全 文 ：聚焦微波辅助提取－酸性染料分光光度法
测定农吉利中总生物碱
樊轻亚，游国叶
（信阳职业技术学院 药学院，信阳４６４０００）
摘　要：采用聚焦微波辅助提取（ＦＭＡＥ）结合溴麝香草酚蓝分光光度法测定农吉利中总生物
碱。粒径为０．１８０ｍｍ的样品，以甲醇为溶剂，料液比为１比２５，在微波功率中火条件下提取
５０ｍｉｎ。在ｐＨ　７．２的磷酸二氢钾－氢氧化钠缓冲溶液中，提取得到的生物碱与溴麝香草酚蓝酸性染
料形成缔合物，用三氯甲烷萃取后，在最大吸收波长４１７ｎｍ处测量其吸光度。总生物碱的质量浓
度在０．２５～２５０ｍｇ·Ｌ－１范围内呈线性，方法的检出限（３Ｓ／Ｎ）为１．５ｍｇ·Ｌ－１。应用该方法测定
农吉利药材中总生物碱，加标回收率为１０５％，测定值的相对标准偏差（ｎ＝６）小于３．０％。
关键词：分光光度法；酸性染料；聚焦微波辅助提取；农吉利；生物碱
中图分类号：Ｏ６５７．３２　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００１－４０２０（２０１５）０３－０２８９－０４
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｏｔａｌ　Ａｌｋａｌｏｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ　Ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒａ　Ｌ．ｂｙ　Ａｃｉｄｉｃ　Ｄｙｅ
Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ　Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｆｏｃｕｓｅｄ　Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ＦＡＮ　Ｑｉｎｇ－ｙａ，ＹＯＵ　Ｇｕｏ－ｙｅ
（Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｉｎ　ｏｆ　Ｘｉｎｙａｎｇ，Ｘｉｎｙａｎｇ４６４０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ａｃｉｄｉｃ　ｄｙｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗｉｔｈ　ｆｏｃｕｓｅｄ　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｗａｓ
ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ａｌｋａｌｏｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ　ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒａ　Ｌ．Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｗｉｔｈ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｓｉｚｅｓ　ｏｆ　０．１８０ｍｍ　ｗａｓ
ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙ　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ａｔ　ｍｉｄｄｌｅ　ｐｏｗｅｒ　ｌｅｖｅｌ　ｆｏｒ　５０ｍｉｎ　ｗｉｔｈ　ｍｅｔｈａｎｏｌ　ａｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ－ｓｏｌｖｅｎｔ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ
１∶２５．Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｌｋａｌｏｉｄｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｂｒｏｍｏｔｈｙｍｏｌ　ｂｌｕｅ　ｔｏ　ｆｏｒｍ　ｉｏｎ－ｐａｉｒ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ
ｂｕｆｆｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ＫＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ　ｗｉｔｈ　ｐＨ　ｏｆ　７．２．Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅｎ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ａｎｄ
ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ａｔ　４１７ｎｍ．Ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒｉｔｙ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｋａｌｏｉｄｓ　ｗａｓ　０．２５－２５０ｍｇ·
Ｌ－１　ｗｉｔｈ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　１．５ｍｇ·Ｌ－１．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｔｏｔａｌ　ａｌｋａｌｏｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ　ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒａ
Ｌ．，ｇｉｖｉｎｇ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　１０６％，ｗｉｔｈ　ＲＳＤ（ｎ＝６）ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　３．０％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ；Ａｃｉｄｉｃ　ｄｙｅ；Ｆｏｃｕｓｅｄ　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ　Ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒａ
Ｌ．；Ａｌｋａｌｏｉｄｓ
　　农吉利为豆科猪屎豆属多年生直立小草木，具
有清热解毒，除湿消积的功效，用于治疗痢疾、疮疖、
小儿疳积，近年来，在临床上用作抗癌药［１－３］。农吉
利含有黄酮类化合物及多种生物碱，其中含量较多
收稿日期：２０１４－０３－１７
基金项目：广东省社会发展领域科技计划项目（７３０６０）
作者简介：樊轻亚（１９７９－），女，河南南阳人，讲师，硕士，从事
　药物提取分离及分析。Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｑｙ２００６ｈｎ＠１６３．ｃｏｍ
的生物碱为农吉利乙素、农吉利丙素及农吉利甲
素［４－８］。
微波辅助提取（ＭＡＥ）根据装置的不同可分为
聚焦微波辅助提取（ＦＭＡＥ）和密闭微波辅助提取
（ＰＭＡＥ）两种［９－１１］。ＭＡＥ技术具有选择性高、操作
时间短、溶剂消耗量少、不产生噪声、适合用热不稳
定成分等优点，进一步拓展了 ＭＡＥ技术在天然药
物有效成分提取中的应用前景。
本工作以农吉利全草为研究对象，将ＦＭＡＥ技
·９８２·
樊轻亚等：聚焦微波辅助提取－酸性染料分光光度法测定农吉利中总生物碱
术应用于农吉利中总生物碱的提取，结合有机溶剂
萃取法，采用正交试验方法对ＦＭＡＥ提取试验条件
进行了优化，采用酸性染料分光光度法法测定农吉
利总生物碱的含量，得出ＦＭＡＥ提取农吉利总生物
碱的最佳工艺条件。应用ＦＭＡＥ提取农吉利总生
物碱，方法简单、提取率高，可为农吉利总生物碱提
取工艺的设计与改进提供依据。
１　试验部分
１．１　仪器与试剂
ＰＪ２１Ｃ－ＡＮ型家用微波炉；ＰＨＳ－２５型数显酸度
计；ＲＥ５２ＣＳ－１型旋转蒸发器；Ｂ－２６０型恒温水浴；
ＳＨＢ－Ⅲ型循环水式多用真空泵；ＴＵ－１８１０ＡＳＰＣ型
紫外－可见分光光度计。
农吉利甲素标准储备溶液：３．１３ｇ·Ｌ－１，称取
农吉利甲素对照品３１．３ｍｇ，用甲醇溶解后定容至
１０ｍＬ容量瓶中。用封口胶密封，置于冰箱内保存，
使用时逐级稀释至所需质量浓度。
溴麝香草酚蓝溶液：０．１２ｇ·Ｌ－１。
ｐＨ　７．２的磷酸二氢钾－氢氧化钠缓冲溶液：称
取磷酸二氢钾６．８０５ｇ溶于３５０ｍＬ 水中。用
１ｍｏｌ·Ｌ－１氢氧化钠溶液调ｐＨ 至７．２，用水定容
至５００ｍＬ。
甲醇、三氯甲烷、盐酸、氨水、三乙胺、磷酸均为
分析纯，甲醇为色谱纯，试验用水为蒸馏水。
１．２　试验方法
１．２．１　农吉利生物碱的提取与制备
取已干燥的农吉利全草于摇摆式高速中药粉碎
机中粉碎，分别过０．４２５，０．２５０，０．１８０，０．１５０ｍｍ
的标准筛。称取过筛后的农吉利药材５．０００ｇ于
５００ｍＬ圆底烧瓶中，加入甲醇１５０ｍＬ，放入微波炉
中，在烧瓶下方放置１Ｌ水，以中火微波功率辐射回
流一定时间（每次辐射１０ｍｉｎ，更换烧瓶下方的
水）。
将上述提取液减压抽滤、旋干，用盐酸溶液定容
至５０ｍＬ后移至２５０ｍＬ分液漏斗中，用三氯甲烷
萃取３次除杂（每次２０ｍＬ，用时２０ｍｉｎ），取上层水
相，加氨水碱化至ｐＨ　１０左右，再次加入三氯甲烷
萃取３次（每次２０ｍＬ，用时２０ｍｉｎ），合并三氯甲烷
溶液，旋干，用甲醇定容至５ｍＬ容量瓶中，备用。
１．２．２　农吉利总生物碱的含量测定
移取上述提取液０．５０ｍＬ于５０ｍＬ具塞锥形
瓶中，在水浴上挥干甲醇，然后依次加入ｐＨ　７．２的
磷酸二氢钾－氢氧化钠溶液５ｍＬ、０．１２ｇ·Ｌ－１溴麝
香草酚蓝溶液１０ｍＬ，充分振荡摇匀后置于６０ｍＬ
分液漏斗中，用三氯甲烷萃取３次（每次５ｍＬ，用时
２０ｍｉｎ），合并三氯甲烷溶液，定容至１５ｍＬ。以不
加农吉利总生物碱样品溶液为空白，于波长４１７ｎｍ
处，在紫外－可见分光光度计上测量其吸光度。
２　结果与讨论
２．１　ＦＭＡＥ条件的选择
试验所采用的ＦＭＡＥ提取装置是在家用微波
炉与回流冷凝装置的基础上结合改装而成，ＦＭＡＥ
提取装置见图１。
图１　ＦＭＡＥ提取装置
Ｆｉｇ．１　Ｓｃｈｅｍｅ　ｏｆ　ＦＭＡＥ　ｓｙｓｔｅｍ
因上方有小孔，在ＦＭＡＥ提取过程中易引起局
部受热不均匀而产生暴沸的情况，使部分药材随溶
剂喷上冷凝管，造成损失。为改善及控制该情况，可
在微波炉内放入适量自来水分散微波功率，以控制
暴沸情况。同时，还应用锡纸密封微波炉与回流冷
凝装置接口处，以防止微波泄漏。
２．１．１　提取溶剂
试验以甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯和四氯
化碳为溶剂，考察了不同溶剂对农吉利甲素提取率
的影响，结果表明：农吉利甲素在甲醇中的提取率最
高。试验选择甲醇作为提取溶剂。
２．１．２　微波辐射条件
控制提取功率和提取时间的主要目的是为了在
选定提取溶剂的前提下，选择最佳提取温度，既能使
所需成分保持原来的化合物形态，又能获得最大提
取效率。
试验分别以农吉利总生物碱和农吉利甲素作为
目标物，同样采用正交试验设计四因素四水平Ｌ１６
（４４）试验（见表１），对药物粒径、微波时间、微波功
率、料液比等提取条件进行了优化，测定结果及结果
分析见表２和表３。
·０９２·
樊轻亚等：聚焦微波辅助提取－酸性染料分光光度法测定农吉利中总生物碱
表１　ＦＭＡＥ正交试验设计表Ｌ１６（４４）
Ｔａｂ．１　Ｌ１６（４４）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ　ＦＭＡＥ
水平
因素
药物粒径（Ａ）
／ｍｍ
料液比（Ｂ）
微波功率（Ｃ）
／Ｗ
微波时间（Ｄ）
／ｍｉｎ
１　 ０．４２５　 １∶２０　 １８０　 ２５
２　 ０．２５０　 １∶２５　 ３６０　 ５０
３　 ０．１８０　 １∶３０　 ５４０　 ７５
４　 ０．１５０　 １∶３５　 ７２０　 １００
表２　农吉利总生物碱正交试验结果
Ｔａｂ．２　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ａｌｋａｌｏｉｄｓ　ｉｎ
Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ　ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒａ　Ｌ．
项目 Ａ　 Ｂ　 Ｃ　 Ｄ
总碱提取率　
　　　　　ｗ／（ｍｇ·ｇ－１）
甲素提取率
１　 ０．４２５　 １∶２０　 １８０　 ２５　 ０．３４９　 ０．００３　７
２　 ０．４２５　 １∶２５　 ３６０　 ５０　 ０．３６６　 ０．０２０　２
３　 ０．４２５　 １∶３０　 ５４０　 ７５　 ０．４０６　 ０．０３０　４
４　 ０．４２５　 １∶３５　 ７２０　 １００　 ０．３６３　 ０．０２６　０
５　 ０．２５０　 １∶２０　 ３６０　 ７５　 ０．３９３　 ０．０１６　５
６　 ０．２５０　 １∶２５　 １８０　 １００　 ０．４０１　 ０．０１７　０
７　 ０．２５０　 １∶３０　 ７２０　 ２５　 ０．３８１　 ０．０２２　８
８　 ０．２５０　 １∶３５　 ５４０　 ５０　 ０．４２４　 ０．０２６　７
９　 ０．１８０　 １∶２０　 ５４０　 １００　 ０．３７９　 ０．０２７　２
１０　 ０．１８０　 １∶２５　 ７２０　 ７５　 ０．３９０　 ０．０２５　２
１１　 ０．１８０　 １∶３０　 １８０　 ５０　 ０．３９２　 ０．０１３　０
１２　 ０．１８０　 １∶３５　 ３６０　 ２５　 ０．４４５　 ０．０２５　１
１３　 ０．１５０　 １∶２０　 ７２０　 ５０　 ０．４２７　 ０．０２４　１
１４　 ０．１５０　 １∶２５　 ５４０　 ２５　 ０．３９７　 ０．０１９　６
１５　 ０．１５０　 １∶３０　 ３６０　 １００　 ０．３８１　 ０．０２１　９
１６　 ０．１５０　 １∶３５　 １８０　 ７５　 ０．３４５　 ０．０１１　６
均值１　０．３７１　 ０．３８７　 ０．３７２　 ０．３９３
均值２　０．４００　 ０．３８９　 ０．３９６　 ０．４０２
均值３　０．４０２　 ０．３９０　 ０．４０２　 ０．３８４
均值４　０．３８８　 ０．３９４　 ０．３９０　 ０．３８１
极差 ０．０３１　 ０．００７　 ０．０３０　 ０．０２１
表３　农吉利总生物碱正交试验结果的方差分析
Ｔａｂ．３　Ｖａｒｉａｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ａｌｋａｌｏｉｄｓ
ｉｎ　Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ　ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒａ　Ｌ．
方差来源
ＳＶ
离均差平
方和ＳＳ
自由度
ｆ
均方
Ｓ
Ｆ值 显著性
药材粒径 ０．００２　 ３　 ０．０００　６６７　 ０．９０９ 无
料液比 ０　 ３　 ０　 ０ 无
微波功率 ０．００２　 ３　 ０．０００　６６７　 ０．９０９ 无
微波时间 ０．００１　 ３　 ０．０００　３３３　 ０．４５５ 无
总和 ０．０１０　 １５　Ｆ０．０１（３，１５）＝２．４９　Ｆ０．０５（３，１５）＝３．２９
通过对表２中的极差和表３的方差分析发现，
其影响顺序依次为药材粒径、微波功率、微波时间、
料液比。综合考虑经济性、能量消耗和环保等方面，
可得出聚焦微波辅助提取农吉利总生物碱的最佳条
件为药材粒径０．１８０ｍｍ，料液比为１比２５，微波功
率５４０Ｗ，微波时间５０ｍｉｎ。
２．２　酸性染料分光光度法分析条件的选择
２．２．１　酸性染料与萃取溶剂
常用的染料有甲基橙、溴麝香草酚蓝（ＢＴＢ）、溴
酚蓝（ＢＰＢ）、溴甲酚绿（ＢＣＧ）和溴甲酚紫等。其中
ＢＴＢ为常用的染料，试验选用ＢＴＢ作为酸性染料。
选择萃取溶剂的原则是根据离子对与有机相形
成氢键能力的强弱而定。四氯化碳、苯不与离子对
形成氢键，提取率较低；三氯甲烷与离子对形成氢
键，有中等程度的提取率，且选择性也较好，是常用
的提取溶剂。试验选用三氯甲烷作为萃取溶剂。
２．２．２　测定波长
按试验方法，ＢＴＢ以三氯甲烷为参比，对照品
和样品都以试剂空白为参比，在紫外－可见分光光度
计上扫描其吸收光谱，见图２。
１－对照品与ＢＴＢ络合物，以试剂空白为参比；
２－样品与ＢＴＢ络合物，以试剂空白为参比；
３－ＢＴＢ，以三氯甲烷为参比
图 ２　溴麝香草酚蓝及其与对照品、样品所形成缔合物的吸收光谱图
Ｆｉｇ．２　ＵＶ－ｖｉｓ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆ　ＢＴＢ，ｃｏｎｔｒａｓｔ－ＢＴＢ
ｃｏｍｐｌｅｘ　ａｎｄ　ｓａｍｐｌｅ－ＢＴＢ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ
由图２可知：农吉利甲素对照品、样品与ＢＴＢ
形成的缔合物在４１７ｎｍ处有最大吸收峰，并且在
此波长下，ＢＴＢ本身的干扰比较小，试验选择测定
波长为４１７ｎｍ。
２．２．３　缓冲溶液的酸度
试验选择ｐＨ为５．８～８．０的磷酸二氢钾－氢氧
化钠缓冲溶液，并按试验方法考察了其ｐＨ为６．４，
６．８，７．２，７．６，８．０时对测定的影响。结果表明：在
ｐＨ　７．２的磷酸二氢钾－氢氧化钠缓冲溶液中，农吉
利生物碱与ＢＴＢ能充分结合生成离子对被三氯甲
烷萃取，使三氯甲烷萃取液的吸光度达到最大，试验
·１９２·
图
樊轻亚等：聚焦微波辅助提取－酸性染料分光光度法测定农吉利中总生物碱
选择磷酸二氢钾－氢氧化钠缓冲溶液的ｐＨ为７．２。
２．２．４　酸性染料的用量
试验考察了０．１２ｇ·Ｌ－１溴麝香草酚蓝溶液的
用量为３，５，７，９，１１，１３ｍＬ时对测定的影响。结果
表明：酸性染料的用量约为１１ｍＬ时，农吉利生物
碱与ＢＴＢ能充分结合生成离子对被三氯甲烷萃取，
使三氯甲烷萃取液的吸光度达到最大，为了节省酸
性染料及能准确量取，试验选择０．１２ｇ·Ｌ－１溴麝
香草酚蓝溶液的用量为１０ｍＬ。
２．３　标准曲线和检出限
按试验方法测定农吉利甲素标准溶液系列，总
生物碱的质量浓度在０．２５～２５０ｍｇ·Ｌ－１内呈线
性，线性回归方程为Ａ＝６．６９４　ｃ＋０．０５３，相关系数
为０．９９９　４，方法的检出限（３Ｓ／Ｎ）为１．５ｍｇ·Ｌ－１。
２．４　精密度和回收试验
分别称取农吉利药材细粉６份各１．０００ｇ，均加
入农吉利甲素对照品０．０３１　４ｍｇ，按农吉利总生物
碱提取方法进行提取，并按试验方法进行纯化与测
定，结果见表４。
表４　回收试验结果（ｎ＝６）
Ｔａｂ．４　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ
样号
测定值
ｍ／ｍｇ
加标量
ｍ／ｍｇ
测定总量
ｍ／ｍｇ
回收率
／％
平均回收率
／％
ＲＳＤ
／％
１　 ０．０４７　３　０．０３１　４　０．０７９　３　 １０２　 １０５　 ２．４
２　 ０．０４７　３　０．０３１　４　０．０８０　６　 １０６
３　 ０．０４７　３　０．０３１　４　０．０８０　０　 １０４
４　 ０．０４７　３　０．０３１　４　０．０７９　６　 １０３
５　 ０．０４７　３　０．０３１　４　０．０８１　５　 １０９
６　 ０．０４７　３　０．０３１　４　０．０８０　６　 １０６
由表４可知：平均回收率为１０５％，相对标准偏
差小于３％，表明本方法准确、可靠。
２．５　样品分析
采用ＦＭＡＥ、ＭＩＳＲＥ、ＳＲＥ法各提取３份样品，
按试验方法分离纯化后测定，３种提取方法的总生
物提取率依次为０．４８３，０．２５７，０．１９６ｍｇ·ｇ－１。
本工作采用ＦＭＡＥ技术提取农吉利总生物碱，
所得提取率约为微波辐射－溶剂回流提取（ＭＩＳＲＥ）
的１．９倍，为溶剂回流提取的２．５倍，而提取时间却
分别是后两者的１／３。采用ＦＭＡＥ能够有效提取
农吉利总生物碱，并且设备简单，操作方便，提取效
率高。采用溴麝香草酚蓝分光光度法测定农吉利总
生物碱的含量，方法简单、重现性好、灵敏度高。
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·２９２·