全 文 ：蕨麻乙醇提取物抑制大鼠急性心肌缺血
再灌注损伤导致的心肌细胞凋亡
秦晓静1，吕琪2，张新宁2，陈福泉2，李灵芝2，3* ，张永亮2，3*
(1. 武警后勤学院 附属医院 病理科，天津 300162;
2. 武警后勤学院，天津 300162;3. 天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室，天津 300162)
［摘要］ 目的:观察蕨麻乙醇提取物对大鼠结扎冠状动脉所致急性心肌缺血再灌注损伤导致的心肌细胞凋亡的保护作
用，以及对心肌细胞凋亡信号通路中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 9、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 3(Caspase-9，
Caspase-3)表达的影响。方法:选取雄性 SD大鼠 96 只随机分为手术对照组，模型组，蕨麻乙醇提取物 0. 9，1. 8，3. 6 g·kg －1干
预组，阳性药物恬尔心组(盐酸地尔硫卓，diltiazem，30 mg·kg －1)。通过结扎大鼠冠状动脉左前降支建立急性心肌缺血再灌
注模型。采用原位末端标记法检测心肌细胞凋亡;RT-PCR检测心肌组织 Caspase-3，Caspase-9 mRNA水平;免疫组化染色半定
量检测 Caspase-3，Caspase-9 蛋白水平。结果:TUNEL结果提示心肌缺血再灌注损伤后，心肌细胞出现大量凋亡，模型组凋亡
指数为(31. 5 ± 3. 6)%;各组蕨麻乙醇提取物均明显抑制缺血再灌注损伤所致的心肌细胞凋亡。模型组细胞凋亡导致
Caspase-3，Caspase-9 mRNA及蛋白大量表达，而给予蕨麻乙醇提取物后，1. 8，3. 6 g·kg －1剂量组缺氧损伤心肌 Caspase-9
mRNA水平显著降低(P ＜ 0. 05) ，0. 9 g·kg －1剂量组与模型组相比未见明显差异。各剂量组蕨麻乙醇提取物均可显著降低心
肌组织 Caspase-3 mRNA水平(P ＜ 0. 05)。免疫组化分析提示各干预组蕨麻乙醇提取物均可显著抑制 Caspase-3，Caspase-9 蛋
白的表达(P ＜ 0. 05)。结论:蕨麻乙醇提取物能够显著抑制急性心肌缺血再灌注所致心肌细胞凋亡，并抑制 Caspase-3，
Caspase-9 mRNA水平及蛋白水平的表达。
［关键词］ 蕨麻;心肌缺血再灌注;细胞凋亡;TUNEL;Caspase
［稿件编号］ 20110908018
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(30672774，81073152) ;天津
市自然科学基金重点项目(10JCZDJC21100)
［通信作者］ * 李灵芝，教授，博士生导师，Tel: (022)60578184，
E-mail:llzhx@ yahoo. cn;* 张永亮，教授，博士生导师，Tel: (022)
60578401，E-mail:zhang78127@ tom. com
［作者简介］ 秦晓静，医师，硕士研究生，Tel: (022)60578721，
E-mail:qinxj68@ hotmail. com
缺血再灌注损伤(ischemic reperfusion injury，
IRI)现已成为心血管研究的热点问题，理论研究和
临床实践都证实，心肌在血液供应阻断 30 min 以上
就会出现各细胞器超微结构的改变和功能障碍，导
致心肌细胞不可逆损伤乃至死亡，及时恢复心肌的
血液供应被视为挽救这部分心肌的重要措施。然
而，大量的动物实验和临床观察发现，在成功恢复心
脏血流，即心肌得到血液再灌注后，不仅心肌功能未
得到恢复，心肌损伤反而进一步加重，出现心率失
常、梗死面积扩大等现象，缺血再灌注损伤的发生发
展机制复杂，涉及到多系统多环节的异常［1-2］。中药
复方含多味中药，单味药又含有多种成分，因此中药
可通过多层次，多靶点，多环节发挥作用，从这种意
义上讲，中药抗心肌缺血再灌注损伤有其独特之处。
事实上，中药治疗心肌缺血再灌注损伤已有报
道［3］，如丹参、人参皂苷、绞股蓝总皂苷及川芎等都
有一定程度的心肌保护作用。蕨麻 Potentilla anseri-
na L. ，俗称人参果，藏名“卓老洒曾”，为蔷薇科植
物鹅绒萎陵菜的地下块根，主要产于我国青海、西藏
等高寒地带。蕨麻具有显著的抗缺氧［4-5］、抗氧
化［4，6］、清除自由基及抗疲劳作用［7］，提示其可能对
心肌缺氧导致的损伤具有一定的保护作用。本研究
通过建立大鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型，探讨
蕨麻乙醇提取物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用
及其机制，为开发蕨麻的药用价值奠定理论基础。
1 材料
1. 1 药物 蕨麻购自青海，粉碎后用 70%乙醇回
流提取，减压除净乙醇得浓缩浸膏 (每克浸膏相当
于 3. 0 g生药)。临用前用 0. 3%羧甲基纤维素制成
混悬液;恬尔心(盐酸地尔硫卓)由上海制药厂生
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产，批号 050104。
1. 2 试剂 TUNEL 凋亡检测试剂盒购自南京凯
基，TRIzol 试剂为美国 Invitrogen 公司产品，dNTP
Mix脱氧核苷酸混合物为日本 TaKaRa 公司产品，
cDNA逆转录试剂盒、TaqDNA 聚合酶皆由美国 Pro-
mega公司提供。Caspase-3，Caspase-9 抗体购自美国
Santa Cruz公司。SP法免疫组化试剂盒购自中杉金
桥。氨基甲酸乙酯(乌拉坦)、羧甲基纤维素(CMC)
购自天津科瑞斯公司。
1. 3 动物 SD大鼠，清洁级，雄性，体重(250 ± 20)
g，军事医学科学院动物试验中心提供，许可证号
SCXK(军)2002-001。
2 方法
2. 1 分组与给药 取 96 只健康雄性 SD 大鼠随机
分为 6 组:手术对照组、模型组、阳性药物对照组
(恬尔心 30 mg·kg －1)及蕨麻乙醇提取物 0. 9，1. 8，
3. 6 g·kg －13 个剂量组，每组 16 只。连续灌胃给药
14 d，手术对照组、模型组及恬尔心组灌胃给予等容
积 0. 3%羧甲基纤维素 14 d。恬尔心组于复制动物
模型前 2 h灌胃给予药物。
2. 2 模型的复制 乌拉坦 1 g·kg －1腹腔浅麻醉，
大鼠背位固定于动物手术台上。连接皮下导联，记
录大鼠基础心电图。沿胸骨左缘 3 ～ 4 肋间开胸，暴
露心脏，分离心包，挤出心脏，在左冠状动脉前降支
距左心耳下缘 2 mm处穿线，在结扎线下垫一皮筋，
迅速结扎左冠状动脉前降支，随即可见心脏前侧壁
颜色变成青紫色，还纳心脏，闭合胸腔。待大鼠恢复
平稳自主呼吸，观察动物心电图的改变，以Ⅱ导联
ST段明显抬高者，纳入后续实验，不符合者弃之不
用。其中手术对照组只穿线不结扎。缺血 30 min
后 2 次开胸，挤出心脏，剪掉皮筋，恢复冠状动脉左
前降支血供，还纳心脏，闭合胸腔。再灌注 120 min
后摘取心脏，进行相关检测。
2. 3 TUNEL原位末端标记法检测心肌细胞凋亡
按试剂盒说明书操作。TUNEL 染色按南京凯基公
司试剂盒(BIOTIN 标记 POD 法，石蜡切片专用)提
供的脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法
(TUNEL)原位检测凋亡细胞的 DNA 碎片。各组取
5 张石蜡切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，PBS(pH
7. 2 ～ 7. 4)冲洗，5 min × 3 次;浸入含 200 mL 0. 1
mol·L －1枸橼酸盐缓冲液(pH 6)的塑料盒中，高压
蒸气法(以喷气 2 min 为准)暴露抗原;PBS 冲洗;
3%H2O2室温下处理 15 min以阻断内源性过氧化物
酶活性，PBS冲洗，加 50 μL TUNEL 反应混合液，37
℃孵育 60 min，PBS 冲洗;加 POD 液 37 ℃孵育 30
min，PBS 冲洗;DAB 显色，光镜观察细胞核呈黄褐
色计为凋亡细胞。以 200 倍镜下单位面积内凋亡细
胞数占细胞总数的百分比为凋亡指数。
2. 4 RT-PCR检测 Caspase-3，Caspase-9 mRNA表达
制备心肌组织匀浆，按常规方法提取 RNA，cDNA
按试剂盒说明合成。Caspase-9，Caspase-3 及内参照
肌动蛋白(β-actin)的 PCR 扩增引物由美国 Invitro-
gen公司设计、合成。按试剂盒说明进行 PCR扩增。
扩增产物经琼脂糖凝胶(含 0. 5 mg·L －1伊文斯蓝)
电泳鉴定，FOTODYNE 凝胶图像分析系统摄片并分
析，结果以目的基因与内参基因吸光度 A 的比值表
示。Caspase-9 引物:上游 5-CCCGTGAAGCAAG-
GATTT-3，下游 5-TCTGTGGGTCTGGGAAGC-3，扩
增产物长度为 447 bp。Caspase-3 引物:上游 5-
GCACTGGAATGTCAGCTCGCAA-3，下游:5-GCCAC-
CTTCCGGTTAACACGAC-3，扩增产物长度为 556 bp。
2. 5 免疫组化检测 Caspase-3，Caspase-9 的表达
石蜡切片脱蜡至水，PBS(pH 7. 2 ～ 7. 4)冲洗，
5 min × 3 次;浸入含 200 mL 0. 1 mol·L －1枸橼酸盐
缓冲液(pH 6)的塑料盒中，高压蒸气法(以喷气 2
min为准)暴露抗原;3%H2O2室温孵育 20 min，以消
除内源性过氧化物酶活性;0. 01 mol·L －1 PBS 漂
洗，5 min × 3 次;血清封闭，室温 30 min 后 0. 01 mol
·L －1 PBS漂洗，5 min × 3 次;滴加一抗工作液(Cyt-
c，Caspase-9，Caspase-3 按 1∶ 200 稀释) ，湿盒中 4 ℃
孵育过夜;室温恢复 15 ～ 20 min 后，0. 01 mol·L －1
PBS漂洗，5 min × 3 次;滴加生物素化二抗，37 ℃孵
育 15 min;0. 01 mol·L －1 PBS漂洗，5 min × 3 次;滴
加 SP复合物，37 ℃孵育 30 min;0. 01 mol·L －1 PBS
震洗 5 min × 3 次;DAB 显色剂显色，自来水充分冲
洗;复染胞核，脱水、透明、封片。每张切片随机选择
400 倍视野，以胞核或胞浆染成棕黄色为阳性，用
IPP图像分析软件测定相对吸光度来半定量分析各
组 Caspase-3，Caspase-9 的表达。
2. 6 数据处理 计量资料以 珋x ± s 表示，采用 SPSS
10. 0 统计分析软件处理数据，多组均数比较用方差
分析，组间差异的比较采用 t检验。
3 结果
3. 1 动物存活情况 96 只 SD大鼠，冠状动脉结扎
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缺血再灌注术模型组、蕨麻乙醇提取物低、中、高剂
量组(0. 9，1. 8，3. 6 g·kg －1)、恬尔心组(30 mg ·
kg －1)组大鼠存活数分别为 11，10，11，12，13。手术
对照组由于单纯穿线不结扎，存活率为 100%。平
均存活率为 76. 6%。
3. 2 蕨麻乙醇提取物抑制急性心肌缺血损伤所致
的细胞凋亡 TUNEL染色结果:凋亡反应的阳性细
胞核呈棕褐色，核固缩，染色质边聚，胞浆不着色
(图 1)。手术对照组心肌细胞发生凋亡水平很低，
凋亡指数为(2. 5 ± 0. 4)%;缺血再灌注损伤后，心
肌细胞出现大量凋亡，凋亡指数为(31. 5 ± 3. 6)%;
给予蕨麻乙醇提取物后，各组细胞凋亡均受到显著
抑制，3. 6 g·kg －1组凋亡指数为(16. 1 ± 2. 4)%，
1. 8 g·kg －1组凋亡指数为(23. 3 ± 1. 7)%，0. 9 g·
kg －1组凋亡指数为(25. 4 ± 1. 8)%;阳性对照恬尔心
组凋亡指数为(23. 3 ± 2. 2)%，均较模型组显著降
低(P ＜ 0. 01) ，说明蕨麻乙醇提取物对缺血再灌注
损伤所诱导的细胞凋亡有显著的抑制作用。
3. 3 蕨麻乙醇提取物抑制 Caspase-3，Caspase-9
mRNA的表达 缺血再灌注损伤后，受损心肌内
Caspase-3 mRNA表达量较手术对照组显著升高，升
高将近 2. 9 倍。给予不同剂量蕨麻乙醇提取物干预
后，Caspase-3 mRNA水平显著降低(其中 3. 6，1. 8 g
·kg －1剂量组与模型组比较 P ＜ 0. 01，0. 9 g·kg －1
剂量组与模型组比较 P ＜ 0. 05)。阳性药物恬尔心
亦可显著降低 Caspase-3 mRNA表达水平(与模型组
比较 P ＜ 0. 05) (图 2)。同样的，与手术对照组相
比，模型组受损心肌组织内 Caspase-9 mRNA水平显
著升高(P ＜ 0. 01)。给予 3. 6，1. 8 g·kg －1剂量蕨
麻乙醇提取物可显著降低缺血再灌注损伤心肌
Caspase-9 mRNA水平(P ＜ 0. 05) ，而 0. 9 g·kg －1剂
量组与模型组相比未见明显差异。阳性药物恬尔心
亦可显著降低 Caspase-9 mRNA表达水平(与模型组
比较 P ＜ 0. 05) (图 2)。
3. 4 蕨麻乙醇提取物抑制 Caspase-3，Caspase-9 的
蛋白表达 缺血再灌注损伤后，模型组较手术对照
组大鼠心肌组织内 Caspase-3 蛋白表达水平明显升
高(P ＜ 0. 01)。各浓度蕨麻给药组急性心肌缺血再
灌注损伤后大鼠心肌组织 Caspase-3 蛋白表达水平
显著降低(P ＜ 0. 01) (表 1，图 3)。
同样的，与手术对照组相比，模型组大鼠心肌组
织内 Caspase-9 蛋白表达水平明显升高(P ＜ 0. 01)。
A. 各组 TUNEL染色典型照片;B. 各组凋亡指数统计;与手术对照
组比1)P ＜ 0. 01;与模型组比2)P ＜ 0. 01。
图 1 TUNEL染色结果提示蕨麻乙醇提取物可抑制缺血再
灌注损伤诱导的细胞凋亡
Fig. 1 Alcohol extract of Potentilla anserina decreased the myo-
cardial apoptotic index after I /R injury
各浓度蕨麻乙醇提取物给药组急性心肌缺血再灌注
损伤后大鼠心肌组织 Caspase-9 蛋白表达水平显著
降低(P ＜ 0. 01) (图 4，表 1)。
4 讨论
当各种病变导致冠状动脉狭窄时，冠状动脉供
血不能满足心肌对能量的需要，心肌的供血与需血
之间发生矛盾，此时就会发生心肌缺血。缺血状态
下，心肌组织不仅出现缺氧和代谢障碍［8］，同时毒
性产物蓄积，引起缺血性损伤;若缺血状态继续存在
则将导致心肌死亡。长期以来，人们认为细胞坏死
是这种心肌死亡的唯一方式。近年来的研究表明:
细胞死亡存在 2 种机制，即坏死和凋亡同时越来越
多的证据说明:细胞凋亡也存在于心肌梗死过程中。
有研究表明缺血再灌注损伤的病理过程，特别是急
性心肌梗死再灌注后，在梗死区及其周围可见细胞
凋亡的存在［9-11］。
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上样顺序从左到右依次为:DL2000 DNA marker，模型组，手术对照组，恬尔心组，蕨麻醇提取物 3. 6，1. 8，0. 9 g·kg －1剂量组;与手术对照组比
1)P ＜ 0. 01;与模型组比2)P ＜ 0. 05，3)P ＜ 0. 01。
图 2 蕨麻乙醇提取物抑制 Caspase-3，Caspase-9 mRNA的表达
Fig. 2 Alcohol extract of Potentilla anserine attenuated the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in myocardial tissues after
I /R injury
表 1 蕨麻乙醇提取物对缺血再灌注大鼠心肌 Caspase-3，
Caspase-9 表达的影响(珋x ± s，n = 5)
Table 1 Alcohol extract of Potentilla anserine attenuated the ex-
pressions of Caspase-9 and Caspase-3 in myocardial tissues after
I /R injury(珋x ± s，n = 5)
组别
剂量
/ g·kg －1
Caspase-3 Caspase-9
手术对照 － 0. 121 ±0. 012 0. 213 ±0. 035
模型 － 1. 652 ±0. 3501) 1. 212 ±0. 0481)
恬尔心 0. 03 0. 421 ±0. 0832) 0. 381 ±0. 0322)
蕨麻乙醇提取物 3. 6 0. 254 ±0. 0512) 0. 411 ±0. 0392)
1. 8 0. 431 ±0. 0702) 0. 556 ±0. 0412)
0. 9 0. 671 ±0. 0842) 0. 672 ±0. 0832)
注:与手术对照组比1)P ＜ 0. 01;与模型组比2)P ＜ 0. 01。
在本实验中，TUNEL 染色结果示:缺血再灌注
损伤后，缺血区出现心肌细胞凋亡，凋亡指数为
(31. 5 ± 3. 6)%，蕨麻乙醇提取物各给药组凋亡指
数较模型组均显著降低。说明蕨麻乙醇提取物对缺
血再灌注损伤所诱导的心肌细胞凋亡有显著的保护
作用。
缺血再灌注损伤所致细胞凋亡的可能原因包括
图 3 蕨麻乙醇提取物抑制 Caspase-3 蛋白的表达
(DAB显色)
Fig. 3 Alcohol extract of Potentilla anserine attenuated the ex-
pression of Caspase-3 in myocardial tissues after I /R injury
缺血所致的能量代谢障碍、细胞钙超载、自由基堆
积、NO过度生成等［12-16］。上述各种原因通过不同
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图 4 蕨麻乙醇提取物抑制 Caspase-9 蛋白的表达
(DAB显色)
Fig. 4 Alcohol extract of Potentilla anserine attenuated the ex-
pression of Caspase-9 in myocardial tissues after I /R injury
的信号传导通路引起心肌细胞凋亡，之间可有重叠
及相互影响，但其共同的最后通路可能为 Caspase
家族激活［17-19］，导致某些酶包括核酸内切酶的激活
及随后 DNA裂解。Caspase是细胞凋亡中最重要的
酶，它是半胱氨酸依赖的蛋白激酶，具有半胱氨酸蛋
白酶类和特异酶切 Asp氨基位点两大特点。心肌细
胞缺血再灌注过程中，自由基破坏线粒体膜，使得
Cytc从线粒体内膜释放至胞质，在胞质中与凋亡蛋
白酶激活因子 Apaf-1 结合形成寡聚体，Apaf-l 通过
其氨基酸端和 ProCaspase-9 的功能前区相互作用，
形成 Apaf-1-前 Caspase-9 复合体，自身激活形成有
活性的 Caspase-9，前 Caspase-9 再酶解前 Caspase-3
使之活化，从而触发 Caspase 级联反应，并最终导致
细胞凋亡［20］。
本实验用免疫组织化学方法观察了 Caspase-3，
Caspase-9 蛋白在损伤组织中的表达，并用 RT-PCR
技术分析了 Caspase-3，Caspase-9 mRNA在缺血区组
织中的表达。结合二者结果，发现模型组较手术对
照组 Caspase-3，Caspase-9 mRNA 及 Caspase-3，
Caspase-9 蛋白表达水平升高，而各蕨麻乙醇提取物
给药组 Caspase-3，Caspase-9 mRNA 及 Caspase-3，
Caspase-9 蛋白表达较模型组显著下降，提示蕨麻乙
醇提取物能够抑制凋亡相关基因 Caspase-3，
Caspase-9 mRNA及蛋白水平的表达，从而抑制缺血
再灌注损伤所诱导的心肌细胞凋亡。
综上所述，本研究证实心肌缺血再灌注损伤后，
在缺血区出现心肌细胞凋亡;Caspases 级联反应是
导致细胞凋亡机制之一。而蕨麻乙醇提取物可以减
弱 Caspases级联反应，通过干预心肌细胞凋亡抑制
心肌细胞死亡的发生，对缺血再灌注损伤所诱导的
心肌细胞凋亡有显著的保护作用。
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Study on protective effect of alcohol extract of Potentilla Anserinea
against acute myocardial ischemia /reperfusion-induced
myocardial apoptosis in rats
QIN Xiaojing1，LV Qi2，ZHANG Xinning2，CHEN Fuquan2，LI Lingzhi2，3* ，ZHANG Yongliang2，3*
(1. Department of Pathology，Affiliated Hospital of Logistics University of CAPF，Tianjin 300162，China;
2. Logistics University of CAPF，Tianjin 300162，China;
3. Tianjin Key Laboratory of Occupational and Environmental Hazard Biomarkers，Tianjin 300162，China)
［Abstract］ Objective:To observe the protective effect of alcohol extract of Potentilla anserina against myocardial apoptosis in-
duced by acute myocardial ischemia / reperfusion by arteria coronaria ligation and the effect on the expressions of Caspase-3 and
Caspase-9 in myocardial apoptosis signal pathway. Method:Male SD rats were randomly divided into the sham-operated group，the
model group，the diltiazem group (30 mg·kg －1)and P. anserine alcohol extract intervention groups (0. 9，1. 8，3. 6 g·kg －1). Rat
acute myocardial ischemia / reperfusion model was established by ligating left anterior descending. Apoptosis of myocardial cells were
detected by TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay). The expressions of
Caspase-3 and Caspase-9 mRNA were assayed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Semi-quantitative analy-
sis was made for the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 by immunohistochemistry. Result:According to TUNEL results，after I /R
injury-induced myocardial apoptosis，the apoptotic index (AI)of model group was (31. 5 ± 3. 6)%. All P. anserine alcohol extract in-
tervention groups showed obvious inhibition of ischemia / reperfusion-induced myocardial apoptosis. In the model group，myocardial ap-
optosis caused increased expression of Caspase-3，Caspase-9 mRNA and proteins. After the administration of P. anserine alcohol ex-
tract，1. 8，3. 6 g·kg －1 dose groups showed notable decrease in Caspase-9 mRNA (P ＜ 0. 05) ，while the 0. 9 g·kg －1 dose group
showed no significant difference with the model group. Alcohol extract of P. anserina in all dosages showed inhibitory effect on the ex-
pression of Caspase-3 mRNA in myocardial cells compared with model group (P ＜ 0. 05). Immunohistochemistry showed that adminis-
tration of all dosages of alcohol extract of P. anserina could significantly reduce Caspase-3 and Caspase-9 protein expressions after I /R
injury (P ＜ 0. 05). Conclusion:The administration with alcohol extract of P. anserina can protect the myocardial tissue from apoptosis
after acute myocardial ischemia and reperfusion injury in rats and inhibit the expressions of Caspase-9 and Caspase-3 mRNA and pro-
teins.
［Key words］ Potentilla anserina;myocardial ischemia / reperfusion;apoptosis;TUNEL;Caspase
doi:10． 4268 /cjcmm20120923
［责任编辑 张宁宁］
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第 37 卷第 9 期
2012 年 5 月
Vol. 37，Issue 9
May，2012