全 文 ：第 27卷 第 3期
2 0 0 9年 3月
中 华 中 医 药 学 刊
CH INESE ARCH IVES OF TRAD IT IONAL CH INESE MED IC INE
Vo.l 27 No. 3
M ar. 2 0 0 9
中华中医药
608
学刊
黑鳗藤新苷 K的急性毒性及
体内抑制细胞和体液免疫的实验研究
陈峰阳,叶益萍,李晓誉,史 红
(浙江省医学科学院药物研究所,浙江 杭州 310013)
摘 要:目的:研究黑鳗藤新苷 K的急性毒性及体内对细胞免疫和体液免疫的抑制作用。方法:采用 2, 4 -
二硝基氟苯 ( DNFB )所致的小鼠迟发型超敏反应 ( DTH )模型和绵羊红细胞 ( SRBC )所致小鼠血清凝集素生成模
型,观察黑鳗藤新苷 K对小鼠体内细胞免疫和体液免疫的抑制作用。结果: 黑鳗藤新苷 K3. 2g /kg剂量内对小鼠
无明显毒副作用; 10m g /kg以上剂量即可显著降低 DNFB诱导的 DTH反应小鼠的耳廓肿胀度 (P < 0105 ); 20mg /
kg以上剂量即可显著减少 SRBC所致小鼠血清凝集素抗体的生成 (P < 01 05)。结论:黑鳗藤新苷 K小鼠体内能
显著抑制细胞免疫反应和体液免疫反应, 无明显毒性。
关键词:黑鳗藤新苷 K;急性毒性; 迟发型超敏反应; 血清凝集素;免疫抑制
中图分类号: R285. 5 文献标识码: A 文章编号: 1673 - 7717( 2009) 03 -608 -03
Acute Tox ic ity Test and Inh ib ition E ffects ofS temuc ronatoside K on the Cellu lar
and Humora l Immune Responses in V ivo
CHEN Feng-yang, YE Y i-ping, L IX iao-yu, SH IH ong
( Insti tu te ofM ateria Medica, Zhejiang A cadem y ofMedical S cien ces, H angzhou 310013, Zhejiang, C hina)
Abstrac:tObjective: To investiga te the acu te tox icity and the inhibition effec ts o f S temucrona to side K ( SMK ) on the
ce llu lar and humo ra l immune re sponses in vivo. Methods: The imm unosuppre ssive effect o f SMK on the ce llular immune
response w as obse rved by DNFB-induced de layed type hypersensitiv ity( DTH ) in m ice; and the experim ent o f se rum agg lu-
tinin in m ice induced by SRBC w as used for obse rv ing the inh ibiton effect o f SMK on the humo ra l immune re sponse. R e-
sults: SMK d id not show any toxic ity unde r the dose o f 3. 2g /kg, and significan tly inhibited DNFB-induced auric le engo rge-
m ent o f DTH m ice above the do se o f 10m g /kg(P < 01 05), and the produc tion o f antibody in the experim ent of serum ag-
g lutin in in m ice above the dose o f 20mg /kg (P < 01 05). Conclusion: SMK has m arked imm unosupp ressive effec t on the
ce llu lar and humo ra l immune re sponses in v ivo w ithout obv ious tox icity.
Keyw ords: Stem ucronatoside K; acu te tox icity; de lay ed type hype rsensitiv ity; se rum agg lutinin; imm unosuppression
收稿日期: 2008 - 10 - 01
基金项目:浙江省自然科学基金资助项目 ( R206439) ; 浙江省医药
卫生科技计划资助项目 ( 2006QN004)
作者简介:陈峰阳 ( 1983 - ),男,浙江磐安人,助理研究员,硕士, 从
事中药和天然药物成分的提取分离和活性筛选工作。
通讯作者:叶益萍 ( 1970 - ) ,女, 浙江龙游人,副研究员,硕士研究
生导师,博士,主要从事中药和天然药物成分的提取分
离和活性筛选工作。
萝藦科植物黑鳗藤 S tephano tis m ucronata ( B lanco )
M err.具有强筋骨、祛风湿的功效, 作为民间草药用于治疗
类风湿性关节炎和关节疼痛。笔者在前期的研究中, 从黑
鳗藤中分离得到 20多个新的 C21甾体苷, 并报道了它们的
体外免疫调节活性 [1 - 4 ]。黑鳗藤新苷 K ( S temuc rona to side
K,简称 SMK)为黑鳗藤 C21甾体苷类成分中含量最高的化
合物,体外研究表明在 0101~ 10Lg /m L浓度下, 能浓度依
赖性地抑制 Con A诱导的小鼠 T淋巴细胞增殖反应和 LPS
诱导的小鼠 B淋巴细胞增殖反应。本文通过小鼠急性毒
性试验初步评价了 SMK的毒性, 通过对 DNFB诱导的小鼠
迟发型超敏 ( DTH )反应和小鼠血清凝集素水平的影响初
步研究了 SMK体内抑制细胞免疫和体液免疫的作用。
1 材 料
11 1 药物及试剂
黑鳗藤新苷 K( SMK)从萝藦科黑鳗藤属植物黑鳗藤
[Stephano tism ucrona ta (B lanco)M e rr. ]根中分离制备, 经现
代波谱学技术 (红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁共振谱 )和
化学降解方法测定了化学结构 (图 1), 经 HPLC - DAD法
测定其含量 98%以上; 环孢菌素 A( Cyc lo spo rin A, C sA )由
杭州中美华东制药有限公司馈赠; 雷公藤多苷片 (浙江得
恩德制药有限公司 ); 药物临用前均用 015% CMC -Na混
悬配制成所需浓度。2, 4 -二硝基氟苯 ( DNFB, 中国医药集
团上海化学试剂公司 ); 阿氏 ( A lsever s)液: 葡萄糖 2105g,
608
DOI：10.13193/j.archtcm.2009.03.161.chenfy.062
第 27卷 第 3期
2 0 0 9年 3月
中 华 中 医 药 学 刊
CH INESE ARCH IVES OF TRAD IT IONAL CH INESE MED IC INE
Vo.l 27 No. 3
M ar. 2 0 0 9
中华中医药
609
学刊
柠檬酸钠 0180g,氯化钠 01 42g,蒸馏水加至 100mL,用 10%
柠檬酸调节 pH 至 611, 过滤, 分装, 以 113e 高压灭菌
20m in, 4e 保存;绵羊红细胞悬液 ( SRBC ): 以无菌操作从绵
羊 (浙江大学动物中心提供 )颈静脉采血, 加等量阿氏液,
混匀, 2000 r /m in离心 10m in, 收集红细胞加等体积生理盐
水,混匀, 离心,弃去上清, 重复洗涤直至上清液不呈红色为
止,将压积红细胞稀释成 10% (细胞浓度约为 1 @ 109个 /
mL)和 015% (细胞浓度约 8 @ 107个 /mL )的绵羊红细胞悬
液。
图 1 黑鳗藤新苷 K的化学结构
112 实验动物
清洁级 ICR小鼠,体重 18~ 22g, 浙江省实验动物中心
提供,合格证号: SCXK (浙 ) 2003 -0001。
2 实验方法
211 黑鳗藤新苷 K的急性毒性试验
取 40只小鼠, 实验前禁食 12h, 随机分为 4组, 每组 10
只,雌雄各半, 各组体重平均值之差不超过 1g,按 400、800、
1600、3200 mg /kg的剂量 1次灌服 SMK药物。给药后观察
小鼠的毒性反应,连续观察 7天。
212 黑鳗藤新苷 K对 DNFB诱导的迟发型超敏反应的影
响 [5 ]
2121 1 分组及处理 取 50只小鼠, 腹部剃毛, 涂抹 1%
DNFB的丙酮麻油 ( 1B1)溶液 50LL致敏后, 随机分为 5组,
每组 10只, 雌雄各半, 各组体重平均值之差不超过 1g, 分
别为:溶剂对照组 ( Contro l)、阳性对照 CsA组 ( 20mg /kg )、
SMK组 ( 20、10、5m g /kg)。于致敏当天给药,溶剂对照组灌
服 015% CMC -Na、阳性对照组和 SMK组分别灌服各自剂
量药物,每天 1次, 连续 6天。致敏后 5天 (第 6天 )进行激
发试验:即在小鼠左耳两侧均匀涂布 10LL1% DNFB溶液,
同时右耳两侧涂以等量的丙酮麻油溶剂作为对照。
2121 2 指标观察及测定 激发试验 24h后拉断颈椎处死
试验动物,剪下左右耳廓, 以 8mm 直径打孔器在相同位置
打下圆耳片。分析天平称重, 以左右耳重差表示耳廓的肿
胀程度。
213 黑鳗藤新苷 K对小鼠血清凝集素水平的影响 [5 ]
2131 1 分组及处理 取 50只小鼠随机分为 5组, 每组 10
只,雌雄各半, 各组体重平均值之差不超过 1g, 分别为溶剂
对照组、阳性对照雷公藤多苷组 ( 20m g /kg )、SMK组 ( 80、
40、20m g /kg)。于致敏当天给药, 溶剂对照组灌服 015%
CMC -Na、阳性对照组和 SMK组分别灌服各自剂量药物,
每天 1次, 连续 6天。开始给药后 24h每鼠腹腔注射 10%
绵羊红细胞悬液 015mL进行免疫。
21 31 2 指标观察及测定 于末次给药 1h后眼眶采血, 分
离血清,置 56e 水浴灭活 30m in, 用生理盐水将血清作倍半
稀释, 最终试验浓度分别为 40、80、160、320和 640倍。将
不同稀释度的血清分别置于试管内, 每管 01 5mL, 再加入
01 5%的绵羊红细胞悬液 015mL混匀,置 37C孵育 3h, 根据
血球凝集程度分为 5级 ( 0 ~ 4), 并按下式计算抗体积数。
抗体积数计算公式: 抗体积数 = E ( S1+ 2S2 + 3S3+ , +
nSn)。
其中: 1, 2, 3, ,, n代表对倍稀释指数, S: 凝集程度的
级别。
21 4 统计学处理
所得数据用平均值 ?标准差表示, 并用 t检验法比较
各组间的统计学差异, P < 0105认为在统计学上有显著性。
3 结 果
31 1 黑鳗藤新苷 K的急性毒性
3200mg /kg的剂量下, 混悬液黏稠, 无法再增加浓度。
以此为最高剂量下观察,各组小鼠状态均良好, 未见有明显
毒副反应。
31 2 黑鳗藤新苷 K对 DNFB诱导的 DTH反应的影响
与溶剂对照组比较, SMK 20、10m g /kg均可显著降低耳
廓肿胀度 (P < 0105, P < 01 01), CsA组能明显降低耳廓肿
胀度 (P < 01 05), 见图 2。 SMK 20、10m g /kg组与 CsA组对
耳廓肿胀度的抑制作用无显著性差异 (P > 0105 )。表明
SMK大于 10mg /kg可显著抑制小鼠的迟发型超敏反应。
图 2 黑鳗藤新苷 K对 DNFB诱导的小鼠耳廓肿胀的影响
31 3 黑鳗藤新苷 K对小鼠血清凝集素水平的影响 与溶
剂对照组比较, SMK20、40和 80m g /kg和雷公藤多苷均可
显著减少小鼠血清抗体积数 (P < 0105~ 01 001), 见表 1。
说明黑鳗藤新苷 K可显著抑制小鼠抗体的生成。
表 1 黑鳗藤新苷 K对小鼠血清凝集素的影响
组别 剂量 ( mg /kg) n 抗体积数
溶剂对照组 0 10 40. 7 ? 12. 1
雷公藤多苷片组 20. 0 10 26. 0 ? 5. 1b
SMK低剂量组 20. 0 10 27. 0 ? 9. 6a
SMK中剂量组 40. 0 10 23. 8 ? 7. 1b
SMK高剂量组 80. 0 10 23. 1 ? 5. 9c
注:与溶剂对照组比较, a P < 0105, b P < 0101, cP < 01001。
609
第 27卷 第 3期
2 0 0 9年 3月
中 华 中 医 药 学 刊
CH INESE ARCH IVES OF TRAD IT IONAL CH INESE MED IC INE
Vo.l 27 No. 3
M ar. 2 0 0 9
中华中医药
610
学刊
4 讨 论
迟发型超敏 ( DTH )反应是依赖 T细胞的细胞免疫反
应,二硝基氟苯 ( DNFB )作为半抗原, 涂抹于腹壁皮肤后,
可与皮肤蛋白结合成完全抗原, 由郎格罕司细胞 ( lange r-
hans ce lls, lcs)递呈至局部淋巴结, 产生记忆型 T细胞, 当
耳部皮肤再次接触该致敏物时, 即可诱发大量 T细胞为主
的单一核细胞在局部浸润,引起炎症反应,从而使耳廓局部
肿胀,并在再次致敏后 24~ 48h达到高峰 [5], 所以 DTH反
应的耳廓肿胀度可作为特异性细胞免疫的检测指标。小鼠
DTH反应显示 (图 2) ,黑鳗藤新苷 K20、10m g /kg均可显著
降低耳廓肿胀度 (P < 01 05或 P < 01 01), 抑制小鼠的迟发
型超敏反应,并与 CsA作用相当, 表明黑鳗藤新苷 K可显
著抑制特异性细胞免疫反应。
SRBC致敏的动物血清中存在血清凝集素 (循环抗体
之一 ), 与 SRBC体外温育,根据血细胞的凝集程度可反映
抗体水平 [5 ]。小鼠血清凝集实验显示 (表 1), 黑鳗藤新苷
K剂量大于 2010m g /kg即可显著抑制小鼠抗体的生成 ( P
< 0105~ 01 001), 表明黑鳗藤新苷 K可显著抑制体液免疫
反应。
C21甾体苷系一类由苷元为孕甾烷衍生物与 2 -去氧糖
等组成的糖苷化合物, 主要分布于龙胆科、薯蓣科、夹竹桃
科、茄科和萝藦科植物中, 该类化合物具有抑制肿瘤细胞增
殖或侵袭、抗癫痫、抗生育、免疫调节功能、抑制乙酰胆碱酯
酶活性等多方面的生物活性作用 [6 - 9]。近年来, 其免疫抑
制作用也日益受到人们的关注, 杠柳苷 E [10], physa lin B、F
、G等都是从天然药物中新发现的具有较强免疫抑制活性
的 C21甾体苷 [11]。萝藦科植物含有丰富的 C21甾体苷,笔者
在前期从萝藦科植物黑鳗藤 S tephano tis mucronata ( B lanco)
M err中分离得到一系列毒性低并具有免疫抑制活性的新
的 C21甾体苷,其中含量最高的黑鳗藤新苷 K体外能显著
抑制 Con A诱导的小鼠 T淋巴细胞增殖反应和 LPS诱导的
小鼠 B淋巴细胞增殖反应。本文通过小鼠急性毒性试验
观察未发现黑鳗藤新苷 K对小鼠有明显的毒副作用; 通过
对 DNFB诱导的小鼠 DTH反应和小鼠血清凝集素水平的
影响表明黑鳗藤新苷 K在体内也能显著抑制细胞免疫和
体液免疫反应,这为 C21甾体苷类化合物作为新型天然免疫
抑制剂的筛选提供了参考和证据, 其作用途径和机制有待
进一步深入研究。
参考文献
[1 ] Ye YP, LiXY, Sun HX, et a.l Immunom odu lat ing s teroida lg lyco-
s ides f rom the roots ofS tephano tism ucrona ta [ J ]. H e lv Ch im Ac-
ta, 2004, 87( 9 ): 2378 -2384.
[2 ] Ye YP, Sun HX, L iXY, et a.l Fou r new C - 21 steroidal g lyco-
s ides from th e roots of S tephanotis m ucrona ta and their imm uno-
log ical activities [ J ]. S teroids, 2005, 70 ( 12) : 791 - 797.
[3 ] Ye YP, Chen FY, S un HX, et a.l Tw o novel imm unosupp ressive
p regnane glycosides from the roots of S teph anotismu cronata [ J ].
Bioorg M ed Chem Let,t 2006, 16: 4586 -4591.
[4 ] C ao XJ, Tai YB, L iXY, et a.l S creen ing for p regnane glycosides
w i th imm unolog ical activities from the stem s of S teph anotismu cr-
onata by h igh-perform ance liquid ch rom atography /tandem m ass
spectrom etry[ J]. Rapid C omm unM ass Spect rom, 2006, 20 ( 3) :
403 - 411.
[ 5 ] 徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学 [M ]. 3版.北京:人民
卫生出版社, 2001: 1429 - 1430, 1437 - 1438.
[ 6 ] P laza A, Perrone A, Bales trieriM L, et a.l N ew unu sua l pregnane
glycosidesw ith antipro liferative activity from S olenostemma arge l
[ J ]. S teroids, 2005, 70( 9 ) : 594 - 603.
[ 7 ] De LeoM, De Tomm asiN, S anogo R, et a.l New p regnane g lyco-
sides from C arallum a dalzie lii[ J ]. S teroids, 2005, 70 ( 9) : 573 -
85.
[ 8 ] Kim MS, Baek JH, Park JA, et a.l W ilfoside K1N iso lated from
Cynanchum w ilford ii inh ib its angiogenesis and tum or cell invasion
[ J ]. Int JOn co,l 2005, 26 ( 6) : 1533 - 1539.
[ 9 ] Lee KY, Yoon JS, Kim ES, et a.l An ti-acety lcho linesterase and
an ti-am nesic activit ies of a pregnane glycoside, cynatroside B,
from C ynan chum atratum [ J ]. P lan taM ed, 2005, 71 ( 1) : 7 - 11.
[ 10 ] ZhuYN, ZhaoWM, Yang YF, et a.l Periplocoside E, an effect ive
com pound from Perip loca sepium Bge, inh ib ited T ce llactivation
in vi tro and in vivo[ J ]. J Pharm acol Exp Ther, 2006, 316( 2) :
662 - 669.
[ 11 ] SoaresMBP, Bru sto lim D, Santos LA, et a.l Physalin s B, F and
G, seco-steroid s pu rif ied from Physalis angu lata L. inh ib it lym -
phocyte function and allogeneic transplan t rejection [ J]. Int Im -
m unopharmaco,l 2006, 6: 408 -414.
每天喝杯牛奶或
吃片奶酪有助预防中风
日本厚生劳动省的一项大规模调查显示,通过牛奶、奶
酪等乳制品摄取钙较多的人, 比几乎不摄取乳钙者的中风
发病率要低约 30%。
据日本5每日新闻6网站 7月 29日报道 ,该调查发现,
每天饮用 130mL左右的牛奶或食用 1片至 115片切片奶
酪,就能起到有助预防中风的作用。
研究人员以日本岩手、秋田、长野和冲绳 4县的约 4万
名 40岁至 59岁的居民为调查对象, 从 1990年开始连续研
究了 12年。到 2002年,调查对象中有 1321人中风。
数据表明, 平均每天摄取 116m g乳钙的被调查组成
员,比几乎不摄取乳钙组成员的中风几率低 31%。相关数
据还表明 ,通过吃蔬菜、鱼类和大豆制品等乳制品以外的食
品摄取的钙对预防中风没有明显效果。
参与研究的大板大学公共卫生学教授矶博康解释说,
多摄取钙能使血压降低, 这可能就是钙预防中风的原因。
而乳制品比其他食品预防中风的效果要明显, 是因为人的
肠道更容易从乳制品中吸收钙。
上述调查还显示,心肌梗死等心脏病的发病率与是否
摄取钙没有关联。研究人员认为, 乳制品中大量含有的饱
和脂肪酸可能导致心脏病发病率升高,抵消了钙的作用, 心
脏病患者如果过多食用乳制品很可能在预防中风方面适得
其反。
610