全 文 ：第 27卷 第 6期
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中 华 中 医 药 学 刊
CH INESE ARCH IVES OF TRAD IT IONAL CH INESE MED IC INE
Vo.l 27 No. 6
Jun. 2 0 0 9
中华中医药
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学刊
RP -HPLC法测定黑鳗藤药材中黑鳗藤新苷 K的含量
夏志俊,李晓誉
(浙江省医学科学院药物研究所,浙江 杭州 310013)
摘 要:目的:建立黑鳗藤药材中黑鳗藤新苷 K的含量测定方法。方法: 应用反相高效液相色谱法测定黑鳗
藤中黑鳗藤新苷 K的含量,色谱柱使用 Diam onsil C -18 ( 250mm @ 4. 6mm, 5Lm );流动相为乙腈: 水 ( 48B52) ;检
测波长为 355nm; 流速 1mL /m in。结果: 黑鳗藤新苷 K在进样量 2. 024~ 14. 168 mg范围内线性关系良好, 回归方
程为: Y= 144701X -9335. 5, r= 0. 9998;平均回收率为 98. 69% , RSD为 1. 48% ( n = 9)。结论: 该方法简便, 灵
敏,准确, 重现性好,可用于黑鳗藤药材的含量测定和质量控制。
关键词:黑鳗藤;黑鳗藤新苷; 高效液相色谱法
中图分类号: R9271 2 文献标识码: A 文章编号: 1673 - 7717( 2009) 06 -1260 - 03
Determ ination of Stemucronatoside K in the Roots of StephanotisM ucronata byRP -HPLC
XIA Zhi-jun, LI X iao-yu
( Insti tu te ofM ateria Medica, Zhejiang A cadem y ofMedical S cien ces, H angzhou 310013, Zhejiang, C hina)
Abstrac:t Ob jective: To estab lish a me thod fo r determ ination o f the content o f stemucrona to side K in the roo ts of
Stephanotis mucrona ta. M ethods: The ana lysis wa s ca rried out by RP -HPLC on D iam onsilC -18 ( 250mm @ 4. 6 mm, 5
Lm ), acetonitrile: w a te r ( 48: 52) as mob ile phase; w ave leng th was 355 nm; flow rate w as 1. 0 m L /m in. R esu lts: The
line r range of stem uc rona to sideK w as 2. 024~ 14. 168mg. Reg ression equa tion w as: Y= 144701X -9335. 5, r= 01 9998.
The ave rage recove ry wa s 98. 69% w ith RSD= 1. 48% ( n= 9). C onclusion: The m e thod is simp le and accurate w ith a
good reproducibility and can be used as a quan tita tive ana ly sis for the roots o f Stephanotis mucronata.
Keyw ords: Stephano tis mucrona ta; stem uc rona to sideK; HPLC
收稿日期: 2009 - 02 - 08
基金项目:浙江省自然科学基金资助项目 ( R206439 ) ;浙江省医药
卫生科技计划资助项目 ( 2006QN004)
作者简介:夏志俊 ( 1963 - ) ,男,浙江建德人,实验师, 从事中药和
天然药物成分的提取分离工作。
黑鳗藤 [Stephano tism ucronata ( B lanco) M err. ], 又名
博如藤、白地牛, 系萝藦科黑鳗藤属植物, 主要分布于浙江、
福建、湖南、广东、广西、四川等省, 为中国南部地区民间草
药,具有强筋骨、祛风湿的功效, 用于治疗类风湿性关节炎
和关节疼痛 [1 ]。小鼠耳廓抗炎试验和大鼠佐剂性关节炎
试验证实黑鳗藤中的总甾体苷具有显著的抗炎和治疗佐剂
性关节炎作用。为了阐明其中的活性成分, 笔者采用 R
P
-
18、Sephadex LH -20和 HPLC等现代色谱技术对黑鳗藤根
和藤茎中的总甾体苷进行了分离, 得到 33个 C21甾体苷类
化合物,通过 IR、ESI -MS、HRESI-M S、1H NMR、13C NMR、
DEPT、HMQC、HMBC、1H - 1H COSY等多种光谱技术分析
和化学降解测定了它们的化学结构 [2 - 7], 并采用体外脾淋
巴细胞增殖抑制活性测试研究了它们的免疫活性。黑鳗藤
新苷 K ( S tem uc rona to side K )显示很强的体外免疫抑制作
用,而且它在该植物中含量最高,动物体内活性评价实验如
抗 OVA ( Ova lbum in)免疫小鼠应答、抗大鼠皮肤移植排斥、
抗迟发型超敏反应等实验研究 [8 - 9], 结果表明黑鳗藤新苷
K是黑鳗藤治疗类风湿性关节炎的主要物质基础之一。因
此本文建立了高效液相色谱仪测定黑鳗藤中黑鳗藤新苷 K
的含量方法,可用于该药材的含量测定和质量控制。
1 仪器与试药
岛津 LC - 20AT系列高效液相色谱仪 ( LC - 20AT泵,
SPD -20A紫外检测器 ), N2000色谱工作站。TU - 1800型
紫外可见分光光度计。Sa rto rius BP211D型分析天平。
黑鳗藤新苷 K对照品系浙江省医学科学院药物研究
所天然药物化学实验室分离制备, 批号 20051102, 经高效
液相色谱峰面积归一化法测定, 纯度为 98. 6%。黑鳗藤药
材购自安徽亳州药 材市场 (批号 分别为 20050709,
20060815, 20070922, 20080512)。
试剂:乙腈为色谱纯, 水为双重蒸水, 其他试剂均为分
析纯。
2 方法和结果
2. 1 检测波长的选择 称取黑鳗藤新苷 K约 1. 0m g, 置
100m L量瓶中, 加流动相 (乙腈水 - 48B52)溶解并稀释至
刻度,摇匀, 用 TU - 1800型紫外可见分光光度计在 200~
400nm处扫描,选择测定波长为 355nm (图 1)。
2. 2 色谱条件 色谱柱为 Diam onsil C - 18 ( 250mm @
41 6mm, 5Lm ); 流动相为乙腈: 水 ( 48B52); 检测波长为
355nm; 流速 1m L /m in;柱温 35 e , 进样量为 20LL。
2. 3 对照品溶液的制备与供试品溶液的制备 对照品溶
液的制备:精密称取黑鳗藤新苷 K对照品适量 , 加甲醇制
成每 1mL含 0. 3036m g的对照品溶液, 即得。对照品色谱
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DOI：10.13193/j.archtcm.2009.06.141.xiazhj.057
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图见图 2。供试品溶液的制备 :取本品粉末 (过三号筛 )约
1. 0g, 精密称定, 置于圆底烧瓶中, 加甲醇 50m L, 超声
10m in,滤过, 取续滤液 25mL, 减压抽干溶剂, 残留物用甲醇
溶解并转移至 10mL量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀,用微孔滤
膜 ( 0. 45Lm )滤过, 取续滤液,即得。供试品色谱图见图 3。
2. 4 线性关系考察 精密称取黑鳗藤新苷 K50m g, 置
50m L量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 混匀。分别精密
量取 1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0mL置 10mL量瓶中,
加甲醇稀释至刻度, 摇匀,各进样 20L,测定峰面积, 以峰面
积为纵坐标 ( Y ) ,黑鳗藤新苷 K进样量为横坐标 ( X )作线
性回归,回归方程为 Y = 144701X - 9335. 5, r= 0. 9998,
在 2. 024~ 14. 168g范围内有良好的线性范围。
2. 5 重复性试验 每 1mL含 0. 3036mg的对照品溶液 20LL,
连续进样 6次, 测得黑鳗藤新苷 K峰面积分别为 955038、
959067、957499、957865、955413、955984, RSD为0. 16%。
2. 6 样品溶液稳定性 取供试品溶液, 分别在 0、1、2、3、
4、7h进样, 测定黑鳗藤新苷 K 峰面积分别为: 924295、
929837、940224、938892、933786、973139, RSD= 1. 84% ( n =
6), 表明样品溶液在 7h内稳定。
2. 7 精密度试验 取同一批黑鳗藤药材, 每份 1g, 按
/ 2. 40项下供试品处理方法制备, 于同一日内和不同日间
( 6d内,每日测定 1次 )分别测定含量 6次, 计算日内和日
间精密度。测得日内黑鳗藤新苷 K含量分别为 5. 70、
5. 56、51 73、5. 66、5. 81、5. 79mg /g, RSD为 1. 60% ( n = 6);
测得日间黑鳗藤新苷 K 含量分别为 5. 58、5. 83、5. 75、
5. 77、5. 59、5. 65mg /g, RSD为 1. 81% ( n = 6)。
2. 8 加样回收率试验 取黑鳗藤药材 9份, 分别按低、
中、高 3个量级加入黑鳗藤新苷 K对照品,按 / 2. 40项下供
试品处理方法制备, 分别进样 20LL, 计算得回收率为
98169% , RSD为 1. 48%。
表 1 回收率试验结果
药材中黑鳗藤新苷
K的量 (mg) A
加入的黑鳗藤新苷
K的量 ( mg) B
实测值
( mg) C
回收率 ( C -A )
/Bc100%
平均回收
率 (% )
RSD
(% )
2. 80 2. 31 5. 04 96. 97
2. 87 2. 29 5. 11 97. 82
2. 87 2. 29 5. 14 99. 13
2. 82 2. 79 5. 55 97. 85
2. 87 2. 83 5. 70 100. 00 98. 69 1. 48
2. 84 2. 81 5. 59 97. 86
2. 87 3. 48 6. 34 99. 71
2. 90 3. 50 6. 45 101. 43
2. 91 3. 50 6. 32 97. 43
2. 9 样品含量测定 按拟定方法进对照品溶液和供试品
溶液各 20L,测定样品中黑鳗藤新苷 K含量。
表 2 药材含量测定 ( n = 6)
批号 黑鳗藤新苷 K( mg /g) RSD (% )
20050709 5. 14 1. 00
20060815 5. 65 1. 36
20070922 5. 79 1. 23
20080512 5. 37 1. 26
3 讨 论
笔者曾对提取方法进行研究, 通过加热回流 2. 0、1. 5、
1. 0h和超声 0. 5h提取比较, 发现几种方法黑鳗藤新苷 K
含量几乎一致,因此选用简便的超声提取方法, 并进一步进
行超声提取时间的比较,结果表明超声 10、20和 40m in, 黑
鳗藤新苷 K 含量几乎一致 (表 3), 因此笔者选用超声
10m in的提取方法。
表 3 回流和超声提取比较结果
不同提取
方法比较
药材中黑鳗藤新苷
K含量 ( mg /g )
不同超声
时间比较
药材中黑鳗藤新苷
K含量 ( mg /g)
回流时间 2. 0h 5. 73 超声 10 m in 5. 72
回流时间 1. 5h 5. 74 超声 20 m in 5. 77
回流时间 1. 0h 5. 77 超声 40 m in 5. 75
超声时间 0. 5h 5. 67
参考文献
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收稿日期: 2009 - 01 - 09
基金项目:浙江省中医管理局资助项目 ( 2002C 017)
作者简介:王新华 ( 1969 - ),男,浙江桐庐人,副主任医师,硕士, 研
究方向:慢性阻塞性肺病、肺间质疾病。
通讯简介:夏永良 ( 1969 - ),男 (回族 ) ,辽宁新民人,主治医师, 硕
士,主要从事中医内科临床、科研、教学工作。 E-m ai:l
abc3815@ tom. com。
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益气养阴活血化瘀法对肺纤维化鼠模型的
干预作用及对 TGF - B1 表达的影响
王新华 1,夏永良1,王 真 1,朱渊红1,许 励 2
( 1.浙江中医药大学附属第一医院,浙江 杭州 310006; 2. 浙江省人民医院,浙江 杭州 310014)
摘 要:目的:通过观察丹参、参麦注射液对博莱霉素致肺纤维化模型大鼠肺组织病理学、免疫组化肺组织中
TGF -B1表达和支气管肺泡灌洗液中 TGF -B1表达的定量分析, 明确益气养阴、活血化瘀法对肺间质纤维化的
治疗作用并探讨其作用机理。方法: 采用 BLMA5致大鼠肺间质纤维化的造模方法,随机将 72只大鼠分为 4组:
空白组、博莱霉素模型组、丹参组、丹参合参麦组,除空白组外其余 3组分别每天腹腔注射生理盐水、丹参注射液、
丹参合参麦注射液, 各组分别于第 7、14、28天各处死 6只大鼠 ,依次收集支气管肺泡灌洗液,取肺病理标本。通
过计算机图像分析系统定量分析第 28d的病理改变,免疫组化图像分析测量第 7、14、28天的 TGF -B1吸光度,以
及 ELISA酶法测定支气管肺泡灌洗液中第 7、14、28天的 TGF -B1含量。结果:经丹参和丹参合参麦注射液干预
后,大鼠的纤维化和肺泡炎均较模型组轻,丹参合参麦组比丹参组更轻 ( P < 0. 05)。丹参组和丹参合参麦组的
肺组织免疫组化 TGF -B
1
平均吸光度、肺泡灌洗液的 TGF -B
1
的含量均较模型组低 ( P < 0. 01),其中第 14天丹
参合参麦组较丹参组更低 ( P < 0. 05)。结论: 以丹参合参麦为代表的益气养阴、活血化瘀法对肺纤维化有明显
改善作用,其作用机理与其降低 TGF -B1的表达有关。
关键词:益气养阴; 活血化瘀; 博莱霉素; 肺纤维化, TGF -B1
中图分类号: R2851 5 文献标识码: A 文章编号: 1673 - 7717( 2009) 06 -1262 - 03
Effect ofY iqiyangyin and HuoxuehuayuM ethods on the Expression of
TGF - B1 in Rats w ith Pulmouary F ibrosis
WANG X in-hua1, X IA Yong-liang1, WANG Zhen1, ZHU Yuan-hong1, XU L i2
( 1. The Firs tA ffiliated H osp ital ofZhejiang C h inese Medical Univers ity, H angzhou 310006, Zhejiang, Ch ina;
2. The Peop lepsH osp ital of Zh ejiang P rovin ce, H angzhou 310014, Zhe jiang, Ch ina)
Abstrac:t Ob jective: To obse rve the effect on the ratm ode ls of pulm onary fib rosis by Danshen and Shenm a i parenter-
a l so lution w ith the pu lm onary pa thologica l changes, expre ssion o f TGF -B1 in pu lm onary tissue and bronchoalveolar lav-
age flu id ( BALF) . And discuss the ac tion m echan ism o f y iq iyangy in and huoxuehuayu m ethods in the pu lmonary fib ro-
sis. M ethods: Reproduce the ratm ode ls of pu lmonary fibro sis by in je cting bleom ycin to trachea, 72 SD rats we re random ly
divided in to fou r g roups, including the norm a l g roup, them ode led g roup, the Danshen group, the Danshen and Shenm ai
g roup. Then trea t the latter th ree ratm ode ls w ith intraperitoneal injec tion by phy sio log ical sa line, Danshen pa rentera l so-
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