全 文 ：西北植物学报 , 2011 , 31(2):0236-0241
Acta Bot.Boreal.-Occident.Sin.
　　文章编号:1000-4025(2011)02-0236-06 ＊
滇北球花报春多倍体诱导及核型分析
张　超1 , 2 ,李枝林1 ,李　佳1 ,张　婷2 ,蒋亚莲2 ,李　涵2＊
(1云南农业大学 园林园艺学院 ,昆明 650205;2云南省农业科学院花卉所 ,昆明 650205)
摘　要:以滇北球花报春(Primula denticulata ssp.sinodenticulata)为供试材料 , 在离体条件下 , 采用秋水仙素对其
丛生芽进行诱导 ,比较不同浓度 、不同处理时间秋水仙素诱导多倍体的效果.结果表明:以 0.6%的秋水仙素处理
72 h 诱导效果最佳 ,诱导率达 54%.经形态学观察发现 ,变异材料叶色变深 , 叶片质感变厚;气孔面积增大 ,单位面
积气孔数目减少;染色体计数及核型分析显示 , 滇北球花报春的二倍体核型为 2n=2x=4m+16sm+2st , 四倍体核
型为 2n=4x=8m+32sm+4st ,均属 3A 核型 ,并成功获得了滇北球花报春的四倍体植株.
关键词:滇北球花报春;多倍体;秋水仙素;核型
中图分类号:Q343 文献标志码:A
Polyploid Induction and Karyomorphological Studies
of Primula denticulata ssp.sinodenticulata
ZHANG Chao
1 , 2 , LI Zhi-lin1 , LI Jia1 ,ZHANG Ting2 , JIANG Ya-lian2 , LI Han2＊
(1 College of Hort icu lture and Landscape , Yunnan Agricul tu ral University , Kunming 650205 , China;2 Flow er Research Ins ti tu te ,
Yunnan Academ y of Ag ricultu ral Sciences , Kunming 650205 , China)
Abstract:Tetraploids we re induced from in vi tro plant le ts of diploid Primula dent iculata ssp.sinodenticu-
lata by dipping shoo t tips in colchicine solutions at dif ferent concentrations and treat ing dura tions.The re-
sults showed:the best condat ion w as t reatment wi th 0.6% co lchicines for 72 h , and the induct ion rate w as
54%.Mutation buds w ere screened by mo rpholog ical appraisal.Tetraploid of P.dent iculata ssp.sinoden-
ticulata was characterized by darker leaf co lor , thicker leaves , larger stoma and less stomatal numbers in u-
nit area.Cy tological identif icat ion and kary omo rpholog ical studies indicated that the numbe r o f metaphase
chromosomes w ere formulated to be 2n =2x =4m +16sm +2st fo r P .dent iculata ssp.sinodenticulata ,
tet raploids w ere fo rmulated to be 2n=4x =8m +32sm +4st , their karyo types are al l 3A.Tetraploids P.
denticulata ssp.sinodenticulata were successfully induced.
Key words:Primula denticulata ssp.sinodenticulata;polyploidy;colchicines;kary otype
　　报春花属(Primula.L)是报春花科(Primulace-
ae)最大的属 ,全世界大约有 500 种 ,中国有 294 种
21个亚种 18个变种.球花报春系指报春花科报春
花属球花报春组(Primula sect.denticulata)植物 ,
该组植物开放时 ,花为蓝紫色 ,十分艳丽;整个花序
呈球状 , 观赏价值极高 ,国外引种中国球花报春
(Primula denticulata ssp.dent iculata)的历史悠
久 ,现已培育出多个园艺品种 ,广泛用于盆栽或庭院
种植中 ,中国拥有球花报春植物 6种 ,均处于野生状
态[ 1] ,并且国内对其应用尚鲜有研究 ,还有待开发.
＊ 收稿日期:2010-11-08;修改稿收到日期:2011-01-10
基金项目:云南省高端科技人才引进计划(20080A003)
作者简介:张　超(1984-),男(汉族),在读研究生 ,主要从事园林植物种质资源创新与利用.E-m ail:zhangchao0823@yeah.net
＊通讯作者:李　涵 ,助理研究员 ,主要从事细胞生物学研究.E-mail:lih an528@126.com
滇北球花报春(P.denticulata ssp.sinodenticulata)
为报春花科报春属球花报春亚组球花报春系植物中
的一种 ,主要分布于云南丽江 、大理等地 ,开花时蓝
紫色的花球配上簇状叶丛 ,极具观赏性 ,是一种难得
的观赏球花报春资源.本研究中以观赏价值较高的
品种为材料 ,研究四倍体化学诱导及再生植株倍性
鉴定技术 ,为报春种质资源利用与创新及培育具有
商业价值的新品种提供参考.
1　材料和方法
1.1　材　料
在云南省农业科学院花卉研究所育种基地内 ,
选取观赏价值较高的品种滇北球花报春为供试材
料 ,经鉴定其染色体数为 2n=2x=22.
1.2　方　法
1.2.1　无菌材料的获得　选取长势优良的滇北球
花报春(处于生长前期即 4 ～ 6月)植株作为实验材
料 ,去除外部多余叶片 ,留生长点及基部两三片叶 ,
用自来水清洗干净 ,先用 75%的酒精灭菌 40 ～ 60
s ,无菌水冲洗 3 次 , 放入质量浓度为 0.05% ～
0.2%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡处理 10 ～ 20 min ,
用无菌水冲洗 3次 ,之后再放入质量浓度为 1%～
2%的次氯酸钠溶液中浸泡处理 8 ～ 15 min ,用无菌
水冲洗 3次后 ,在无菌条件下 ,将灭菌后的植株接入
不含附加成分的 MS 培养基中.
1.2.2　多倍体的诱导　将外植体进行扩繁 ,取长势
优良的丛生芽 , 在光照 10 ～ 12 h/d , 光强 800 ～
1 200 lx ,温度 22 ～ 26℃的环境条件下 ,培养 2 ～ 3
d ,然后在超净工作台上 ,不同浓度(0.2%、0.4%、
0.6%、0.8%和 1%)的秋水仙素(秋水仙素从 Sigma
公司购买 ,用无菌水配制不同浓度后 ,过滤灭菌)用
移液枪加入到接种丛生芽的培养基上 ,在其培养基
上覆盖薄薄一层 ,使丛生芽和其生长点可以充分接
触到秋水仙素.然后浸泡不同时间(24 、48 、72和 96
h),逐次取出浸泡的丛生芽 ,用无菌水清洗 3次 ,接
种到不含秋水仙素的 MS+0.1 mg L-1 6-BA+0.1
mg L-1 NAA+0.1 mg L-1 KT 培养基中.
1.2.3　多倍体的筛选及鉴定　(1)外部形态初步筛
选　观察诱变材料的长势 、叶片外形 、叶色变化和根
系状况等 ,根据这些表型特征对变异材料进行初选.
(2)气孔鉴定　选择形态变异较大的植株 ,撕取
叶片上表皮 ,用无菌水作为展平剂进行制片 ,在 Ni-
kon显微镜(DIGITA L CAMERA DXM 1200)下观
察 ,并用二倍体的叶片气孔作为对照.取长势一致的
叶片 20片 ,测量气孔的长直径 、短直径 、气孔面积和
单位面积的气孔数 ,取各指标平均值 ,其中气孔面积
平均值=3.14×长半径平均值×短半径平均值.以
气孔的显著增大作为变异的初步鉴定指标.
(3)染色体数鉴定　取形态变异株的幼嫩根尖 ,
洗净后置于 0.002 mol L-1 8-羟基喹啉预处理 3 h
后 ,用无菌水漂洗数次 ,卡诺氏固定液(无水乙醇∶
冰乙酸=3∶1)于冰水混合物中固定 30 min ,无菌
水漂洗数次 ,1∶1的 1 mol L -1盐酸与 45%醋酸混
合液与 60℃水解 1 min ,卡宝品红染色 1 h ,常规压
片 ,光学显微镜下观察 ,照相 ,并制作永久封片[ 2] .用
Nikon显微镜(Eclipse E800)镜检拍照 ,根据染色体
数确定其倍性.
1.2.4　变异植株的稳定及扩繁　经上述 3种方法
鉴定筛选的变异植株 ,切取基部生长点和新生的丛
生芽 ,接种在 MS +0.1 mg L-1 6-BA +0.1 mg
L
-1
NAA+0.1 mg L-1 KT 培养基扩繁 ,经 3 ～ 4
代的稳定繁殖后 ,重新鉴定染色体数目.选取已加倍
的材料扩繁 ,在 MS 培养基上生根培养.当试管苗的
根长达 1.5 ～ 2.0 cm 时进行炼苗移栽.
1.2.5　核型分析　有丝分裂中期染色体核型分析
采用李懋学等的标准[ 3] ,核型分类按 Stebbins的标
准划分[ 4] ,核型对称程度用着丝点端化值(Centro-
meric te rm inalization value ,简称 T .C)来衡量.分
析时每种取 5个分散良好的细胞进行测量计算 ,取
平均值.
2　结果与分析
2.1　秋水仙素对滇北球花报春丛生芽的诱导
以形态学变异和气孔显著性增大作为诱变效果
的初步鉴定指标 ,不同处理丛生芽的诱变情况如表
1所示.可以看出 ,用 0.6%的秋水仙素处理 72 h ,未
发生较大死亡 ,其变异率较高 ,达到了 54%,为最佳
的诱变处理组合.
2.2　多倍体植株的鉴定
2.2.1　诱导芽的外部形态　经秋水仙素诱导的丛
生芽 ,部分出现叶形发生改变 ,植株丛生性增强 ,叶
色加深 ,叶片质感变厚 ,根变为粗短 ,伴有轻微的木
质化(图版Ⅰ ,1).四倍体试管苗生长缓慢 ,正常苗分
化期为 25 d左右 ,而变异苗分化期需延长到45 ～ 50
d.
2.2.2　叶片气孔数量及气孔面积测定　与相应的
正常二倍体的材料相比 ,滇北球花报春诱变后的材
料气孔面积有所增大 ,同等面积的气孔数有所减少
2372 期　　　　　　　　　　　　　　张　超 ,等:滇北球花报春多倍体诱导及核型分析
(表 2 ,图版 Ⅰ ,2 、3),据统计数据分析 ,气孔的长直
径 、宽直径和面积差异显著.这表明滇北球花报春的
倍性与气孔密度存在着负相关的关系.此结论与有
关报道[ 5-6] 相一致.与此同时 ,同一变异材料同一叶
片表皮的气孔大小存在一定差异 ,而且部分气孔出
现畸形 ,即内孔的椭圆形不规整 ,说明部分变异材料
为嵌合体的可能性较大.
2.2.3　染色体的鉴定　经外部形态及气孔鉴定出
的变异苗 ,利用压片法对其进行染色体数鉴定.结果
表明 ,二倍体染色体数目 2n=22 ,由于滇北球花报
春染色体少而且小 ,所以能够较清楚看到四倍体染
色体为 2n=4x =44(图版 Ⅰ , 5 、6),说明部分二倍体
丛生芽经秋水仙素诱导后 ,发生了染色体加倍.
2.2.4　核型分析　经细胞学观察 ,滇北球花报春体
细胞染色体数目为 2n=22 ,体细胞中期染色体由 4
条中部着丝点染色体 、16条亚中部着丝点染色体和
2条亚端部着丝点染色体组成.55%的染色体臂比
值>2 , T .C%值为 67.32%.核型公式为 2n=2x =
4m +16sm+2st ,核型不对称性属于 3A(表 3 、4;图
版 Ⅰ ,7).
经加倍诱导后形成的变异植株的体细胞染色体
数目为 2n=4x=44 ,其染色体数目为原二倍体的 2
倍 ,即为同源四倍体.其中体细胞中期染色体由 8条
中部着丝点染色体 、32条亚中部着丝点染色体和 4
条亚端部着丝点染色体组成 , 59%的染色体臂比值
>2 , T .C%值为 67.19%,其核型公式为 2n=4x =
8m +32sm +4st , 核型也属于 3A(表 3 、4;图版
Ⅰ ,8).在检测中发现有极少数个体出现非整倍变异
表 1　滇北球花报春的诱导效果
Table 1　The inducing effects o f colchicines in P.denticulata ssp.sinodenticulata
秋水仙素
Colchicine/%
处理时间
Treated t ime/h
总芽数
T otal t reated
bud s
死亡数
No.of
death bud s
死亡率
Death rate/%
变异数
No.of
mutation bud s
变异率
Mu tat ion rate/%
0.2
24 50 0 0 0 0
48 50 0 0 1 2
72 50 0 0 4 8
96 50 1 2 6 12
0.4
24 50 0 0 2 4
48 50 0 0 7 14
72 50 1 2 8 16
96 50 2 4 10 20
0.6
24 50 0 0 6 12
48 50 1 2 23 46
72 50 1 2 27 54
96 50 2 4 9 18
0.8
24 50 0 0 9 18
48 50 1 2 8 16
72 50 2 4 7 14
96 50 3 6 2 4
1.0
24 50 2 4 11 22
48 50 5 10 1 2
72 50 6 12 2 4
96 50 8 16 0 0
CK 50 0 0 0 0
表 2　变异株与二倍体植株的气孔形态比较
Table 2　Compa rison of stoma morpholog y o f variation plants and strain diplo id plants
材料
Material
气孔长直径
Stoma longdiameter/μm
短直径
Stoma shortdiam eter/μm
气孔长直径/短直径
S toma longdiam eter/
shortdiameter
气孔面积
S toma area/μm2
同等面积的气孔数
The stoma num ber
per/μm2
变异株 Varian t 14.8 8.5 1.74 98.75 8
二倍体植株
Diploid plan t
9.2 8.7 1.06 62.83 13
238 西　北　植　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　31 卷
表 3　滇北球花报春二倍体和四倍体的核型比较
Table 3　The karyo type da ta of diploid and te traploids plant o f P.denticulata ssp.sinodenticulata
种名
Specie s
核型公式
Karyo type f ormula
染色体数目
No.of
chromosome
T.C/%
臂比
Arms ra tio>2
相对长度比(长/短)
Relat iv e value of
long a rm/sho rt arm
核型分类
Karyo type type
滇北球花报春(2n)
P.dent iculat a 2n=2x=4m+16sm+2st 22 67.32 0.55 1.55 3A
滇北球花报春(4n)
P.dent iculat a 2n=4x=8m+32sm+4st 44 67.19 0.59 1.97 3A
　　注:着丝点端化值=(长臂的总长/染色体的总长)×100%
Not e:T .C(%)=(tot al length o f long-a rms/to tal leng th o f all chromosomes)×100%
表 4　滇北球花报春二倍体和四倍体染色体参数
Table 4　The chromosome da ta o f diploid and te traploid plants of P.denticulata ssp.sinodenticulata
品种
Species
染色体序号
Ch rom osome No. 相对长度Relat ive length/% 臂比(长/短)Long arm/sh ort arm 染色体类型Ch romosome type
滇北球花报春(2n)
P.denticu lata
1 11.00+31.00 2.82 sm
2 12.50+30.00 2.40 sm
3 14.00+25.00 1.79 sm
4 13.50+24.50 1.81 sm
5 11.50+21.00 1.83 sm
6 9.50+23.50 2.47 sm
7 10.00+23.00 2.30 sm
8 8.00+23.00 2.88 sm
9 12.50+18.50 1.48 m
10 15.50+16.00 1.03 m
11 6.50+21.00 3.23 st
滇北球花报春(4n)
P.denticu lata
1 12.50+32.50 2.60 sm
2 12.50+32.50 2.60 sm
3 19.00+25.00 1.32 m
4 16.50+27.00 1.64 m
5 11.50+29.50 2.57 sm
6 12.00+29.00 2.42 sm
7 11.50+25.50 2.22 sm
8 13.00+24.50 1.88 sm
9 11.50+24.50 2.13 sm
10 13.00+22.50 1.73 sm
11 11.50+23.00 2.00 sm
12 11.50+21.00 1.83 sm
13 7.00+23.50 3.36 st
14 6.00+22.50 3.75 st
15 10.00+18.00 1.80 sm
16 8.50+18.00 2.12 sm
17 11.50+13.50 1.17 m
18 11.50+12.50 1.09 m
19 7.50+16.50 2.2 sm
20 7.50+16.00 2.13 sm
21 6.50+17.50 2.69 sm
22 7.50+16.00 2.13 sm
　　注:m .中部着丝点染色体;sm .亚中部着丝点染色体;s t.亚端部着丝点染色体.
Note:m.Metacent ric ch rom osome;sm.Subm etacen tric chromosome;st.Acrocent ric ch romosome.
2392 期　　　　　　　　　　　　　　张　超 ,等:滇北球花报春多倍体诱导及核型分析
(图版 Ⅰ , 4).如:2n=4x -3=41 的情况.这可能是
在细胞分裂过程中姊妹染色体出现滞后的原因造成
的.
3　讨　论
在组织培养与多倍体育种相结合的应用中 ,常
用的诱变剂是秋水仙素 ,根据材料与诱导方式的不
同选用不同的浓度.常用的诱导方式有浸渍法 、点滴
法和混培法.本实验结合浸泡法和混培法 ,将灭菌的
秋水仙素溶液加入到培养基上进行浸泡 ,在保持植
株正常生长的条件下 ,秋水仙素可以慢慢渗透到植
株中 ,相对于浸泡法而言 ,间接减少了对植株的伤害
程度 ,而对于混培法而言 ,增加了秋水仙素对植株的
接触面积 ,从而提高了诱变效率.由于滇北球花报春
叶基生成莲座状叶丛 ,更适合于此种方法.
秋水仙素浓度及处理时间是影响诱导多倍体的
关键因素.郑思乡等[ 7] 利用秋水仙素离体诱导百合
不定芽的研究表明 ,浓度为 0.05%诱导变异率高于
0.1%的诱导率;李涵等[ 8]利用秋水仙素诱导齿瓣石
斛丛生芽 ,在浓度为 0 ～ 0.1%区间内 ,浓度越高 ,植
株变异率越低 ,而变异率与浸泡时间没有明显的相
关性;张志胜等[ 9] 利用秋水仙素离体诱导红掌愈伤
组织表明 ,在 0.05%～ 0.1%区间内 ,低浓度长时间
处理 ,四倍体诱导率高 ,高浓度短时间处理其诱导率
低.本研究表明 ,在秋水仙素浓度为 0.2%和 0.4%
时 ,短时间的处理 ,秋水仙素对其表现不敏感.在 0.
2%～ 0.6%区间 ,而随着秋水仙素浓度的升高和处
理时间的延长 ,其变异率不断增加 ,但死亡率也随之
增加 ,而在 0.6%～ 1.0%区间 ,死亡率增加 ,变异率
开始降低.总体来说 ,秋水仙素处理时间和浓度对不
同的植物有着不同的敏感度 ,本实验在浓度为 0.
6%下处理 72 h ,变异率达到 54%,说明秋水仙素在
此情况下表现比较敏感.
试验在形态变异和气孔鉴定的基础上 ,初步判
断秋水仙素诱导的直接效果多为嵌合体.诱变材料
的继代稳定及扩繁对其保存和筛选起了至关重要的
作用.嵌合体若不经过分离稳定则会产生回复突变 ,
最后变成正常的二倍体.而本研究选取处理丛生芽
生长点长出的形态明显变异的叶片 ,另外 ,还有少数
丛生芽经过秋水仙素处理后形成愈伤组织 ,将其培
养在 MS+6-BA 0.3 mg L -1 +NAA 0.1 mg L-1
的培养基上再次诱导生芽 ,然后经过 3 ～ 4代丛生芽
的不断分割和扩繁 ,筛选出了稳定的多倍体再生植
株.
经细胞学染色体鉴定滇北球花报春的体细胞中
期染色体数目为 2n=2x=22;经加倍后的体细胞中
期染色体数目为 2n=2×2x=2×22=44 ,是原二倍
体的 2倍 ,染色体的类型和分类都相同 ,唯一不同的
是数量上的加倍 ,以此推断 ,多倍体为同源四倍体.
现已有部分四倍体材料炼苗准备移栽 ,将进一
步在田间对其性状进行观察 ,并准备开展田间的一
系列试验及对比测试 ,期望筛选出具有花色大而奇
特 、抗性好等优良性状的品系.
参考文献:
[ 1] 　中国科学院昆明植物研究所.云南植物志(第十五卷)[ M ] .北京:科学出版社 , 2003:499-500.
[ 2] 　ZHU H F(朱慧芬), ZHANG CH Q(张长芹),G U ZH J(顾志建), GONG X(龚　洵).A karyomo rp hological s tu dy on nine species P rim-
ula(Primulaceae)[ J] .Acta Botanica Yunnanica(云南植物研究), 2001 , 23(4):466-472(in C hinese).
[ 3] 　LI M X(李懋学), CHEN R Y(陈瑞阳).A suggest ion on the standardization of karyotype analysis in plants[ J] .Journa lo f Wuhan Botani-
cal Research(武汉植物学研究), 1985 , 3(4):297-302.
[ 4] 　STEBBINS G L.Ch romosome and evolut ion in higher plan ts[M ] .London:Edw ard Arnold L TD , 1971:87-90.
[ 5] 　CHANDLER C K , LYRENE P M.Relat ionship b etw een gu ard cell length and ploidy in Vaccinium[ J] .Hor t.Sci., 1982 , 17(1):53-54.
[ 6] 　CHANG Y M(常月梅).T he ad vances in ident if ication of f ruit t ree polyp loidy[ J] .Shan xi Forestr y S cience and Technolog y(山西林业科
技), 2000 ,(1):1-9(in Chinese).
[ 7] 　ZHENG S X(郑思乡), ZHANG H L(章海龙), DONG ZH Y(董志渊), et al.Polyploidy induct ion and in vi tro bulb propagat ion of Li lium
o riental h ybrids[ J] .Journa l o f Southwest Ag ricu ltura l Universi ty(西南农业大学学报), 2004 , 26(3):260-263(in C hinese).
[ 8] 　LI H(李　涵), LONG CH L(龙春林), ZHENG S X(郑思乡), et al.Polyploid indu ction of Cymbid ium iridioid es and i t s biological charac-
t eri st ics[ J] .Acta Hort icul turae S inica(园艺学报), 2005a , 32(5):853(in Chines e).
[ 9] 　ZHANG ZH SH(张志胜), LI Y H(黎扬辉), JIANG L(姜　蕾), et a l.In vi tr o t et raploid induction and i t s identi ficat ion in anthurium and
m eanum[ J] .Acta Hort icul turae S inica(园艺学报), 2007 , 34(3):729-734(in C hinese).
240 西　北　植　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　31 卷
　　图版 Ⅰ 　1.左为四倍体组培苗 右为二倍体组培苗;2.二倍体叶片气孔 , ×40;3.四倍体叶片气孔 , ×40;4.根尖染色体非整数加倍 2n=4x
-3=41;5.二倍体根尖染色体 , 2n=2x=22;6.四倍体根尖染色体 , 2n=4x=44;7.滇北球花报春二倍体有丝分裂中期染色体及核型;8滇北球
花报春四倍体有丝分裂中期染色体及核型;标尺=10μm.
Plates Ⅰ 　Fig.1.Leave of tet raploid plan t in lef t leave of dip loid plant in right;Fig.2.Th e stom a size of diplod plant , ×40;Fig.3.Th e sto-
m a size of tet raploid plant , ×40;Fig.4.The integer double of th e chromosome number of root tip , 2n=4x-3=41;Fig.5.The ch romosome
number of root tip of diploid p lan t , 2n=2x=22;Fig.6.The chromosome number of root tip of tet raploid plan t , 2n=4x=44;Fig.7.T he m eta-
ph ase ch rom osom es and kary otypes of diploid plan t of P.den ticu lata ssp.sinoen ticu lata;Fig.8.The metaph ase chromosomes an d karyotypes of
tet raploid plant of P.denticu lata ssp.sinoden ticulata;Bar=10μm.
2412 期　　　　　　　　　　　　　　张　超 ,等:滇北球花报春多倍体诱导及核型分析