全 文 ：茶叶科学 2012，32（2）：135~141
Journal of Tea Science 投稿平台：http://cykk.cbpt.cnki.net/

收稿日期：2011-07-19 修订日期：2012-01-18
基金项目：湖南省研究生科研创新项目（CX2010B278）
作者简介：李丹（1987— ），女，陕西宝鸡人，硕士研究生，主要从事茶树栽培及分子生物育种研究。*通讯作者：luojunwu11@sina.com
江华苦茶种质资源遗传多样性和亲缘关系的 ISSR 分析
李丹 1，李端生 2，杨春 1，王庆 1，罗军武 1*
1. 湖南农业大学教育部茶学重点实验室，湖南 长沙 410128；2. 湖南省江华瑶族自治县农业局，湖南 江华瑶族自治县 425509
摘要：利用 ISSR 标记分析了江华苦茶群体的遗传多样性和亲缘关系。10 个多态性高、重复性好的 ISSR 引物
在 70 个单株间共扩增出 174 条谱带，其中 166 条具有多态性，占 95.40%，表明江华苦茶群体基因组 DNA 具
有较高的多态性。供试单株间的平均 Nei s´ 基因多态性（H）和 Shannon 信息指数（I）分别为 0.382、0.558，
表明材料间的遗传多样性较高。供试材料的相似系数介于 0.44~0.84，平均为 0.63。用 UPGMA 法进行聚类分
析，共聚为 6 个类群，其中 5 个复合组，1 个独立组。亲缘关系 ISSR 树状图在分子水平上显示了江华苦茶群
体各单株间的亲缘关系，为江华苦茶种质资源的开发利用和保护提供了一定的参考依据。
关键词：江华苦茶；ISSR；遗传多样性；亲缘关系
中图分类号：S571.1；Q346 文献标识码：A 文章编号：1000-369X（2012）02-135-07

Genetic Diversity and Relationship of Tea Germplasm
Resources Camellia sinensis var. assamica cv. Jianghua
Revealed by ISSR Markers
LI Dan
1
, LI Duan-sheng
2
, YANG Chun
1
, WANG Qing
1
, LUO Jun-wu
1*
1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China ;
2. Agriculture Bureau of Jianghua Yao Autonomous County Hunan Province, Jianghua Yao Autonomous County 425509, China
Abstract: The 10 pairs of ISSR primers were used to analyze the genetic polymorphism and genetic relationship of
70 Camellia sinensis var. assamica cv. Jianghua individuals. Totally 174 bands were generated with 10 ISSR primers,
of which 166 (95.40％) were polymorphic, which indicated that the genetic diversity of Jianghua population was
relatively high. The mean Nei s´ gene diversity (H) and Shannon s´ information index (I) of the tested tea germplasm
were 0.382 and 0.558 respectively, indicating a rather high genetic diversity existed between the germplasm
resources. The genetic similarity coefficient ranged from 0.44 to 0.84, averaging 0.63 . UPGMA cluster analysis
showed that all the tested individuals could be classified into 6 groups including 5 co mplex groups and 1 simple
group. The genetic relationship of all 70 Jianghua individuals was revealed by the ISSR dendrogram, which provide
the basis for the utilization and protection of this local landrace population.
Keywords: Camellia sinensis var. assamica cv. Jianghua, ISSR, genetic polymorphism, genetic relationship


江华苦茶（Camellia sinensis var. assamica
cv. Jianghua）是湖南省 1987 年认定的优良地
方群体品种，主要分布在湖南省南部江华地
区的南岭山脉。据检测，江华苦茶群体平均
136 茶 叶 科 学 32 卷

酚类含量高达 39.21%、水浸出物 48.50%[1]，
抗寒性好，所制红碎茶可达到全国二套样水
平 [2]，是宝贵的茶树资源，在育种学和茶叶深
加工等方面都具有较高的利用价值。江华苦
茶属有性系群体品种，不同单株之间具有较
大的性状差异，仅靠形态学或农艺性状等传
统方法难以对江华苦茶群体进行准确评估，
制约了其优良单株的选育以及后续的开发利
用。ISSR（Inter-simple sequence repeat），是
由 Zietkiewicz 等 [3]于 1994 年创建的基于微卫
星发展起来的一种简单序列重复区间扩增多
态性分子标记。ISSR 分子标记可靠性好、信
息量高、实用性强，具有明显的优越性 [4]，已
在植物以及茶树种质鉴别、遗传多样性评价、
亲缘关系和遗传演化分析上广泛应用 [5-12]。本
研究利用 ISSR 分子标记方法对江华苦茶群体
的遗传多样性水平和亲缘关系进行种质鉴
定，为利用和保护这一资源提供一定的参考
依据。
1 材料与方法
1.1 材料
2010 年 5 月上旬于湖南省江华县涛圩镇
牛牯岭和未竹口乡张家洞村两地，经现场考察
后，根据形态差异标记 70 个江华苦茶单株，
依次进行编号（C01~C70）。取一芽二叶新梢
作为材料，样品用液氮保存，后置于－80℃冰
箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 DNA 的提取
参考黄建安等 [13]的方法，采用改良的
CTAB法提取茶树基因组DNA。在岛津紫外分
光光度计上测定DNA的纯度和浓度。用0.8%
琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL溴化乙锭）检测DNA
的分子大小及降解程度。
所用引物参照哥伦比亚大学发布的100条
ISSR引物 [14]，序列提交南京金斯特科技有限
公司合成。引物退火温度采用梯度PCR法最终
确立。ISSR-PCR的最佳反应体系采用单因素
和正交两种实验方法最终确立，即体积25 μL，
内含无菌ddH2O 13.8 μL；10×PCR buffer 2.5 μL；
Mg
2+（2.0 mmol/L）2 μL；dNTP（10 mmol/L）
0.4 μL；引物（10 pmol/μL）3 μL；Taq E（5 U/μL）
0.3 μL；DNA模板（10 ng/μL）3 μL。
1.2.2 PCR 扩增程序和产物的检测
PCR 扩增反应在 PTC-100TM PCR 仪上进
行，反应热循环程序设定为预变性 94℃，5 min；
变性 94℃，45 s；适宜温度下（最适退火温度
因引物而异）退火，45 s；延伸 72℃，60 s；
循环 30 次；后延伸 72℃，5 min；4℃保存。
反应结束后，ISSR-PCR 产物用 2.0%的琼脂糖
凝胶（含 0.5 μg/mL 溴化乙锭）于 120 V/cm 条
件下电泳约 120 min，电泳结束后用凝胶成像
系统（Gene Geniue）拍照，记录结果。
1.3 数据处理与分析方法
采用 Cross Checker 软件结合人工方法读
带，对每个株系在电泳图上清晰可辨且可重复
出现的条带进行统计，按照相同迁移位上有迁
移带的赋值为“1”，无扩增条带和不易区别的
弱带赋值为“0”，建立原始二元数据矩阵。利
用 NTSYSpc-2.10e 分析软件统计供试材料的
Jaccard 遗传相似系数，按照非加权类平均法
（UPGMA）对其进行聚类分析，并绘制亲缘
关系 ISSR 聚类树状图。利用 PopGen32[15]软
件在假定哈丁·温伯格平衡条件下计算有效
等位基因数（Ne）、Nei s´ 基因多态性（H）[16]
和 Shannon 信息指数（I）[17]。
2 结果与分析
2.1 ISSR 扩增产物的多态性
从 100 条 ISSR 引物中筛选出 10 个扩增条
带清晰、多态性高、重复性好的引物对 70 份
供试材料的基因组进行扩增和多态性研究（表
1）。共扩增出 174 条 ISSR 谱带，其中多态性
条带 166 条，多态性比率达 95.40%。每条引
物产生的 ISSR 条带数在 12~23 条之间，平均
2期 李丹，等：江华苦茶种质资源遗传多样性和亲缘关系的 ISSR分析 137

17.4 条，其中多态性条带 16.6 条，每个引物
产生的多态性条带的比率在 88.24%~100.00%
之间，扩增条带大小为 200~2 000 bp，这表明
江华苦茶群体基因组 DNA 的多态性较高。图
1 是引物 UBC826 对 36 份江华苦茶单株的
ISSR 扩增图谱。

表 1 ISSR 引物及其扩增产物的多态性水平
Table 1 Nucleotide sequence of ISSR primers and their polymorphism of bands
引物编号
Primer Code
引物序列
Sequence of primer
扩增的总条带数
Number of total bands
多态性条带数
Number of polymorphic bands
多态性比率（%）
Percentage of polymorphic bands
UBC812 (GA)8A 12 12 100.00
UBC825 (AC)8T 20 20 100.00
UBC826 (AC)8G 21 21 100.00
UBC834 (AG)5A(AG)2YT 23 22 95.65
UBC842 (GA)8YG 20 19 95.00
UBC844 (CT)8RC 15 14 93.33
UBC845 (CT)8RG 12 11 91.67
UBC847 (CA)8RC 15 15 100.00
UBC850 (GT)8YC 19 17 89.47
UBC856 (AC)8YA 17 15 88.24
总数 Total 174 166 95.40
平均数 Average 17.4 16.6
注：R=(A,G)，Y=(C,T)。















2.2 江华苦茶群体的遗传多样性
利用 PopGen32 软件对江华苦茶单株各位
点的有效等位基因数（Ne）、Nei′s 基因多样性
指数（H）以及 Shannon 信息指数（I）等遗传
多样性指标进行统计，结果显示，70 个江华
苦茶单株的平均有效等位基因数为 1.68，平均
Nei′s 基因多样性指数为 0.38，平均 Shannon
信息指数为 0.56。就各位点而言，有效等位基
因数最小值为 1.03，最大值为 2.00；Nei′s 基
因多样性指数介于 0.03~0.50 之间；Shannon
信息指数为 0.08~0.69。表明江华苦茶群体各
单株间存在较高的遗传多样性。
2.3 江华苦茶群体各株系间的遗传相似系数
与聚类
图 1 ISSR 引物 UBC826 对 36 份江华苦茶资源的扩增结果图
Fig. 1 The ISSR fingerprint of 36 Jianghua tea strains amplified by primer UBC826
138 茶 叶 科 学 32 卷

70 个江华苦茶单株间的 Jaccard 相似系数
在 0.44~0.84 之间，平均为 0.63，其中 C54 与
C02 的相似系数最低，为 0.44，表明两个单株
之间存在较大的遗传差异，亲缘关系较远。C05
与 C03 之间的相似系数最高，为 0.84，在聚类
图中它们首先聚合在一起，说明两者遗传背景
相近，遗传距离较小，亲缘关系较近。在相似
系数的平均值（0.63）处将所有供试资源分为
六大类群（图 2），第Ⅰ类群包括 C01、C03、
C05、C02、C04、C09、C06、C08、C14、C17、
C07、C11、C64、C68、C10、C67、C69、C65、
C66、C70、C63，共 21 个单株。第Ⅱ类群包
括 C27、C32、C41、C42、C29、C33、C35、
C30，共 8 个单株。第Ⅲ类群包括 C19、C44、
C53、C57、C43、C51、C13、C22、C25、C45、
C46、C62、C23、C24，共 14 个单株。第Ⅳ类
群包括 C15、C12、C38、C50、C56、C58、C18、
C20、C21、C26、C28，共 11 个单株。第Ⅴ类
群包括 C31、C34、C36、C39、C40、C52、C48、
C61、C55、C59、C60、C37、C47、C49、C54，
共 15 个单株。第Ⅵ类群仅有 C16 1 个单株，说
明它的遗传背景与其他单株存在较大差异。




























图 2 70 个江华苦茶单株 ISSR 数据的 UPGMA 聚类分析树状图
Fig. 2 Dendrogram of 70 individuals based on ISSR data by using UPGMA clustering method
相似系数 Coefficient
2期 李丹，等：江华苦茶种质资源遗传多样性和亲缘关系的 ISSR分析 139

聚类结果显示，形态学具有某些相似特征
的单株往往聚为一类。如第Ⅰ类群中 21 个单
株的共同特征为叶片呈长椭圆形、先端渐尖、
深绿色；第Ⅱ类群各单株叶片呈黄绿微紫色，
顶芽和叶背软毛明显，叶质硬脆；第Ⅲ类群各
单株叶片呈长圆形、叶质柔软、芽叶持嫩性强。
其余各类群也因芽叶、茸毛等特征的相似而聚
为一类。但在聚类结果中，不同类群的单株间
也存在较为明显的表型差异，如单独聚为一类
的 C16 较其他单株叶片稍小、呈卵形、叶色
黄绿稍浅。
3 讨论
3.1 ISSR 分子标记的特点
DNA 分子标记如 RAPD[18]、RFLP[19]、
AFLP
[20]等在植物中大量应用，但这些方法存
在一定的局限性，如 RAPD 重复性低、RFLP
和 AFLP 步骤繁琐、技术要求高。ISSR 是利
用包含重复序列并在 3′或 5′加锚的单寡核苷
酸引物对基因组进行 PCR 扩增的标记系统，
具有丰富的等位基因，呈孟德尔式遗传。在茶
树研究中与 RAPD、EST-SSR、SSR、SRAP、
TRAP 等[21-25]分子标记相比，成本低、稳定性
高、实用性强，具有较高的检测能力和标记效
率，已成功应用于群体间及群体内的亲缘关系
鉴定[26-27]。
3.2 江华苦茶群体的遗传多样性
10 个 ISSR 引物共扩增出 174 条 ISSR 谱
带，其中多态性条带 166 条，多态性比率达
95.4%，高于郭春芳等 [28]利用 ISSR 标记统计
的福建（ 88.68%）、广东（ 86.79%）、浙江
（45.28%）的茶树品种；平均 Nei′s 基因多样
性指数（H）为 0.38，平均 Shannon 信息指数
（I）为 0.56，高于宁静等[29]利用 ISSR 分子
标记统计的湖南群体品种黄金茶（0.30、0.45）
和沈程文等[30]利用 RPAD 标记统计的湖南群
体品种安化云台山种（0.27、0.31）、城步峒茶
（0.28、0.32）、汝城白毛茶（0.30、0.34），说
明江华苦茶群体在部分产茶地域间、在湖南群
体品种间表现出较高的遗传多样性水平。我国
无性系茶树栽培品种的 H、I 分别为 0.23、0.38，
相似系数介于 0.58~0.84[31]，江华苦茶群体相
似系数在 0.44~0.84 之间，相比之下江华苦茶
群体的遗传距离较大，遗传基础较宽，遗传
多样性程度高于无性系品种。这主要因为我
国在无性系品种选育时，同一地区内的大部
分育成品种都源于遗传背景比较相似的选种
群体或亲缘关系比较接近的亲本，遗传基础
相对单一。
沈程文等[30]利用 RAPD 标记对江华苦茶
进行遗传多样性分析，多态位点 81.9%，H、I
分别为 0.28、0.33，与本实验结果相比遗传多
样性较低。两研究结果存在差异的原因主要有
两方面：首先，样本存在一定差异，实验所采
用样本为不同地理位置的江华苦茶群体。在南
岭山脉中，江华苦茶群体各自聚集，居群间的
地理距离较大，基因交流相对受阻。茶树种内
高度异交 [32]和与山茶属种间的自然杂交 [33]，
使茶树在长期进化过程中改变了各居群间的
遗传多样性，所以不同地理位置的江华苦茶居
群间本身存在一定遗传差异，即使茶树为后期
人工移植，也会因原生长地不同，产生性状差
异。其次，两实验采用的分子标记技术不同。
RAPD 标记技术采用人工合成的任意 10 个碱
基寡核苷酸序列作为引物，不需要预知基因组
的序列信息。 ISSR 标记根据植物广泛存在
SSR 的特点，利用在植物基因组中常出现的
SSR 本身的设计引物，标记一端可以锚定在
SSR 序列中，另一端则可以通过随机引物来筛
选[34]，通常为 16~25 个碱基序列。ISSR 引物
的长度较长，非随机性加强；引物退火温度
（ 52~58 ℃ ） 高 于 RAPD 的 退 火 温 度
（36~40℃），非特异性扩增减少，稳定性和可
重复性增加；同一个 SSR 序列引物与不同的
随机引物组合，可以获得更多的组合，与
RAPD 标记相比 ISSR 标记具有更为丰富的多
态性[35]。
140 茶 叶 科 学 32 卷

3.3 江华苦茶群体资源的利用和保护
茶树种质丰富的遗传多样性是茶树生物
学研究和优良品种选育的基础 [36]，但随着世
界各产茶国加速茶园良种化进程，无性系品种
逐步取代了地方群体种。茶树栽培品种的遗传
多样性降低，如日本栽培品种的多态性为
56.9%
[37]，肯尼亚无性系茶树的多态性为
62%
[38]，地方栽培品种的多样性面临着逐步丧
失的危险。如何有效地保护好这些丰富的基因
库，对今后茶树育种学具有重要意义。
江华苦茶是湖南四大群体品种之一，生长
于海拔 1 000~1 500 m 的南岭山脉之中[39]。其
群体内不同单株间存在较大差异，刘宝祥等[40]
通过对江华苦茶群体生物学特征的观察将其
分为 9 个类型，分别为白叶苦茶、金叶苦茶、
青叶苦茶、牛皮苦茶、竹叶苦茶、紫芽苦茶、
白毛苦茶、龙须苦茶、柳叶苦茶。龙翔等 [41]
的研究结果表明，江华苦茶群体中既存在发芽
早、茸毛多、氨基酸含量高，适制绿茶的单株；
同时也存在叶形宽大、芽叶黄绿、茶多酚含量
高，适制红茶的单株。丰富的表型变异必然蕴
藏着遗传变异 [42]，但表型变异并不能完全代
表各单株间真正的遗传信息 [43]。通过分子标
记技术了解江华苦茶群体各单株间本质的亲
缘关系，是今后利用这一茶树资源开展育种工
作的基础。同时通过 ISSR 聚类分析掌握群体
内核心种质的相关信息，并为江华苦茶群体今
后的保存工作提供理论性指导并且有助于简
化群体的保护、保存工作。
4 结论
通过应用 ISSR 分子标记对江华苦茶群体
进行遗传多样性分析，获得江华苦茶群体有效
等位基因数（Ne）、Nei′s 基因多态性（H）和
Shannon 信息指数（I）分别为 1.68、0.38、0.56；
扩增条带平均多态性比率达 95.40%；各单株
间的相似系数在 0.44~0.84 之间，平均为 0.63，
结果表明江华苦茶群体有较高的遗传多样性。
供试材料的 UPGMA 遗传相似性聚类显示，在
相似系数为 0.63 处可将参试的 70 份种质资
源分为六大类，其中 5 个复合组，1 个独立组。
在茶树基因多样性面临威胁的今天，对类似江
华苦茶群体品种的地方特色种质进行研究，有
助于今后茶树资源的收集、保存和保护，能够
有效防止茶树遗传多样性进一步丢失，同时也
为今后的杂交育种工作做好准备。

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