溶液的配制 [ 14]
准确称量标准品葡萄糖 、半乳糖 、甘露糖各
18.0 mg,阿拉伯糖 、木糖各 15.0 mg,鼠李糖 、岩藻
糖各 16.4 mg,葡萄糖醛酸 、半乳糖醛酸各 21.2 mg,
用水溶解并定容至 10 mL,得到各单糖浓度均为
0.01 mol/L的单糖标准品混合液。
2.3.3 多糖水解液的制备
称取大叶白麻多糖样品 11.1mg,加 2mol/L三
氟乙酸(TFA)1 mL,封口后 110 ℃水解 6 h,放冷后
氮气吹干 ,加 2.000mL水溶解备用 。
2.3.4 单糖标准品的 NMP衍生
取各浓度单糖标准品混合液或多糖水解液 50
μL于 2 mL安瓿瓶中 ,依次加入 200μL0.05 mol/L
的 NMP乙腈溶液 、40 μL17%氨水 ,封口后于 70 ℃
水浴中反应 35 min,取出放冷后用氮气吹干 ,加 500
μL乙腈水溶液(体积比为 4 ∶1)超声溶解供毛细管
电泳分析 。具体衍生过程见图 1。
2.3.5 电泳条件
按照我们以前得到的优化条件进行实验 [ 11] ,具
体如下:柱温 25 ℃;工作电压 10 kV;进样 8 s,进样
压强 3.45 kPa;缓冲溶液:硼酸盐浓度 55 mmol/L,
pH=9.46;检测波长:254 nm。实验前对缓冲溶液
进行超声脱气 5 min, 每次进样之前 , 分别用 0.1
mol/LNaOH溶液 、超纯水 、硼砂缓冲液冲洗毛细管
柱 5 min。
2.3.6 标准曲线的制备
将衍生化的单糖对照品混合液精确稀释 2、4、
8、16倍 ,得到浓度分别为 5×10-4、2.5×10-4 、1.25
×10-4 、6.25 ×10-5 mol/L的溶液 , 取适量上述浓
度的衍生物在选定电泳条件下进样 10 μL,测定峰
面积 。以单糖标准品峰面积 (Y)对相应浓度 (X,
mol/L)进行线性回归分析 ,求出各单糖标准品的直
线回归方程 ,结果见表 1。
2.3.7 对照品 、样品的测定
将衍生化的样品液经 0.45 μmol/mg微孔滤膜
滤过 ,然后在 2.3.5项所示的条件下进行毛细管电
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图 1 单糖标准品的 NMP衍生
表 1 单糖衍生物的线性回归方程 、相关系数及检测限
Table1 Linearregressionequations, correlation
coefficientsanddetectionlimitsofsaccharidederivatives
单糖 线性回归方程 相关系数
检测限 /
(μmol/L)
木糖 (Xyl) Y=1.905 91X-0.256 84 0.999 61 0.886
阿拉伯糖 (Ara) Y=2.045 8X+0.425 42 0.999 67 0.850
葡萄糖 (Glc) Y=1.419 38X+0.787 82 0.999 1 1.263
鼠李糖 (Rha) Y=1.540 32X-1.634 03 0.998 03 1.488
甘露糖 (Man) Y=1.732 46X-1.764 93 0.998 88 1.344
岩藻糖 (Fuc) Y=1.872 22X-0.304 56 0.999 53 1.602
半乳糖 (Gal) Y=2.230 51X-0.309 82 0.999 76 1.016
葡萄糖醛酸 (GlcUA)Y=1.272 61X-1.890 04 0.999 81 2.193
半乳糖醛酸 (GalUA)Y=2.15725X-3.32697 0.999 65 1.437
X.浓度 μmol/L Y.峰面积
泳 ,分别平行做 3份 ,根据各吸收峰的峰面积来计算
各单糖组成的物质量浓度 ,结果见图 2。如图 2和
表 2所示 ,大叶白麻实际样品中均含有 9种单糖成
分 ,其中半乳糖 (Gal)、阿拉伯糖 (Ara)、甘露糖
(Man)的含量较高 ,葡萄糖(Glc),半乳糖醛酸(Ga-
lUA),鼠李糖(Rha)的含量居中 ,木糖(Xyl)、葡萄糖
醛酸(GlcUA)、岩藻糖(Fuc)等的含量较低 ,另外在
鼠李糖(Rha)和甘露糖(Man)之间还存在一种未知
的成分 ,有待进一步研究。
3 结论
本实验采用硫酸 -蒽酮法对大叶白麻多糖含量
进行了测定 ,其原理是大叶白麻多糖在浓硫酸的作
用下 , 先水解为单糖 , 单糖迅速脱水形成糠醛衍生
物 , 然后与蒽酮缩合为有色化合物 , 其在 620nm处
有特征吸收 。本法操作简单 ,显色稳定 ,灵敏度高 ,
重现性好。在本实验中应注意以下两点:①在用此
方法进行测定时 ,若样品中含有蛋白和色素往往会
影响测定结果的准确性 ,因此一定要对多糖进行精
图 2 9种糖类衍生物(a)和大叶白麻多糖实际样品
(b)的毛细管区带电泳分离图
Fig.2 Chromatogramsofninederivatizedcarbohydrates
(a)andPoacynum hendersoniisample(b)by
capilaryzoneelectrophoresis
1.1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP) 2.木糖(Xyl) 3.阿拉
伯糖(Ara) 4.葡萄糖(Glc) 5.鼠李糖(Rha) 6.甘露糖(Man)
7.岩藻糖(Fuc) 8.半乳糖(Gal) 9.葡萄糖醛酸(GlcUA)
10.半乳糖醛酸(GalUA)
表 2 大叶白麻多糖中各单糖的含量
Table2 Thecontentsoftherespectivemonosaccharides
ofpolysaccharidefromPoacynumhendersonileave
成分
Component
含量 Content
/(mg/g)
成分
Component
含量 Content
/(mg/g)
半乳糖 Gal 1.79 鼠李糖 Rha 0.53
阿拉伯糖 Ara 1.41 木糖Xyl 0.30
甘露糖 Man 1.19 葡萄糖醛酸 GlcUA 0.35
葡萄糖 Glc 1.11 岩藻糖 Fuc 0.24
半乳糖醛酸 GalUA 0.57
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制纯化 。为此 ,本实验首先采用 Sevage法对蛋白进
行了较为彻底的去除 ,直至无蛋白层产生 。另外本
实验运用固液比为 1∶5活性炭 80℃条件下对多糖
进行了脱色 ,取得了较好的效果;②在实验过程中
发现温度对显色具有重要影响 ,在沸水浴恒温 15
min后立即用冷水冷却至室温 ,能得到重现性较好
的测定结果 。
利用本课题组合成的衍生试剂 (NMP)对大叶
白麻多糖中的单糖成分进行衍生 ,然后进行毛细管
电泳 ,在不加任何添加剂的情况下 ,高效 、快速地实
现 9种单糖的基线分离 ,其优点为检测限低 ,灵敏度
高 。
经实验测定大叶白麻叶多糖含量为 0.97%,种
类较丰富(已测出 9种),其中半乳糖 Gal、阿拉伯糖
Ara、甘露糖 Man的含量较多 。
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HPLC同时测定珍珠菜提取物中芦丁和柚皮素 -7-O-葡萄糖苷的含量
潘海敏 , 游本刚 , 唐丽华* , 李新章 , 杨世林
(苏州大学药学院 ,江苏 苏州 215123)
收稿日期:2009-01-11
基金项目:苏州市社会发展科技项目(SSY0703),苏州大学医学发展基金项(EE132609),国家科技支撑计划子课题(2006BAI06A01-01),
国家自然科学基金项目(30873362)
作者简介:潘海敏(1984-),女 ,硕士研究生 ,研究方向为中药新剂型。
*通讯作者:唐丽华(1952-),女 ,硕士生导师 ,研究方向为中药新剂型 , Tel:(0512)65880029 E-mail:tanglihua@suda.edu.cn
关键词:HPLC;珍珠菜;芦丁;柚皮素-7-O-葡萄糖苷
摘要:目的:建立同时测定珍珠菜中芦丁和柚皮素-7-O-葡萄糖苷含量的高效液相色谱方法。方法:以 DiamonsilC18柱
(4.6 mm ×250 mm, 5μm)为色谱柱 , 流动相采用乙腈(A)-0.1%磷酸(B)梯度洗脱:0 ~ 18 min, 83% ~ 80%B;18 ~ 30
min, 80% ~ 86%B。芦丁和柚皮素-7-O-葡萄糖苷的检测波长分别为 254 nm和 281 nm,流速为 1.0 mL/min, 柱温为 35
℃, 进样量为 20 μL。结果:用梯度洗脱得到了较好的分离效果 , 芦丁在 1.00 ~ 48.00 μg/mL之间线性关系良好 , r=
0.999 3;柚皮素-7-O-葡萄糖苷在 0.64 ~ 40.72μg/mL之间线性关系良好 , r=0.999 8。 结论:该方法准确 , 简便 , 可用于
珍珠菜中芦丁和柚皮素-7-O-葡萄糖苷含量的同时测定。
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1001-1528(2010)01-0106-04
Simultaneousdeterminationofrutinandnaringenin-7-o-glucosideinextraction
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2010年 1月
第 32卷 第 1期
中 成 药
ChineseTraditionalPatentMedicine
January2010
Vol.32 No.1