全 文 ：第 33 卷 第 9 期
2014 年 9 月
分析测试学报
FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)
Vol. 33 No. 9
1073 ～ 1077
收稿日期:2014 － 04 － 20;修回日期:2014 － 05 － 10
* 通讯作者:樊轻亚，硕士，讲师，研究方向:药物提取分离及分析，Tel:0376 － 6281969，E － mail:fqy2006hn@ 163. com
doi:10. 3969 / j. issn. 1004 －4957. 2014. 09. 015
聚焦微波辅助提取 /HPLC法测定
倒提壶中天芥菜碱的含量
樊轻亚1* ，吴长忠1，王万好2
(1． 信阳职业技术学院 药学院，河南 信阳 464000;2． 河南同源制药有限公司，河南 信阳 464000)
摘 要:采用正交实验方法对聚焦微波辅助提取(FMAE)的实验条件进行优化，以天芥菜碱为提取目标物，
HPLC法测定其含量。通过优化，得到最佳实验条件:药材粒度 60 目，液料比 1 ∶ 35，微波功率420 W，微
波时间 50 min。HPLC分析条件:以甲醇 － 0. 05%三乙胺(pH 7. 5)(30 ∶ 70)为流动相，在 220 nm处检测，天
芥菜碱的线性范围为 52 ～ 1 040 mg /L，相关系数(r)为 0. 999 9，检出限为 0. 040 2 mg /L，其加标回收率为
97. 5%～ 103%，相对标准偏差为 2. 4%，方法简单、灵敏度高。
关键词:聚焦微波辅助提取;倒提壶;天芥菜碱;高效液相色谱法
中图分类号:O657. 72;TQ460. 72 文献标识码:A 文章编号:1004 － 4957(2014)09 － 1073 － 05
Determination of Heliotrine in Cynoglossum amabile Stapf et Drumm
by HPLC with Focused Microwave-assisted Extraction
FAN Qing-ya1* ，WU Chang-zhong1，WANG Wan-hao2
(1． Department of Pharmacy，Xinyang Vocational and Technical College，Xinyang 464000，China;
2． Pharmaceutical Co．，Ltd．，Henan Tongyuan，Xinyang 464000，China)
Abstract:An extraction method of heliotrine was developed by focused microwave-assisted extraction
(FMAE)． Orthogonal design was used to optimize the experimental conditions． The optimum extrac-
tion conditions were as follows:60 mesh size of material，solvent － materail ratio:1 ∶ 35，micro-
wave power:420 W and extraction time:50 min． The analyte was determined by HPLC using meth-
anol － 0. 05% triethylamine(pH 7. 5 )(30 ∶ 70)as mobile phase with a detection wavelength of 220
nm． The linear range of heliotrine was in the range of 52 － 1 040 mg /L(r = 0. 999 9)，with a detec-
tion limit of 0. 040 2 mg /L． The recoveries for heliotrine were in the range of 97. 5% － 103% with
ＲSDs of 2. 4% ． The method was simple and highly sensitive．
Key words: focused microwave-assisted extraction;Cynoglossum amabile Stapf et Drumm;he-
liotrine;high performance liquid chromatography(HPLC)
倒提壶(Cynoglossum amabile Stapf et Drumm)是紫草科琉璃草属植物，多年生草本，分布于我国西
南各省区。倒提壶全草入药，其味苦，性凉，有清热利湿、散瘀止血、止咳、镇痛之功效，是布依族、
苗族、彝族、纳西族等常用来治疗疟疾、肝炎、痢疾、咳嗽、风湿性关节炎、尿道炎等症的民族药
物［1 － 3］。生物碱是本属植物的主要成分，有着广泛的药理和毒理活性，如抗肿瘤、抗菌、抑制微生物
以及肝毒性等。天芥菜碱是其中含量较多的成分。Pandey 等［4］对天芥菜碱(Heliotrine)进行了药理研
究，发现天芥菜碱能显著降低尼古丁所致的神经节激动效应(痉挛反应)。研究发现，天芥菜碱对实验
肿瘤系统 walker － 256 系统有显著活性，且抑制新月型念珠球菌的活性较强，对热带念珠球菌有最大抑
制活性［5 － 6］。姚志道等［7］以倒提壶制成的天芥合剂有一定的抑制中枢神经作用，其用量小，无明显毒
副作用。近年来微波辅助提取技术(Microwave-assisted extraction，MAE)正逐步应用于中药有效成分的
提取［8 － 16］。微波辅助提取根据装置的不同可分为聚焦微波辅助提取(FMAE)和密闭微波辅助提取
(PMAE)两种。本文以药材倒提壶作为研究对象，将 FMAE 技术应用于倒提壶中天芥菜碱的提取，用
高效液相色谱法测定其中的天芥菜碱含量，建立了聚焦微波辅助提取 /HPLC 测定天芥菜碱含量的分析
1074 分析测试学报 第 33 卷
方法，可为天芥菜碱提取工艺的设计提供依据，同时为进一步了解倒提壶中天芥菜碱含量的分布及其
后续研究开发提供基础。
1 实验部分
1. 1 仪器、试剂与材料
P8023CTL-K4 微波炉(格兰仕公司);ＲE － 52 AA 型旋转蒸发器(上海雅荣生化设备仪器有限公
司);LC －10 Atvp，SPD －10 Avp高效液相色谱仪(日本岛津公司);SHZ － D(A)循环水式多用真空泵
(天津华鑫仪器厂);B －260 型恒温水浴(上海雅荣生化设备仪器有限公司);pHS － 25 数显酸度计(上
海虹益仪器仪表有限公司)。
天芥菜碱对照品(纯度为 98. 5%，成都普瑞法科技开发有限公司);盐酸、氢氧化钠、95%乙醇、
无水乙醇、三乙胺、冰醋酸、氯仿、甲醇(分析纯，郑州德众化学试剂厂);甲醇(色谱纯，Merck 公
司);倒提壶(产地安徽，亳州市药材有限公司，批号 20130601，20130603，20130801)经信阳职业技
术学院中药鉴定学教研室吴长忠老师鉴定为倒提壶(Cynoglossum amabile Stapf et Drumm)全草。天芥菜
碱标准溶液:精密称取天芥菜碱对照品 50 mg，用甲醇稀释定容至 50 mL 容量瓶中，配成浓度为 1. 00
mg /mL的标准储备液，密封，置于冰箱内保存，使用时按需逐级稀释。
0. 05%三乙胺水溶液(pH 7. 5):精密量取 1 mL三乙胺于 2 000 mL水中，用冰醋酸调节至 pH 7. 5。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 FMAE提取 精密称取 2. 0 g 60 目的倒提壶药材于 150 mL烧瓶中，加入 60 mL 乙醇，放入微
波炉，在烧瓶下方放置 2 000 mL水，以中火微波功率辐射回流 50 min。
1. 2. 2 溶剂回流提取 精密称取 2. 0 g 60 目的倒提壶药材于 150 mL 烧瓶中，加入 60 mL 乙醇，100
℃水浴回流 50 min。
1. 2. 3 提取液的纯化 将提取液减压抽滤，滤液旋干，用 30 mL 稀盐酸溶液(pH 2. 0)超声溶解，倾
出，置于分液漏斗，用氯仿萃取后的水相以 1%NaOH溶液调至 pH 10. 0，再用氯仿萃取，收集氯仿层，
旋干，用甲醇溶解并定容于 10 mL容量瓶中，精密移取 1 mL定容于 10 mL容量瓶中，备用。
1. 2. 4 HPLC含量测定 将上述提取液稀释后通过 0. 45 μm滤膜，然后在 HPLC仪上按下述色谱条件
测定:色谱柱 Phenomenex Luna C18(5 μm，250 mm × 4. 6 mm)，分别以甲醇 － 0. 05%三乙胺(pH 7. 5)
(30 ∶ 70)为流动相，流速为 1. 0 mL /min，检测波长为 220 nm，进样量为 10 μL，柱温:室温。
2 结果与讨论
2. 1 FMAE提取条件选择
2. 1. 1 FMAE提取装置 本文所采用的 FMAE 提取装置是在家用微波炉与回流冷凝装置的基础上结
合改装而成。因上方有小孔，在 FMAE提取过程中容易引起局部受热不均而产生暴沸的情况，使部分
药材随溶剂喷上冷凝管，造成不必要的损失。为改善及控制该情况，可在微波炉内放入适量自来水分
散微波功率，以控制暴沸情况。同时，还应用锡纸密封微波炉与回流冷凝装置接口处，以防止微波
泄漏。
图 1 不同溶剂对天芥菜碱提取率的影响
Fig. 1 Effect of different solvents on yield of heliotrine
2. 1. 2 提取溶剂的选择与提取次数的影响 分别
以甲醇、95%乙醇、0. 3%酸水、水作为溶剂，研究
了不同溶剂对天芥菜碱提取率的影响(见图 1)。由
图 1 可以看出，天芥菜碱在甲醇中的提取率略高于
95%乙醇，而在水中的提取率最小。由于甲醇毒性
较大，故本文选择 95%乙醇作为提取溶剂。进一步
对天芥菜碱的提取次数进行单因素考察，由图 2 可
看出，提取第 2 次后天芥菜碱的总提取率已超过
90%，考虑到溶剂耗量及回收等经济性问题，提取
次数以 2 次为宜。
第 9 期 樊轻亚等:聚焦微波辅助提取 /HPLC法测定倒提壶中天芥菜碱的含量 1075
图 2 提取次数对天芥菜碱提取效率的影响
Fig. 2 Effect of extraction times on yield of heliotrine
2. 1. 3 微波辐射条件的选择 以天芥菜碱作
为目标物，采用正交实验设计四因素四水平
L16(4
5)方法，对倒提壶药材粒度、料液比、
微波作用时间、微波功率等提取条件进行了
优化。实验设计及实验结果见表 1 ～ 2，方差
分析结果见表 3。
表 1 正交实验设计 L16(4
5)
Table 1 The orthogonal test design L16(4
5)
Level
Factor
A Particle size
(mesh)
B Ｒatio of material
to solvent(g ∶ mL)
C Microwave
power(W)
D Extraction
time(min)
1 40 1 ∶ 20 140 25
2 60 1 ∶ 25 280 50
3 80 1 ∶ 30 420 75
4 100 1 ∶ 35 560 100
表 2 正交实验结果
Table 2 Ｒesults of L16(4
5)orthogonal experiment
No．
Factor
A B C D
Yield
(mg·g － 1)
1 1 1 1 1 1. 90
2 1 2 2 2 3. 54
3 1 3 3 3 3. 96
4 1 4 4 4 3. 46
5 2 1 2 3 3. 91
6 2 2 1 4 4. 03
7 2 3 4 1 3. 75
8 2 4 3 2 4. 36
9 3 1 3 4 3. 65
10 3 2 4 3 3. 84
11 3 3 1 2 3. 86
12 4 4 2 1 4. 43
13 4 1 4 2 4. 26
14 4 2 3 1 3. 85
15 4 3 2 4 3. 76
16 4 4 1 3 3. 31
K1 3. 215 3. 430 3. 275 3. 482
K2 4. 013 3. 815 3. 910 4. 005
K3 3. 945 3. 833 3. 955 3. 755
K4 3. 785 3. 890 3. 828 3. 725
Ｒ 0. 798 0. 460 0. 680 0. 523
表 3 方差分析结果
Table 3 Ｒesults of variance analysis
Factor ∑d2 fi F F0. 1(3，3)
A 1. 580 3 1. 572 2. 49
B 0. 531 3 0. 528 2. 49
C 1. 196 3 1. 190 2. 49
D 0. 548 3 0. 545 2. 49
Error 5. 03 15
经直观分析及方差分析可知，4 种因素对
天芥菜碱提取率的影响不尽相同，影响因素
大小依次为:药材粒度 ＞微波功率 ＞微波作
用时间 ＞ 液料比。其提取的优化条件为
A2B4C3D2。随着药材粒度的增加，提取率先
增大后降低，这是因为颗粒度过大时微波难
以完全穿透样品，破壁不完全，而颗粒度过
小时虽然微波能完全穿透样品，但由于相邻
细胞间的相互作用增强，细胞所受阻力增大，
因而其内部细胞被破坏的程度相对较小，故
药材颗粒度为 60 目较为合适。当微波作用时
间太短，功率太低时，产生的热量少，细胞
中局部过热的现象不明显，因而破壁效果差，
以致天芥菜碱的提取率较低;相反，微波作
用时间太长，功率太高时，药材因受热过度
而使样品颗粒粘结，天芥菜碱亦难被提取出，
因而造成提取率下降。正交实验中料液比的
F值远小于 F 临界值，故料液比对天芥菜碱
提取率的影响较小，在不影响提取率又可节
省溶剂的前提下选择料液比为 1 ∶ 35 较佳。
综上所述，提取天芥菜碱的最佳微波条
件为:药材粒度 60 目，液料比 1 ∶ 35，微波
功率 420 W，微波时间 50 min。
2. 2 HPLC分析
2. 2. 1 HPLC分析条件的选择 取天芥菜碱
对照品溶液在 200 ～ 400 nm 波长范围内扫描，
结果显示天芥菜碱在 220 nm 处有最大吸收，
故选择紫外检测器的检测波长为 220 nm。
三乙胺为常用的生物碱抑制剂，将其加
入流动相中可作为扫尾剂，亦起到调节 pH值
的作用。本文尝试以甲醇和 0. 05%的三乙胺
为流动相，调节两者之间的比例，最终以甲
醇 － 0. 05%三乙胺(pH 7. 5)比例为 30 ∶ 70 时
作为流动相，此时得到天芥菜碱标准溶液及
生物碱提取液的液相色谱图见图 3。从图 3 可
看出，天芥菜碱的色谱保留时间为 11. 303
min，峰形良好，分离度大于 1. 5，可满足分
析要求。
1076 分析测试学报 第 33 卷
图 3 天芥菜碱标准溶液(A)及生物碱提取液(B)的色谱图
Fig. 3 Chromatograms of heliotrine standard solution(A)and extraction solution(B)of Cynoglossum amabile Stapf et Drumm
2. 2. 2 线性范围与检出限 吸取天芥菜碱标准品储备液，用甲醇逐级稀释，按实验方法进行测定，
以峰面积(A)为纵坐标，天芥菜碱的质量浓度(ρ，mg /L)为横坐标绘制标准曲线。按信噪比 S /N = 3 计
算检出限。结果显示，天芥菜碱的质量浓度在 52 ～ 1 040 mg /L范围内与其峰面积呈良好线性关系，回
归方程为 A = 17 234 ρ + 2. 083 8 × 106，相关系数为 0. 999 9。检出限为 0. 040 2 mg /L。
2. 2. 3 精密度、重复性及稳定性实验 取对照品溶液连续进样 6 针，每次 10 μL，测得峰面积的相对
标准偏差(ＲSD)为 1. 1%;分别称取倒提壶药材 6 份，按实验方法进行提取、处理后，分别进样 10 μL
进行测定，测得峰面积的 ＲSD为 1. 5%。
取供试品溶液，室温下静置，分别于 0，2，4，8，16，24 h 测定，测得天芥菜碱的 ＲSD为 2. 8%，
表明提取液在 24 h内稳定。
表 4 加标回收实验结果
Table 4 Ｒesults of recovery test for heliotrine
Content
w /(mg·g － 1)
Added
w /(mg·g － 1)
Found
w /(mg·g － 1)
Ｒecovery
Ｒ /%
ＲSD
sr /%
6. 42 6. 00 12. 48 101 2. 4
6. 00 12. 53 102
6. 00 12. 30 98. 0
6. 00 12. 59 103
6. 00 12. 27 97. 5
表 5 不同批次天芥菜碱的提取分析结果(n = 3)
Table 5 The results of heliotrine extracted from
Ｒadix Sophorae flavescentis(n = 3)
Batch
Extraction
method
Heliotrine
Yield
w /(mg·g － 1)
ＲSD
sr /%
20130601 FMAE 6. 53 2. 1
SＲE 3. 68 1. 9
20130603 FMAE 6. 48 1. 8
SＲE 3. 59 1. 4
20130801 FMAE 6. 69 1. 3
SＲE 3. 72 1. 9
2. 2. 4 加标回收实验 按照优化实验条件，
分别称取已知含量的倒提壶药材加入天芥菜碱
标准溶液进行加标回收实验，结果见表 4。由
表 4可知，天芥菜碱的加标回收率为 97. 5%～
103%，ＲSD 为 2. 4%，可满足分析测定的
要求。
2. 3 提取分析及应用
精密称取 3 个批次的倒提壶药材各 2. 0
g，采用 FMAE最优条件提取药材中的天芥菜
碱，按实验方法进行测定，并采用经正交试验
优化后的直接溶剂回流法(SＲE)最佳实验条件
(提取温度 100 ℃，提取回流时间 50 min)进行
对比，结果见表 5。由表 5可知，FMAE的萃取
效率明显高于 SＲE。这是因为 FMAE和 SＲE的
加热方式不同。SＲE 在提取过程中首先是加热
溶剂并溶胀样品细胞，以热传导方式将热能从
溶剂传递到细胞内部进行加热，存在温度梯度;
而 FMAE是直接穿透容器，物料整体被加热，无温度梯度，物料内外温升均匀，加热速度快、无滞后效应，
样品与溶剂在很短的时间内便可升到很高的温度，从而有效提高提取效率，且在该提取体系中极性提取溶剂
乙醇以及天芥菜碱均可吸收微波，产生较强的能量，有利于药材内的组分溶出。因此，微波辅助提取方法适
于倒提壶中天芥菜碱的提取，且该方法简单、方便、实用，在提取应用方面具有良好的前景。
第 9 期 樊轻亚等:聚焦微波辅助提取 /HPLC法测定倒提壶中天芥菜碱的含量 1077
3 结 论
本文将聚焦微波辅助提取技术应用于倒提壶中天芥菜碱的提取，通过单因素试验和正交试验对天
芥菜碱的提取条件进行了优化，以极少的实验次数获取了更多的信息，并建立了一种简便快速、灵敏
度及重现性好、精密度高的 HPLC测定天芥菜碱的分析方法。将本法用于倒提壶中天芥菜碱的提取和
分析，结果满意，可为倒提壶的进一步开发提供科学依据。
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