全 文 ：林业科技开发 2014 年第 28 卷第 1 期 25
doi:10． 13360 / j． issn． 1000－8101． 2014． 01． 006
滇楸体胚发生及生理生化特性研究
江荣翠1，彭方仁2* ，谭鹏鹏2
(1．南京邮电大学信息材料与纳米技术研究院，南京 210046;2． 南京林业大学森林资源与环境学院)
摘 要:探讨了滇楸体细胞胚胎发生和发育过程中形态学和解剖学特征及变化，对其发生和发育过程中的一些生
理生化特性进行了初步研究。结果表明: ( 1) 滇楸非胚性和胚性愈伤组织在细胞形态和组织结构上差异明显，滇楸
体胚起源于单个胚性细胞，经历了单细胞、多细胞、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚各阶段。( 2) 在胚性愈伤组织
和体细胞胚胎诱导形成及发育早期，3 种抗氧化酶( SOD、POD和 CAT) 活性均提高，而在后期体胚成熟和萌发的过
程中 3 种抗氧化酶的活性变化趋势差异明显。( 3) 碳、氮类营养物质在胚性愈伤组织内大量积累，为体细胞胚胎发
生奠定能量和物质基础;在体胚发育的不同阶段，碳、氮代谢呈现明显的差异。
关键词:滇楸; 体细胞胚胎; 生理生化特性
Somatic embryogenesis and the physiological and biochemical characteristics in Catalpa fargesii Bur． f．
duclouxii(Dode)Gilmour∥JIANG Ｒongcui，PENG Fangren，TAN Pengpeng
Abstract:This paper studied the morphological and anatomical characteristics of somatic embryogenesis in Catalpa fargesii
Bur． f． duclouxii(Dode)Gilmour，and some physiological and biochemical characteristics during the process were prelimi-
nary analysed． The results showed that:(1)Obvious morphological and anatomical difference between the non-embryonic
and embryonic callus was observed． Derived from single embryonic cell，the somatic embryo of Catalpa fargesii duclouxii
experienced the stages of multicellular，globular embryo，heart-shaped embryo，torpedo-shaped embryo and cotyledon em-
bryo． (2)The activities of the three antioxidant enzymes(SOD，POD and CAT)were all increased during the formation of
embryonic callus and the early stage of embryos development，while the change trends of their activities showed obvious
differences in the later stages of embryos maturation and germination． (3)C and N nutrients were largely accumulated in
embryonic callus which laid the material and energy foundation for the development of somatic embryos． The metabolic rules
of C and N nutrients in different stages of embryo development showed significant changes．
Key words:Catalpa fargesii Bur． f． duclouxii(Dode)Gilmour;somatic embryos;physiological and biochemical character-
istics
First author’s address:Institute of Advanced Materials(IAM) ，Nanjing University of Posts and Telecommunications，
Nanjing 210046，China
收稿日期:2013－10－16 修回日期:2013－10－30
基金项目:国家“十二五”科技支撑计划(编号:2012BAD21B00)。
作者简介:江荣翠(1982 －)，女，博士，研究方向为纳米生物学。通讯
作者:彭方仁，男，教授。E-mail:frpeng@ njfu． edu． cn
滇楸［Catalpa fargesii Bur． f． duclouxii(Dode)
Gilmour］是紫葳科梓树属的落叶乔木，主要分布于云
南中北部、四川、湖南、贵州等省区，是石漠化山区的
乡土树种。该树种不仅具有速生、材质好的特性，且
具有根系繁茂、固土作用好、水分利用率高、耐旱性强
的优点［1］。梓树属大多树种“自花不孕”，即使结实，
其结实量也很少，出种率非常低［2］，其中滇楸的种子
活力低下，发芽率很低［3］。体细胞胚胎发生具有繁
殖系数大、速度快、再生率高等优点，利用体胚发生技
术进行繁殖已成为迅速扩大优良种质资源的重要手
段，而滇楸体胚发生技术的研究有限，特别是对其生
理生化发生机理的研究尚属空白。
自从 1958 年 Steward 在胡萝卜组织培养中发现
胚状体发生以来，国内外学者对多种植物胚状体的发
生和发育过程及其机理进行了广泛的研究，揭示了植
物胚状体发生、发育历程、影响因素及其发生机制，为
体胚发生的应用提供理论支持［4－6］。本研究应用扫
描电镜和石蜡切片方法对滇楸体胚的发生和发育过
程中形态学和细胞组织学进行探讨，对该过程中抗氧
化酶活性、碳水化合物、游离氨基酸和可溶性蛋白含
量进行了测定和分析，初步研究了滇楸体细胞胚胎发
生的生理生化机制，为滇楸体胚的发生、同步化调控
及应用提供理论支持，为其体胚发生体系的健全和优
化奠定理论基础。
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 应用研究
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1 材料与方法
1． 1 试验材料
试验材料为滇楸体细胞胚胎发生过程中不同组
织材料。在体胚发生的生理生化特性表征中，根据材
料组织的外部形态特征及培养和发育时间将供试的
材料划分为以下 8 种:
(1)主要以滇楸无菌实生苗的子叶、胚轴为外植
体，诱导形成的非胚性愈伤组织，诱导培养时间为 25
～ 30 d;
(2)上述非胚性愈伤组织在液体培养基中继代
培养 14 d，主要为胚性愈伤;
(3)上述愈伤组织在液体培养基中继代培养 21
d，主要为胚性愈伤;
(4)胚性愈伤组织经过体胚诱导培养 21 d，内部
形成大量单细胞、多细胞及球形原胚，表面有少量球
形和心形体胚;
(5)将以上材料中的球形和心形体胚分离培养
14 d，体胚进一步成熟，形如梨形和鱼雷胚;
(6)梨形和鱼雷胚进一步培养 14 d左右，胚轴伸
长、胚根和子叶形成，为近成熟的体胚;
(7)成熟的体胚，为材料 6 继续培养 21 d 得到，
与材料 6 相比，体胚颜色变绿，胚轴进一步伸长、子叶
展开、胚根萌发。
(8)体胚萌发的幼苗，形成 1 ～ 2 片小的真叶，胚
根进一步萌发，并伴有少量侧根形成。称取 8 阶段新
鲜材料各 0． 2 g，重复 3 次。
1． 2 试验方法
滇楸体细胞胚胎发生诱导培养、试验中石蜡切片
具体制作方法参考有关文献［7－8］。生理生化指标测
定中，可溶性糖和淀粉含量测定采用蒽酮比色法;超
氧化物歧化酶(SOD)活性测定用氮蓝四唑(NBT)还
原法;过氧化物酶(POD)活性测定采用氧化愈创木
酚法;过氧化氢酶(CAT)活性测定采用高锰酸钾滴定
法;游离氨基酸总量测定采用茚三酮法;可溶性蛋白
含量测定用考马斯亮兰染色法［9］。所有实验均重复
3 次，统计计算平均值和标准差。SEM观察拍照使用
SEM－500Pilips，具体参照陈金慧等［10］的试验方法。
2 结果与分析
2． 1 滇楸体细胞胚胎发生的形态及组织变化
2． 1． 1 滇楸体细胞胚胎发生过程中的形貌变化
滇楸体细胞胚胎发生的研究中均采用 MS 基本
培养基，诱导形成的愈伤组织及体细胞胚胎发生的形
貌结构如图 1 所示。以萌发 20 d 左右的滇楸无菌苗
胚轴为外植体，在含有 2． 00 mg /L 6 －BA 和 0． 01
mg /L NAA的培养基上诱导培养形成非胚性愈伤组
织。该愈伤组织浅绿色的、质地疏松(图 1a)。悬浮
培养(培养基含有 0． 50 mg /L TDZ)中的胚性愈伤组
织，由非胚性愈伤组织经转化、诱导培养形成，培养时
间为 14 ～ 21 d。该愈伤组织质地紧实，表面为黄褐
色，是表层细胞在接种过程中受到机械损伤后褐化形
成(图 1b)。将悬浮培养的胚性愈伤组织取出，在固
体培养基(含 1． 00 mg /L 6－BA 和 0． 01 mg /L NAA)
上诱导培养 21 d 左右，其表面渐渐形成很多白色的
球形和心形胚。将这些球形和心形的体胚分离并继
续培养，体胚进一步发育成熟，部分体胚已经逐渐转
为绿色(图 1c)。图 1d所示为已经萌发体胚幼苗(培
养基中不含任何生长调节因子)。可以看出体胚萌
发的幼苗通体呈现绿色，部分幼苗已经形成 1 ～ 3 片
真叶和较发达的根系(如箭头所示)。
图 1 滇楸体细胞胚胎发生与发育
为进一步观察体细胞的形态变化，笔者还对不同
阶段的体细胞胚胎进行了扫描电镜(SEM)观察，结
果如图 2 所示。从图中可以看出，图 2a 中央为典型
的球形胚，生长于愈伤组织的表面，该球形胚表面光
滑、饱满致密。其周围愈伤组织的表面覆盖着一些愈
伤组织颗粒，大多塌陷、空瘪或皱缩，为老化的愈伤组
织。图 2b中所示为心形胚，其表面也较光滑，细胞排
列紧密;该心形胚的顶端凹陷(箭头所示处)，周围凸
起可能为子叶原基位置所在。心形胚的表面还残存
少量老化的愈伤组织细胞。图 2c 所示为典型的鱼雷
胚。鱼雷胚的表面光滑、组织致密、细胞排列整齐有
序，其上端为未成熟的、早期的子叶，下端为胚轴端，继
续生长将发育形成胚根。图 2d所示为成熟的子叶胚。
子叶已经成熟，两片子叶中间已经形成早期的真叶。
应用研究 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗
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图 2 滇楸体细胞胚胎发生扫描电镜观察
2． 1． 2 滇楸体细胞胚胎发生细胞及组织结构变化
通过对体细胞胚胎发育的过程中不同发育阶段
材料的石蜡切片观察，分析体细胞胚胎发育过程中材
料的细胞和组织结构变化情况，结果如图 3 所示。图
3a和 3b分别为非胚性和胚性愈伤组织的切片。非
胚性愈伤组织由大的薄壁细胞组成，细胞大且排列不
规则，细胞质极其稀少;而胚性愈伤组织的细胞排列
紧密而整齐，胞内呈蓝绿色表明胚性愈伤组织的细胞
质浓厚，这可能与后期体胚分化所需的物质积累有
关。图 3c中可看到不同分化程度的体细胞原胚，箭
头所示处可见单细胞、两细胞和多细胞原胚，它们与
周围的细胞排列不规则且存在明显的间隙，而组成原
胚的 2 个或 4 个细胞之间的排列却非常整齐而紧密。
该图中还可看出，滇楸的体细胞胚胎发育起源于单个
胚性细胞。图 3d、3e 和 3f 分别为球形、心形和鱼雷
形胚。球形胚外 2 ～ 3 层细胞排列整齐且比内层细胞
小，而内层细胞排列相对不规则;心形胚的细胞排列
相对较为紧密、细胞质更加浓厚;鱼雷胚的表面 1 ～ 2
层细胞排列整齐规则，而内部的细胞大而不规则、细
胞质稀疏。
图 3 滇楸体细胞胚胎发生石蜡切片观察
2． 2 滇楸体细胞胚胎发生过程中的生理生化响应
2． 2． 1 3 种抗氧化酶活性的变化
有研究报道，活性氧代谢不仅与逆境胁迫、器官
老化有关，还参与某些基因表达调控和细胞分化，在
胚状体发生的过程中、细胞的分化也受活性氧代谢影
响［11－14］。本实验对滇楸体胚发生过程中的 3 种抗氧
化酶活性进行了研究，结果如图 4 所示。就抗氧化酶
活性的总体水平来看，SOD、POD 酶活性在体细胞胚
胎发生、发育的过程中维持相对较高的水平，而 CAT
酶则维持在相对较低的水平。就变化趋势来说，3 种
抗氧化酶活性在胚性愈伤组织的诱导初期均显著下
降，这可能与材料的培养方式转变有关，培养物从固
体培养方式转变为液体悬浮培养时受到机械损伤和
环境刺激导致了超氧阴离子自由基和 H2O2 等活性
氧的大量积累，3 种抗氧化酶大量分解，含量下降，活
性降低。
伴随胚性愈伤的形成和体胚的发生，POD 和
CAT酶活性稳步上升，材料 5 阶段达到最高，维持了
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 应用研究
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较高的活性氧代谢水平，保护胚性细胞和早期体胚细
胞的膜结构。胚性愈伤和体胚抗逆境胁迫能力的增
强，对胚性细胞的形成、体胚的发生具有重要的作用。
SOD酶活性在此过程中总体上升，材料 5 阶段最高，
但由胚性愈伤到体胚诱导发生时其酶活性迅速下降，
可能对体细胞胚胎的诱导发生具有一定的调节作用。
图 4 抗氧化酶活性的变化
从材料 5 到近成熟的体胚过程中，3 种抗氧化物
酶活性均下降，可能在体胚逐渐成熟的过程中活性氧
代谢水平相对较低，诱导了抗氧化酶活性的降低。在
成熟体胚萌发成幼苗的过程中 POD 酶活性逐渐下
降，SOD酶活性先上升、后下降，CAT 酶活性则逐渐
上升，这可能与体胚成熟、萌发，真叶、根系、胚轴等器
官的生长和分化有关，这 3 种抗氧化酶对体胚萌发成
幼苗具有不同的调控作用。
2． 2． 2 淀粉和可溶性糖含量的变化
在体胚发生和发育的重要转折期，一般均伴有糖
类的积累或消耗。多数研究表明在胚性细胞分化和
分裂期及胚状体发生时均有糖和淀粉累积［15－18］，胚
性愈伤的形成和胚状体的分化均需一定的糖类营养
物质积累。本试验中，滇楸体胚发生和发育过程中淀
粉和可溶性糖含量变化如图 5 所示。
图 5 体细胞胚胎发生过程的淀粉和可溶性糖含量的变化
可溶性糖含量的变化表现为先上升、后下降、再
上升的趋势，即在胚性愈伤组织诱导和体细胞胚胎发
生早期不断积累，在材料 4 中即胚性愈伤与早期体胚
混合物中可溶性糖的含量达到最高值，这可能为体胚
的分化和成熟奠定物质和能量基础;随着体胚的不断
分化和发育成熟，样品的可溶性糖逐渐被消耗，直至
达到近成熟体胚阶段，可溶性糖含量降到最低;在成
熟体胚的萌发过程中可溶性糖的含量又逐渐上升，此
时的样品根系逐渐分化和伸长，有利于营养物质的吸
收和积累，同时为幼苗进一步的器官分化提供物质和
能量。滇楸体胚发生和发育过程中淀粉含量的变化
趋势与可溶性糖含量的变化趋势基本一致，但是材料
4 阶段淀粉含量急剧下降，说明体胚的分化过程可能
需要消耗大量的淀粉，因此我们认为体胚诱导过程
中，前期胚性愈伤组织内淀粉的积累对体胚的分化有
重要的促进作用。
2． 2． 3 可溶性蛋白和游离氨基酸含量的变化
作为植物生长发育所需的重要物质蛋白质和氨
基酸，在胚状体的发生和发育过程中具有非常重要的
意义。多数研究结果表明胚性比非胚性愈伤组织的
蛋白质和氨基酸总量明显高［19－21］，这可能与胚状体
发生前的营养物质积累有关。本研究中，滇楸体胚发
生和发育过程中可溶性蛋白和游离氨基酸含量的变
化如图 6 所示。
图 6 体细胞胚胎发生过程的可溶性蛋白质与
游离氨基酸含量的变化
在胚性愈伤诱导和体胚发生初期可溶性蛋白质
和游离氨基酸含量均呈现不断上升的趋势，这表明胚
性愈伤组织的形成和体细胞胚胎的发生需要大量的
物质和能量积累，主要来自于外源的培养基。随后，
在体细胞胚胎的发育、成熟和萌发过程中游离氨基酸
和可溶性蛋白含量变化基本呈现相反的变化趋势。
在体胚成熟的早期，球形胚逐渐向心形胚和鱼雷胚发
育，样本游离氨基酸含量下降，可溶性蛋白含量不断
增加;从体胚发育后期即子叶胚形成和发育过程中，
可溶性蛋白含量逐渐下降而游离氨基酸含量逐渐增
加;体胚萌发成苗的过程中，可溶性蛋白含量又逐渐
应用研究 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗
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增加，而游离氨基酸急剧下降，此过程中根系开始萌
发、胚轴不断伸长、真叶逐渐形成，器官分化明显，蛋
白质不断积累。
3 结论与讨论
通过石蜡切片观察，滇楸非胚性愈伤和胚性愈伤
组织在细胞形态和结构上具有明显的差异。滇楸体
细胞胚胎发生是起源于单个胚性细胞，其发育过程经
历了典型的单细胞原胚、多细胞原胚、球形胚、心形
胚、鱼雷胚和子叶胚各个重要阶段。扫描电镜观察结
果也揭示了滇楸体胚的发生过程中经历的球形、心
形、鱼雷形和子叶胚典型结构和形貌。
在胚性愈伤和体胚诱导形成期，3 种抗氧化酶活
性逐渐提高，有利于胚性细胞分化和体胚形成，在由
梨形和鱼雷胚组成的胚状体中，氧化酶活性较高，该
阶段的胚状体抗胁迫能力增强。在体胚成熟和萌发
成苗的过程中，3 种抗氧化酶的活性变化趋势差异很
大，这可能与体胚后期成熟、萌发，真叶、根系、胚轴等
器官的生长和分化有关。不同抗氧化酶可能对细胞
分化具有不同的调控作用，有关研究也报道了活性氧
代谢参与某些基因表达调控和细胞分化［11－14］。
本研究结果还证实碳、氮类营养物质的积累对于
体胚的发生具有重大意义，特别是在胚性愈伤形成阶
段，胚性愈伤组织内需积累大量的营养物质，为体细
胞胚胎的分化和发育奠定能量和物质基础。在胚状
体发育到成熟的过程中，体内积累的糖类物质被消
耗，而后由于胚状体的萌发，子叶与胚根的形成有利
于碳水化合物的吸收与合成，碳类物质又在胚状体内
形成积累。值得关注的是淀粉在胚状体的诱导形成
期被大量消耗，除为体胚分化的早期提供了必需的营
养物质和能量外，还可能与体胚的形态建成有着密切
的关系［23］。此过程中，游离氨基酸和可溶性蛋白含
量则出呈现相反的变化趋势，这与胚状体的发育成
熟、器官生长和分化密切相关。
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( 责任编辑 史 洁)
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 应用研究