全 文 ：Determination of GA3 , IAA , ABA and ZT in Dormant
Buds of Allium ovalifolium by HPLC
CHEN Y uan-ping , YANG Wen-yu
(Colleg e of Ag riculture , Sichuan Agricultural University , Yaan 625014 , Sichuan , China)
Abstract:An improved method of ext raction , purif ication and determination to four internal ho rmones
(GA3 , IAA , ABA and ZT)in dormant buds of All ium ovali folium w ith Reversed-phase High Perfor-
mance Liquid Chromatography has been developed.Chromatographic conditions are:Hypersil ODS C18
reverse phase column(150 mm×4.6 mm ,5μm), methanol-0.6% acet ic acid mobile phase , gradient
elution , UV detecto r set at 254 nm.The result show s that this methods is a accurate and high-separa-
tion-efficiency technique , suitable to determine large quantities of samples.
Key words:A llium ovali folium ;dormant buds;internal hormones;HPLC
·研究简报·
卵叶韭休眠芽中 GA 3 、IAA 、ABA 和 ZT 的
高效液相色谱法测定
陈远平 , 杨文钰
(四川农业大学 农学院 , 四川 雅安　625014)
摘要:以卵叶韭休眠芽为试材 , 改进了提取纯化赤霉素(GA 3)、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)和玉米素(ZT)4 种内源
激素的处理方法和色谱条件。采用 Hypersil ODS C18柱(150 mm×4.6 mm , 5μm), 甲醇-0.6%冰乙酸进行梯度洗
脱 ,紫外检测波长 254 nm。实际分析样品表明 ,本法分离度好 , 准确度高 ,适合大批量测定。
关键词:卵叶韭;休眠芽;内源激素;高效液相色谱
中图分类号:S633.3;O657.72　　文献标识码:A　　文章编号:1000-2650(2005)04-0498-03
　　卵叶韭(All ium ovali folium Hand.-Mazz.)又
名鹿耳韭 ,百合科葱属多年生草本植物 。近年来 ,卵
叶韭作为药食兼用的森林野菜 ,营养丰富 、口感好 ,
深受消费者的喜爱 ,市场需求与日俱增 ,但由于卵叶
韭鳞茎分蘖产生的芽具有较长的休眠特性 ,阻碍了
它的引种繁殖。此外 ,以往多采用固定洗脱法测定
多种植物内源激素常出现分离度差 ,杂质峰干扰及
峰形不良。为了研究卵叶韭分蘖芽休眠的生理 ,本
文探讨了卵叶韭休眠芽中赤霉素(GA3)、3-吲哚乙
酸(IAA)、脱落酸(ABA)和玉米素(ZT)4 种内源激
素的提取纯化方法及色谱测定条件 。
1　试验部分
1.1　仪器与试剂
Agilent 1100LC 型高效液相色谱仪系统;M IL-
LI-Q超纯水纯化系统;旋转蒸发器;冷冻离心机;
振荡仪;冷冻干燥机;低温冰箱;0.45μm 超微滤膜。
ABA 、IAA 、GA3 、ZT 为 SIGMA公司产品;甲醇
为 Fisher Chemical公司色谱纯;冰乙酸为分析纯;聚
乙烯吡咯烷酮(PVPP);实验用水为超纯水。
1.2　色谱条件
色谱柱:Hypersil ODS C18柱(150 mm ×4.6
第 23 卷　第 4 期
2005年 12 月 　　　　　　　　 　
四川农业大学学报
Journal of Sichuan Ag ricultural University
　　　　　　　　 　Vol.23 No.4
Dec.2005
收稿日期:2005-08-01
基金项目:盆周山区农业可持续发展技术研究与示范项目(04NG020-017)。
通讯作者(Corresponding author)。
mm ,5μm);流动相:甲醇-0.6%乙酸 ,梯度洗脱 ,
具体条件见表 1;柱温:35 ℃;进样量 10μL ;流速:1
mL/min;紫外检测波长:254 nm;定量方法:外标校
准曲线法 。
表 1　梯度洗脱程序
Table 1　P rogram of gradient elution
时间
Time(min) 甲醇Methanol(%) 0.6%冰乙酸0.6%Acetic acid (%)
0 0.0 100.0
10 50.0 50.0
30 50.0 50.0
1.3　试验材料
试材为卵叶韭休眠芽 ,取样后液氮速冻 20 min ,
保存在-86 ℃冰箱中备用。
1.4　内源激素的提取 、纯化
参考孙奇的方法[ 1]并略有改进 。准确称取卵
叶韭休眠芽 1.0左右(精确到 0.1 mg),放到预冷的
研钵中 ,加入 4 ℃预冷的80%甲醇 15mL ,冰浴研磨
成浆 , 4 ℃下浸提 12 h ,于 4 ℃ 5000 r/min 离心 15
min ,取上清液保存于 4 ℃冰箱中 ,残渣分 3次 ,间隔
12 h ,每次加入 80%甲醇浸提液 10 mL 左右浸提后
同上离心 ,收集合并全部浸提液;将提取液在 36 ℃
下减压浓缩至 10 mL ,用 20 mL 左右超纯水多次洗
涤旋转蒸发瓶 ,合并浓缩液和洗涤液 , 加入 0.1 g
PVPP 吸附酚类物质及色素 , 4 ℃下摇床振荡 1 h 后
放到-86 ℃超低温冰箱冷冻 ,完全冻结后取出于 4
℃冰箱中融化 , 4 ℃下 10000 r/min离心 15 min ,弃
去杂质;得到内源激素初提液 ,将 30 mL 左右的内
源激素提取液倒入 10 mL 培养皿中 ,放到低温冰箱
中完全冻结后转入冷冻干燥机冷阱中进行冷冻干燥
除去水 ,干燥完后 ,每个培养皿用约 10 mL 甲醇分 3
次溶解洗涤 ,甲醇定容至 15 mL;过 0.45μm超微滤
膜 ,作为供试液 。整个过程都在弱光下完成。
2　结果与讨论
2.1　标准曲线绘制
用外标峰面积法测定 。配置一系列质量浓度的
标准混合溶液 ,用峰面积(Y)对质量(X ,μg)作线性
回归曲线 ,得到的回归方程 、工作曲线的线性范围及
检出限 ,如表 2所示 ,其标准曲线如图 1 。由表 2可
知 ,各种激素标准品的线性关系极显著 。
2.2　加标回收率试验
准确称取卵叶韭休眠芽 6.0000g ,捣碎匀浆后
平分成 6等份 ,第一份为本底样品 ,其余各份样品中
均加入 GA3 0.50 mg 、IAA 0.25 mg 、ABA 0.25 mg
和 ZT 0.25 mg ,所有 6份均照“1.4”节方法进行提
取纯化 ,计算回收率(结果见表 3)。
表 2　4 种内源激素的工作曲线
Table 2　Calibration curves of 4 internal ho rmones
内源激素
Inte rnal
ho rmones
回归方程
Regression
equation
相关系数
Correla tion
coefficient
线性范围
Linear
range
(μg)
检出限
Detection
Lim it
(μg)
GA3 Y =-3.12+652.03 X 0.9941 0.1 ～ 10 0.005
IAA Y =19.82+9868.90 X 0.9998 0.1 ～ 10 0.001
ABA Y =-10.01+42345.02X 0.9999 0.1 ～ 8 0.001
ZT Y =-139.46+25459.10X 0.9976 0.1 ～ 5 0.006
图 1　4 种内源激素标准品的色谱图
Fig 1　Chromatogram of 4 internal hormone standards
表 3　4种内源激素的回收率
Table 3　The recovery rates of 4 internal hormones
激素
Internal
ho rmones
加入量
Added
(mg)
平均测得量
Found
(mg)
平均回收率
Average
recovery(%)
RSD
(%)
GA3 0.50 0.481 96.2 1.02
IAA 0.25 0.237 94.8 0.82
ABA 0.25 0.234 93.6 0.72
ZT 0.25 0.221 88.4 1.85
2.3　样品分析
采用外标法对其中 1 份卵叶韭休眠芽样品的
GA3 、IAA 、ABA和 ZT 进行定量测定 ,其每克鲜样含
量分别为 133.12 ng 、180.64 ng 、6.85 ng 、93.02 ng ,
其色谱图见图 2。
2.4　休眠芽内源激素的提取 、纯化
据前人的研究发现 ,采用溶剂分配 、柱层析分离
等方法 ,回收损失率大[ 2] ;另外 ,溶剂分配法常因 pH
值调节不当 ,导致 GA3 含量下降[ 1 ,3] ,游离 ABA 含
量上升[ 4] ;植物激素的含量一般在 μg ～ ng/(g ·
FW),酚类及亲脂色素等物质的干扰常常影响测定
的准确性 。本试验通过加 PVPP 、低温冻融和高速
离心相结合除去样品中大量的色素 、糖苷及酚类等
499第 4 期　　　　　　　陈远平(等):卵叶韭休眠芽中 GA3 、IAA、ABA和 ZT 的高效液相色谱法测定　　　　　　　　
物质 ,可以排除酚类 、亲脂色素等的影响;此外 ,采用
冷冻干燥法取代旋转蒸发仪减压浓缩除去水即避开
温光分解又方便大批样品处理。从“ 2.2 , 2.3”结果
可以看出 ,本法除了可用于孙奇所提到的测定玉米
素(ZT)[ 1] 外 ,还可以应用到赤霉素(GA3)、生长素
(IAA)和脱落酸(ABA)的提取纯化中 。
图 2　卵叶韭休眠芽样品的色谱图
Fig 2　Chromatogram of dormancy buds
sample o f Allium ovalifolium
2.5　流动相的选择
在联合测定植物内源激素时 ,多采用固定洗脱
法[ 4-6] ,但往往易造成出峰时间早 ,分离度差 ,杂质
峰干扰多 ,峰形不良;而采用梯度洗脱法延缓出峰时
间 ,以避开部分杂质峰干扰 ,从而达到较好的分离效
果(见图 1 ,图 2)。由图 2 可见 GA3 、IAA 、ABA 和
ZT 与其他未知的紫外吸收峰之间得到较满意的分
离。但当ZT 含量较高时 ,仍存在拖尾现象和保留
时间差异 。
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(本文审稿:杨婉身)
500　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　四川农业大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 23 卷