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微波提取法优选海州常山叶总黄酮的提取工艺



全 文 :·贮藏保鲜加工· 北方园艺2016(10):118~122
第一作者简介:张颖(1981-),女,硕士,讲师,现主要从事生物分离
与细胞工程的教学与研究等工作。E-mail:zemn@sina.com.
基金项目:攀枝花学院校级资助项目 (2014YB34)。
收稿日期:2015-12-16
DOI:10.11937/bfyy.201610030
微波提取法优选海州常山叶总黄酮的提取工艺
张   颖1,2,杨   舸3
(1.攀枝花学院 生物与化学工程学院,四川 攀枝花617000;2.干热河谷特色生物资源研发四川省高校重点实验室,
四川 攀枝花617000;3.攀枝花市食品与药品检验所,四川 攀枝花617000)
  摘 要:以海州常山干叶粉末为试材,采用微波技术提取总黄酮粗品,并通过紫外-可见分光
光度计测定样品液黄酮含量,以总黄酮提取量为考察指标,研究了料液比、乙醇浓度、提取时间和
提取温度等工艺条件对提效的影响,设计了4因素3水平正交实验,进一步对提取海州常山叶总
黄酮的工艺条件进行优化。结果表明:提取海州常山叶总黄酮较佳的提取条件为预浸泡2h,微波功
率200W,提取温度60℃,乙醇溶液浓度70%,料液比1∶35g·mL-1,微波提取2次,每次3min,提
取总黄酮量达71.15mg·g-1;微波提取技术应用于海州常山叶总黄酮的提取工艺可行,该技术
可为海州常山植物资源的开发和利用提供参考依据。
关键词:海州常山;黄酮;正交实验;提取
中图分类号:Q 946 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2016)10-0118-05
  海州常山(Clerodendrum trichotomumThunb.)属马
鞭草科赪桐属木本植物,分布于我国华东、华北、西南等
地,也见于日本、菲律宾等国家[1],是集生态造林、园林绿
化、药用、食用等多种用途的优良植物[2]。海州常山植
株中富含多种生物活性物质,如黄酮类、生物碱类、糖苷
类、挥发油类等,且多分布于叶和嫩枝等部位[3-4]。现已
证实,黄酮类物质有利于免疫调节,对辐射、氧化、肿瘤、
炎症、病毒、真菌等具有较好的抵抗作用[5-8]。海州常山
中的黄酮类成分自20世纪60年代即在国内开始分离,
目前共发现有芹菜素、车前草苷、海常素、海州常山苷、
臭梧桐素等8种黄酮化合物[9-11]。溶剂法、微波法、超声
波法、酶解法、超临界萃取法、双相萃取法等均适用于黄
酮类物质的提取[12-14]。
攀西地区的干热河谷气候条件非常适合海州常
山生长,多见野生,也有人工种植。海州常山在民间
被称为斑鸠菜,其叶及嫩芽等部位食用价值高,深受
消费者青睐。关于海州常山植株有效成分的提取工
艺研究尚鲜见报道,该研究尝试把微波技术应用到海
州常山叶总黄酮的提取工艺中,利用正交实验法优选
海州常山叶总黄酮提取的工艺条件,以期为海州常山
植株可利用的药用和食用有效成分研究提供一定的
参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
  供试海州常山叶采集于攀枝花市米易县山区。选
择新鲜且呈中绿叶龄叶片自然晒干后,置入恒温干燥器
中于60℃条件烘干至恒重,再将叶片去除叶柄后进行
粉碎,过60目筛备用。
供试试剂:芦丁标准品(纯度≥98%,上海金穗生物
科技有限公司);石油醚(60~90℃AR),无水乙醇(AR),
硝酸铝(AR),氢氧化钠(AR)(成都市科龙化工试剂厂);
亚硝酸钠(AR)(天津市化学试剂厂六厂三分厂)。
供试仪器:MKX-J1-3实验室微波炉(青岛迈可威微
波应用技术有限公司);HH-8数显恒温循环水浴锅(郑
州杜甫仪器厂);YP202N分析天平(上海恒平科学仪器有
限公司);HR/06/BC粉碎机(珠海飞利浦家庭仪器有限公
司);02-2AB电热恒温干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公
司);722型紫外分光光度计(上海箐华科技仪器有限公
司);AP-01旋转蒸发仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公
司);60MAQM-100纯水仪(北京中西远大科技有限公
司)。
1.2 试验方法
1.2.1 黄酮类物质提取流程
811
北方园艺2016(10):118~122 ·贮藏保鲜加工·
1.2.2 标准曲线制作 精密称取芦丁标准品10mg
(105℃干燥至恒温),用适量60%乙醇溶液溶解芦丁后水浴
条件放冷,并定容至100mL,即得浓度为0.1mg·mL-1的
芦丁标准溶液。用电子天平分别称取5g NaNO2、10g
Al(NO3)3、5g NaOH加入去离子水分别稀释定容至
100mL容量瓶中,即得5%的NaNO2、10%的Al(NO3)3、
5%的NaOH溶液。用移液管精密移取0.0、1.0、2.0、
3.0、4.0、5.0mL的芦丁标准品溶液,分别置于10mL比
色管中,依次在6个比色管中各加入5% NaNO2 溶液
0.3mL,摇匀静置5min后分别加入10% Al(NO3)3 溶
液0.3mL,摇匀静置5min,然后加5% NaOH 溶液
4mL,最后用60%乙醇稀释至刻度,摇匀静置10min[15],
在吸收波长510nm下测定吸光值。绘制标准曲线时,
以空白校正零点,溶液质量浓度x(mg·mL-1)为横坐
标,吸光值y为纵坐标,得到回归方程,见图1。
图1 芦丁标准曲线
Fig.1 Standed curve of rutin
1.2.3 粗品总黄酮提取量计算方法 称取10mg干燥
的黄酮粗品,用60%乙醇溶液溶解定容至100mL。用
量筒取4mL待测粗品溶液,置于10mL的比色管中,依
次加入5%NaNO2 溶液0.3mL,摇匀静置5min,之后
分别加入10%Al(NO3)3溶液0.3mL,摇匀静置5min,
然后加5%NaOH溶液4mL,最后用60%乙醇稀释至
刻度,摇匀静置10min,以空白校正零点,用可见光分光
光度计于510nm处检测其吸光度。根据测得的吸光度
数据及标准曲线,计算黄酮粗提物中的黄酮提取量:吸
光度A=12.954X-0.019 5;总黄酮提取量(mg·g-1)=
M粗×(X×N×V样/W样×103)
M料
;其中,X表示样品溶液中
黄酮浓度(mg·mL-1);N表示稀释倍;M粗表示粗产品干
重(g);M料表示用于提取的海州常山叶粉干重(g);V样表
示定量体积(mL);W样表示称取的粗产品质量(mg)。
1.2.4 单因素试验 预浸泡处理对海州常山叶总黄酮提
取工艺的影响:称取原料4g,设定料液比1∶15g·mL-1,
提取温度70℃,微波功率100W,乙醇溶液浓度60%,
分别在常温条件下预浸泡0、1、2、4、6h后,进行微波提
取2min,每组3个平行试验,研究预浸泡处理对海州常
山叶总黄酮提取工艺的影响。微波功率对海州常山叶总
黄酮提取工艺的影响:称取原料4g,设定料液比1∶
15g·mL-1,提取温度70℃,用60%乙醇溶液分别在
100、200、300、400、500W不同功率条件下提取2min,每
组3个平行试验,研究微波功率对海州常山叶总黄酮提
取工艺的影响。提取时间对海州常山叶总黄酮提取工
艺的影响:称取原料4g,设定料液比1∶15g·mL-1,提
取温度70℃,微波功率100W,用60%乙醇溶液分别提取
1、2、3、4、5min,每组3个平行试验,研究提取时间对海州
常山叶总黄酮提取工艺的影响,因微波提取是间歇式提
取,提取时间的记录不包括停止间隔时间。提取剂浓度
(V/V)对海州常山叶总黄酮提取工艺的影响:称取原料
4g,设定料液比1∶15g·mL-1,提取温度70℃,微波
功率100W,分别用40%、50%、60%、70%、80%的乙醇
溶液提取2min,每组3个平行试验,研究提取剂浓度对
海州常山叶总黄酮提取工艺的影响。料液比对海州常
山叶总黄酮提取工艺的影响:称取原料4g,微波功率
100W,提取温度70℃,分别采用1∶10、1∶15、1∶20、
1∶30、1∶40g·mL-1的料液比条件(W/V),用60%乙
醇溶液提取2min,每组3个平行试验,研究料液比对海
州常山叶总黄酮提取工艺的影响。提取温度对海州常
山叶总黄酮提取工艺的影响:称取原料4g,设定料液比
1∶15g·mL-1,微波功率100W,用60%乙醇溶液分别
在40、50、60、70、80℃条件下提取2min,每组3个平行
试验,研究温度对海州常山叶总黄酮提取工艺的影响。
1.2.5 正交实验 该研究所用试验微波炉为开放式系
统,温度一定时微波功率会自动调节,因此以温度作为
工艺参数比微波功率更准确,结合其它的相关研
究[16-20],根据单因素确定微波功率200W,选择提取温
度、乙醇浓度、提取时间和料液比为海州常山叶总黄酮提
取工艺研究考察因素,每因素拟定3个水平,运用L9(34)
正交表(表1),研究海州常山叶总黄酮的最佳提取工艺
条件。
表1 因素与水平
  Table 1 Factors and levels
水平
Level
因素Factors
A提取温度
Extraction
temperature/℃
B提取时间
Extraction
time/min
C提取剂浓度
Extractant
concentration/%
D料液比
Material-liquid ratio
/(g·mL-1)
1  50  2.5  50  1∶25
2  60  3.0  60  1∶30
3  70  3.5  70  1∶35
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 预浸泡处理 由图2可知,原料经过提取剂一定
时间的常温浸泡后提取得到总黄酮量高于不经过提取
剂常温浸泡处理的结果。当预浸泡时间超过2h后,总
黄酮提取量变化不大,故选择提取剂预浸泡2h后进行
微波提取。
911
·贮藏保鲜加工· 北方园艺2016(10):118~122
图2 乙醇预浸泡与总黄酮提取量
Fig.2 Presoaking and the yield of total flavoniod
2.1.2 微波功率的选择 由图3可知,在一定范围内,
功率增大,总黄酮提取量随之提高,微波功率达200W
提取效果最好,随后提取量反而减少。微波功率增加后
会使得加热速率变大,渗透扩散等作用加快,有利于植
物材料中黄酮对微波能的吸收,使目标成分更容易被溶
出,提取量增大。微波功率过大,温度变化快,可能会导
致黄酮结构降解,甚至引起爆沸现象。故微波功率选择
200W。
图3 微波功率与总黄酮提取量
Fig.3 Microwave power and the yield of total flavoniod
2.1.3 提取时间的选择 由图4可知,在一定范围内,
黄酮提取量随提取时间的增加而提高。3min时提取量
最高,随后提取时间越长,提取量反而降低。可能原因
是微波长时间的作用导致黄酮结构分解,且容易造成其
它成分浸出。故提取时间选择3min为佳。
图4 提取时间与总黄酮提取量
Fig.4 Extraction time and the yield of total flavoniod
2.1.4 提取剂浓度的选择 由图5可知,在一定范围内
随着提取剂乙醇的浓度增大,总黄酮提取量相应增大。
当乙醇浓度高于70%时,提取量呈减小趋势。提取剂浓
度过高,可能导致其它生物成分也一并溶出;也可能由
于较高的乙醇浓度引起胞内蛋白质变性,影响总黄酮的
溶出。故选择提取剂浓度60%较佳。
图5 提取剂浓度与总黄酮提取量
Fig.5 The concentrations of the extractant and
the yield of total flavoniod
2.1.5 料液比的选择 由图6可知,在其它条件不变的
情况下,料液比增大,总黄酮提取量随之增高,料液比达
1∶30g·mL-1时提取效果最好。料液比增加到1∶
40g·mL-1,提取量略有下降。适当的料液比可以使
黄酮物质以一定的浓度差浸出,溶剂增加到一定程度时
也会浸出其它物质。料液比太低,提取不充分;料液比
太高,因其它成分溶出而导致黄酮浸出效率变低,也可
能会导致微波热能负荷增大,溶剂竞争吸收微波能量改
变提取的温度环境,不利于黄酮的浸出,同时影响后续
浓缩等操作,增大工艺成本。故选择提取总黄酮的料液
比为1∶30g·mL-1为宜。
图6 料液比与总黄酮提取量
Fig.6 Material-liquid ratio and the yield of total flavoniod
2.1.6 温度的选择 当提取温度逐渐上升时,总黄酮
提取量也随之上升,60 ℃ 时提取量最高,达到
52.06mg·g-1。而当温度由60℃上升至80℃的过
程中,提取量反而下降。低温条件会影响黄酮物质在
提取剂中的溶解度,温度升高同时溶解度提高,因此提
取量增大。而温度过高时,可能会导致黄酮的生物活
性结构改变,从而影响黄酮的实际提取量。故提取总黄
酮的温度条件选择60℃。 
2.2 正交实验
由正交实验结果可知(表2),试验组中第4组工
艺条 件 组 合 得 到 的 总 黄 酮 提 取 量 最 高,可 达
021
北方园艺2016(10):118~122 ·贮藏保鲜加工·
图7 提取温度与总黄酮提取量
Fig.7 Extraction temperatures and the yield of total flavoniod
70.22mg·g-1。4个工艺因素对海州常山叶总黄酮提
取量的影响效果依次为温度>料液比>乙醇浓度>提取
时间。通过方差分析(表3),提取温度和料液比2个因素
的F值均大于临界值,说明料液比和温度在α=0.05水平
上对海州常山叶总黄酮提取量的影响显著,具有统计学意
义。而提取时间和乙醇浓度在α=0.05水平上对总黄酮
提取量的影响不显著。
表2 正交实验结果
  Table 2 Result of orthogonal experiments
试验组
Experimental group
A  B  C  D
黄酮提取量The yield
of flavoniod/(mg·g-1)
1  50  2.5  50  1∶25  43.06
2  50  3.0  60  1∶30  53.46
3  50  3.5  70  1∶35  55.07
4  60  2.5  60  1∶35  70.22
5  60  3.0  70  1∶25  62.93
6  60  3.5  50  1∶30  68.54
7  70  2.5  70  1∶30  64.17
8  70  3.0  50  1∶35  65.55
9  70  3.5  60  1∶25  57.01
K1  50.530  59.150 59.050 54.333
K2  67.230  60.647 60.230 62.057
K3  62.243  60.207 60.723 63.613
R  16.700  1.497 1.673  9.280
  表3 方差分析表
  Table 3 Variance analysis
因素
Factor
偏差平方和
Sum of squares
自由度
df
F值
F-value
F临界值
Critical value
显著性
Significance
提取温度Temperatures  440.959  2  99.405  19.000 *
提取时间Time  3.550  2  0.800  19.000
提取剂浓度Concentrations  4.436  2  1.000  19.000
料液比Liquid-material ratio  148.191  2  33.406  19.000 *
误差Error  4.44  2
F(α=0.05)
2.3 验证试验
综合均值的选择(表2)以及工艺成本等因素,选取
A2B2C3D3工艺条件进行3次验证,黄酮提取量均值为
71.15mg·g-1。可确定正交实验中海州常山叶总黄酮
提取的最佳提取工艺参数为提取温度60℃,提取时间
3min,乙醇溶液浓度70%,料液比1∶35g·mL-1。
3 结论
原料经过提取剂一定时间的常温浸泡后,更有利于
对微波能的吸收、破壁和渗透等作用。微波辅助提取技
术用于黄酮类化合物提取时可缩短工艺时间,处理方
便,有利于降低经济和环境成本。该提取技术可为海州
常山植物资源的开发和利用提供研究依据。该研究考
察的工艺因素有限,对提取剂种类的影响、选择性加热
等问题还有待进一步研究。
通过单因素试验研究了预浸泡处理、微波功率、提
取时间、乙醇浓度、料液比和提取温度等条件与海州常
山叶总黄酮提取量的关系。经过分析比较设计了4因
素3水平正交实验,以确定最佳的提取工艺条件。结果
表明,预浸泡2h,乙醇溶液浓度70%,微波功率200W,
料液比1∶35g·mL-1,在60℃条件下微波提取2次(每
次3min),海州常山叶总黄酮提取量可达71.15mg·g-1。
参考文献
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121
·贮藏保鲜加工· 北方园艺2016(10):122~126
第一作者简介:高媛(1988-),女,山东日照人,硕士研究生,研究方
向为植物保护。E-mail:elfish521@163.com.
责任作者:顾沛雯(1969-),女,宁夏银川人,博士,教授,硕士生导
师,现主要从事植物保护等研究工作。E-mail:gupeiwen2013@
126.com.
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (31260452)。
收稿日期:2016-02-14
DOI:10.11937/bfyy.201610031
HPLC法分离测定苦豆子愈伤组织
喹诺里西啶生物碱含量及体系优化
高   媛1,李   鹏2,张 庆 宸3,徐 全 智1,孙 牧 笛1,顾 沛 雯1
(1.宁夏大学 农学院,宁夏 银川750021;2.宁夏大学 化工学院,宁夏 银川750021;3.山东大学 药学院,山东 济南250100)
  摘 要:以苦豆子愈伤组织为试材,采用高效液相色谱法,分离并测定苦豆子愈伤组织中氧
化槐果碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱和苦参碱,建立了这5种单碱分离、测定的色谱方法。结
果表明:色谱条件为Ultimate?AQ-C18(4.6μm×250mm×5mm);流动相为0.01mol·L
-1磷
酸缓冲液(K2HPO4=5.59g·L-1,KH2PO4=0.41g·L-1,pH 7.5)-甲醇(50∶50,V/V);检测波长
为216nm;柱温为35℃;流速为1.0mL·min-1,检测苦豆子愈伤组织中含有5种生物单碱,其中氧
化槐果碱和槐定碱在苦豆子愈伤组织继代培养第4代时含量相对较高,分别为1.205 6mg·g-1和
0.116 5mg·g-1,氧化苦参碱、槐果碱、苦参碱的含量略有波动,大致呈下降趋势。
关键词:苦豆子愈伤组织;HPLC;氧化槐果碱;氧化苦参碱;槐定碱;槐果碱;苦参碱
中图分类号:Q 946 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2016)10-0122-05
  苦豆子(Sophora alopecuroides L.)属豆科槐属植
物,主要分布于我国北方的荒漠、半荒漠地区。近年研
        
究发现,苦豆子中富含生物碱,具有清热解毒、驱风燥
湿、抗菌杀虫、抗肿瘤、免疫等多种功效,且有重要的药
用价值和经济价值[1]。据报道,从苦豆子植物中分离到
20多种生物碱,主要成分为槐果碱、槐定碱、苦参碱、氧
化槐果碱、氧化苦参碱、槐胺碱、金雀花碱等,这些成分
具有抗肿瘤作用。其中苦参碱和槐定碱,氧化苦参碱和
氧化槐定碱,槐果碱和苦豆碱等均分别属于同分异构
体,在不同条件下各成分间可能存在生物转化,分离难
度大[2]


Extraction Process Optimization of Total Flavoniod FromClerodendron
trichotomumLeaves by Microwave Technology
ZHANG Ying1,2,YANG Ge3
(1.Colege of Biological and Chemistry Engineering,Panzhihua University,Panzhihua,Sichuan 617000;2.Key Laboratory of Dry-hot Valey
Characteristic Bio-Resources Development at University of Sichuan Province,Panzhihua,Sichuan 617000;3.Panzhihua Institution for Food and
Drug Control,Panzhihua,Sichuan 617000)
Abstract:Taking Clerodendron trichotomumleaves as material,using microwave technology to extract total flavoniod,the
flavoniod contents were evaluated by ultraviolet and visible spectrophotometer.The efect of material-liquid ratios,ethanol
concentration,extraction temperatures and extraction time were investigated using the yields of total flavoniod as index.The
optimum extraction process conditions of total flavoniod were studied by the orthogonal design after single factor
experiments.The results showed that the optimum extraction conditions were as folows:presoaking for 2hours,microwave
power 200W,ethanol concentration 70%,temperature 60℃,material-liquid ratio 1∶35g·mL-1,extracting by 2times,and
each time for 3minutes,the yield of total flavoniod could reach 71.15mg·g-1.Microwave technology was feasible for
flavoniod extraction,and it also could lay a foundation for further utilization of Clerodendron trichotomum.
Keywords:Clerodendron trichotomum;flavoniod;orthogonal design;extraction
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