全 文 ：HPLC法测定广东土牛膝中腺苷的含量
卢绮雯 ,李　坚 ,萧　鹏* ,谢艳婷*(广东药学院 药科学院 ,广东 广州 510006)
摘要:目的 测定广东土牛膝中腺苷的含量。方法 采用反相高效液相色谱法 , 色谱柱:Diam onsilTM C18柱 , 流动相:甲醇-磷酸盐
缓冲溶液(体积比 12∶88), 流速:1. 0 m L m in- 1 ,检测波长 260 nm ,柱温 30 ℃。结果 腺苷的平均回收率为 99. 5%, RSD值为
1. 69%;方法精密度试验 RSD 值为 1. 15%(n =6)。结论 该法可用于广东土牛膝中腺苷的含量测定。
关键词:广东土牛膝;腺苷;HPLC;含量测定
中图分类号:R 284. 1　文献标识码:A　文章编号:1006 - 8783(2007)02 - 0131 -03
*广东药学院 2003级实习生
作者简介:卢绮雯 , 女 , 大学本科 , 广东广州人 , 实验师 , 主要
从事药物分析工作。
Determ ina tion of adenosine inRad ix Eupa lorri Chinense L inn by RP-HPLC
LU Q i-w en, LI Jian ,X IXO Peng,X IE Jimg-ting
(Departm ent of Pharm aceutics, Guangdong College of Pharmacy , Guangzhou ,Guangdong 510006, China)
Abstract:Object ive To de term ine the con tent of adenosine inRadix Eupalorri Ch inense Linn by RP ˇHPLC. M ethods Samp les w ere
ana lyzed on a Diam onsilTM C18 co lumn(250mm ×4. 6mm , 5μm) using CH3OH-NaH2 PO4 Na2HPO4(12∶88)asmobile phase. The
flow rate was 1. 0mL m in-1 and the de tec tion w ave leng th 260 nm. Results The method exh ibited good linearity from 0. 0396 to 0.
6336 μg. The average recovery for adenosine w as 99. 5% and RSD 1. 69% (n =6). Conclusion The m ethod cou ld be used to
de te rm ine adenosine content inRad ix Eupalorri Chinense Linn.
K ey words:Rad ix Eupalorri chinense Linn;adenosine;RPˇHPLC
　　广东土牛膝(Rad ix Eupalorri Chinense Linn)为
菊科植物华泽兰的干燥根及根茎 ,广东土牛膝资源
丰富 ,分布较广 ,在民间沿用历史悠久 ,具有清热解
毒 、凉血利咽 、抗炎镇痛的功效 [ 1, 2] ,临床上常用于
治疗各种咽喉炎 、扁桃腺炎等 。为评价广东土牛膝
的内在质量 ,本文以腺苷为指标成分 [ 3] ,建立了广
东土牛膝中腺苷含量测定的高效液相色谱法 ,该法
具有分离效果好 ,简便 、准确等优点 ,可用于该药材
的初步质量控制 。
1　仪器和试药
1. 1　仪器
日本岛津高效液相色谱仪 (LC-10ATvp溶剂输
送泵 , SPD-10Avp紫外-可见检测器 , CTO-10A sp柱
温箱), HW-2000色谱工作站(南京千谱软件公司 )。
1. 2　药材来源及处理
土牛膝样品 (批号 20051102,东莞国药集团中
药饮片有限公司 ,产地广东;批号 20060109,东莞国
药集团中药饮 片有限公司 , 产地广东;批号
0500201,佛山康泰和医药有限公司中药饮片加工
厂 ,产地广东),由广东药学院生药学教研室刘基柱
副教授鉴定为菊科泽兰属植物华泽兰 (Eupa lorri
chinense Linn)的根及根茎 。将其粉碎 ,于 60 ℃下干
燥 4 h,置干燥器内备用 。
1. 3　药品与试剂
腺苷对照品 (中国药品生物制品检定所提供 ,
批号 879 -200202,供含量测定用 );甲醇为色谱纯 ,
水为双蒸水 ,磷酸二氢钠和磷酸氢二钠均为分析纯。
2　实验部分
2. 1　溶液的制备
2. 1. 1　供试品溶液
取本品粉末(过 3号筛 )约 1 g,精密称定 ,置具
塞锥形瓶中 ,精密加入 50%(体积分数 )的甲醇 20
mL,称定重量 ,超声处理 45 m in,放冷 ,再称定重量 ,
用 50%(体积分数 )甲醇补足减失重量 ,摇匀 ,滤过 ,
取续滤液即得 。
2. 1. 2　对照品溶液
精密称取腺苷对照品 9. 90 mg,置 50 mL量瓶
中 ,加 50%(体积分数)的甲醇适量 ,振摇使溶解 ,再
加 50%(体积分数)的甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,得浓
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第 23卷第 2期 广　东　药　学　院　学　报 Vo.l 23 No. 2
2007年 4月 JOURNAL OFGUANGDONG COLLEGE OF PHARMACY Apr. 2007
度为 198 μg mL -1的腺苷对照品贮备液。
2. 2　色谱条件及系统用性试验
色谱柱:D iamonsilTM (钻石 ) C18柱 (250 mm ×
4. 6mm , 5μm ,迪马公司 );流动相:甲醇-磷酸盐缓
冲溶液 [取 0. 01 mol L- 1磷酸二氢钠 68. 5 mL与
0. 01mo l L- 1磷酸氢二纳 31. 5 mL混合 (pH =
6.5)] (体积比 12∶88);流速:1. 0mL min- 1 ,检测
波长:260 nm;柱温:30 ℃。分别取对照品溶液 (腺
苷浓度为 7. 92 μg mL -1),供试品溶液 20 μL注
入色谱仪 ,按上述色谱条件 ,记录色谱图 (图 1, 2)。
腺苷和样品中相邻色谱峰的分离度大于 1. 5;理论
塔板数以腺苷峰计算不低于 3 000;保留时间约为
17.40m in。
图 1　腺苷对照品 HPLC图
F ig. 1　Chrom atogram of the con trol
图 2　广东土牛膝药材样品 HPLC图
F ig. 2　Chrom atogram of the samp le
2. 3　方法学考察
2. 3. 1　线性与范围
分别精密吸取一定量的对照品贮备液用 50%
(体积分数)的甲醇稀释成浓度为 1. 98、3. 96、7. 92、
15. 84、23. 76、31. 68 μg mL -1的对照品溶液 ,分别
取 20μL进样测定 ,以峰面积 (A)对对照品质量浓
度 (ρ)进行回归 , 得回归方程 A =32 416. 91ρ+1
071. 34, r =0. 999 9 ,试验表明腺苷在 0. 039 6 ～
0.633 6μg之间与峰面积线性关系良好。
2. 3. 2　精密度试验
取质量浓度为 7. 92 μg mL- 1的腺苷对照品
溶液 20μL,连续测定 5次 ,记录峰面积并计算 ,结
果腺苷峰面积的平均值为 256 682, RSD为 0. 72%,
表明仪器精密度良好。
2. 3. 3　稳定性试验
取土牛膝供试品溶液(批号 20051102),在 0、2、
4、8、12 h分别进样 20 μL,记录峰面积 ,结果腺苷峰
面积的平均值为 229 720, RSD为 1. 69%,表明供试
品溶液在 12 h内稳定 。
2. 3. 4　重复性试验
取同一批号 (批号 20051102)样品 6份 , 按
“2.1. 1”项下方法制备溶液 ,分别进样测定 ,结果腺
苷平均含量为 0. 1406 mg g-1 , RSD 为 1. 15%,表
明分析方法精密度良好 。
2. 3. 5　加样回收试验
精密称取已知含量 (批号 20051102)土牛膝样
品约 0. 5g,共 9份 ,分别用刻度吸量管精密加入浓
度为 198μg mL - 1的腺苷对照品溶液 0. 23、0. 23、
0. 23、0. 36、0. 36、0. 36、0. 50、0. 50、0. 50 mL, 按
“2.1. 1”项下方法制备供试品溶液 ,在上述色谱条
件下进样 20μL进行分析 ,结果见表 1。
表 1　腺苷回收率试验结果
Tab. 1　Resu lts of recovery test
m样品量 /
g
m样品中的量 /
m g
m加入量 /
mg
m测得量 /
m g
回收率 /
%
0. 513 6 0. 072 06 0. 045 54 0. 116 9 98. 5
0. 495 7 0. 069 55 0. 045 54 0. 115 9 101. 8
0. 506 3 0. 071 03 0. 045 54 0. 116 6 100. 1
0. 502 6 0. 070 51 0. 071 28 0. 142 5 101. 0
0. 510 6 0. 071 64 0. 071 28 0. 144 2 101. 8
0. 501 3 0. 070 33 0. 071 28 0. 140 5 98. 4
0. 500 4 0. 070 21 0. 099 00 0. 167 7 98. 5
0. 528 4 0. 074 13 0. 099 00 0. 170 6 97. 4
0. 516 1 0. 072 41 0. 099 00 0. 169 5 98. 1
平均回收率 =99. 5%　　　 RSD =1. 69%
2. 4　样品测定
取土牛膝样品 3批 ,按 “ 2. 1. 1”项下方法制备
供试品溶液 ,分别取 7. 92 μg mL -1的对照品溶液
与供试品溶液各 20 μL,注入液相色谱仪 ,测定 ,计
算腺苷的含量 ,结果见表 2。
表 2　样品的测定结果(n=3)
Tab. 2　Conten t of adenosine in the samp le
批号 w(腺苷) /(m g g- 1) RSD /%
20051102 0. 140 3 0. 73
20060109 0. 152 2 0. 57
0500201 0. 125 3 1. 24
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广东药学院学报 , 2007, 23(2)
3　讨论
3. 1　提取溶剂的选择 　分别用不同体积分数
(30%、50%、70%、 90%)甲醇混合液进行试验 ,结
果腺苷的含量分别为 0. 139 8 、0. 140 8、0. 138 3、
0.126 7μg mL -1 ,表明用体积分数为 50%的甲醇
溶剂提取比较完全。
3. 2　腺苷提取方法选择　文献 [ 4 -7]主要用超声
处理和加热回流方法 ,本文考察了以 50%(体积分
数 )甲醇为提取溶剂 ,样品分别超声处理和回流处
理 ,结果腺苷的含量分别为 0. 140 8、0.138 5 μg
mL
-1 ,并且超声处理 45m in与 60 m in的结果一致 ,
因此选择 45m in作为提取时间 。
3. 3　检测波长的选择 　取腺苷对照品溶液 ,用
50%(体积分数)甲醇溶液做参比 ,置紫外可见分光
光度计仪器中 ,在 210 ～ 400 nm波长扫描 ,结果腺苷
对照品溶液在 260 nm处有最大吸收波长 ,故选择
260 nm作为检测波长 。
3. 4　流动相的选择　曾参考《中国药典》2005年版
一部 “冬虫夏草”的腺苷含量测定方法 [ 5] ,以甲醇-
pH =6. 5磷酸盐缓冲溶液(体积比 17∶3)作为流动
相条件 ,但在试验过程中 ,我们发现在这种流动相条
件下腺苷与其他组分的峰的分离状况并不好 ,经过
对柱温和不同比例的甲醇-磷酸盐缓冲溶液流动相
的试验 ,结果以甲醇-pH =6. 5磷酸盐缓冲溶液 (体
积比 12∶88),柱温 30 ℃时 ,土牛膝中腺苷可和其他
组分基线分离 ,并且峰形良好 ,该法分离效果好 ,准
确 ,可用于广东土牛膝药材的初步质量控制 。
参考文献:
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况 [ J] . 中医药学刊 , 2005, 23(11):1995 - 1996.
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[ J] . 中医药学刊 , 2005, 22(8):1566 -1568.
[ 3] 叶沛光 ,龙晓英 ,卢绮雯 , 等. 复方土牛膝喷雾剂的研制
[ J] . 广东药学院学报 , 2006, 22(3):249 -252.
[ 4] 张敏如 ,洪亮 , 郭群.高效液相色谱法测定发酵虫草菌粉
和金水宝胶囊中腺苷的含量 [ J] . 中草药 , 1994, 25(2):
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[ 5] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:一部 [ S] . 北
京:化学工业出版社 , 2005:7.
[ 6] 邱文炜 , 翁雪萍. 灵芝胶囊质量标准研究及质量评价
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[ 7] 孔令钰 , 张磊 , 于治国 , 等. RP -HPLC法测定苦碟子药
材中腺苷的含量 [ J] . 药物分析杂志 , 2006, 26(11):1665
- 1667.
(收稿日期:2007 -01 - 19;修回日期:2007 -04 - 10)
(上接第 130页)
3　讨论
3. 1　测定时应注意掌握样品的前处理 ,曾经分别用
索氏提取 、回流提取 、超声提取等方法对样品进行处
理 ,结果以超声提取 2次较完全且操作简单快捷。
3. 2　经过比较不同比例的甲醇-水 (体积比 60∶
40)、(体积比 70∶30)、(体积比 85∶15)及乙腈-水
(体积比 70∶30)等流动相系统对本品中丹参酮 ⅡA
与杂质的分离度与保留时间 ,发现流动相甲醇-水
(体积比 85∶15)能保证所测样品与杂峰分离完全
(分离度 >1. 5),色谱峰峰形对称而尖锐 (拖尾因子
=1. 00)。
参考文献
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(4):410 -413.
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(收稿日期:2007 -03 - 15;修回日期:2007 -04 - 09)
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第 2期　卢绮雯 ,等. HPLC法测定广东土牛膝中腺苷的含量