全 文 ：1918 2016 年第 57 卷第 11 期
收稿日期:2016-08-19
基金项目:2016 年西北民族大学国家级大学生创新创业训练计划项目 (201610742070)
作者简介:刘 婷 (1995—)，女，四川通江人，动物科学专业本科生，E-mail:997157405@ qq. com。
通信作者:柴薇薇，E-mail:Chaiww13@ lzu. edu. cn。
文献著录格式:刘婷，廖弋，张仕杰，等． 紫羊茅肌动蛋白编码基因核心片段的克隆及序列分析 ［J］． 浙江农业科学，2016，57 (11):
1918-1922．
DOI:10. 16178 / j. issn. 0528-9017. 20161148
紫羊茅肌动蛋白编码基因核心片段的克隆及序列分析
刘 婷，廖 弋，张仕杰，张维维，蒲晓霞，王雪飞，曾 亮，柴薇薇*
(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730100)
摘 要:肌动蛋白 (actin)是构成细胞骨架的主要成分，是细胞外表形态、组织和正常生长的基础。本研
究采用 ＲT-PCＲ技术扩增出肌动蛋白编码基因核心片段，将获得的片段连接到 pMDTM19-T 载体上后进行测序。
序列分析表明，该片段长 629 bp，编码 208 个氨基酸。同源性比较分析表明，紫羊茅肌动蛋白编码基因的核心片
段与其他植物肌动蛋白编码基因核心片段氨基酸序列的同源性均在 88%以上，具有高度的保守性。
关键词:紫羊茅;肌动蛋白;克隆;序列分析
中图分类号:Q943. 2 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2016)11-1918-05
肌动蛋白是一种古老而又保守的蛋白质，几乎
参与了生物体所有的生命活动，发挥着基础性的、
不可替代的作用。在细胞中肌动蛋白结合蛋白调控
作用下，以各种动态平衡的形式存在，藉以完成多
种细胞功能，包括细胞分裂、细胞运动、内吞作
用、成核作用、细胞信号传导、重力感应以及多种
细胞运动，例如顶端生长、细胞器运动等生物学作
用［1］。此外，肌动蛋白基因的表达水平几乎不受
环境影响，在很多研究中可以作为内参基因，在基
因表达调控研究时具有重要的作用，被广泛作为分
子内标［2］。目前，蒙古冰草［3］、水仙［4］、桑树［5］、
谷子［6］、党参［7］、花生［8］等许多植物的肌动蛋白
基因已被克隆。但尚未见有关紫羊茅肌动蛋白基因
方面的研究报道。
紫羊茅 (Festuca rubra L．)又名红狐茅，广布
于北半球温寒地带，为冷季型草坪草，抗逆性强，
耐酸、耐瘠薄，抗病性强。其作为一种广泛应用的
主体草坪草，广泛用于机场、庭院、花坛、林下等
作观赏用，亦可用于固土护坡、保持水土或与其他
草坪种混播建植运动场草坪。此外，紫羊茅在高山
高寒地区的牧场上具有广阔的应用前景［9］，因此
针对紫羊茅的研究越来越多，但目前在分子水平上
对其研究较少，且尚未见有关紫羊茅肌动蛋白编码
基因方面的研究报道。本研究克隆得到紫羊茅肌动
蛋白编码基因核心片段，并进行序列分析，将为研
究紫羊茅其他重要功能基因的表达与调控机制奠定
基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 材料
试验所用紫羊茅盆栽培养于 25 ℃恒温光照培
养箱中，每隔 1 d浇 1 次水使土壤完全浸湿，培养
30 d后取叶尖幼嫩部分进行后续试验。
1. 1. 2 试剂
Total ＲNA Extractor 试剂盒、大肠杆菌 DH5α
感受态细胞购自天根生化科技 (北京)有限公司;
PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Taq 酶、
dNTPs、ddH2O、 10 × PCＲ buffer (含 Mg
2 + )、
TaKaＲa pMDTM19-T Vector、胰蛋白胨、酵母浸粉、
Amp、IPTG (异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、X-gal
(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、Marker DL 2000
购自大连宝生物公司;胶回收试剂盒购自 Magen
公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 ＲNA提取和反转录
参照试剂盒说明提取紫羊茅总 ＲNA。进行
ＲNA质量和浓度的检测，采用 Oligo (dT)用反转
刘 婷，等:紫羊茅肌动蛋白编码基因核心片段的克隆及序列分析 1919
录酶反转录得到 cDNA，具体步骤参照试剂盒说明
进行。
1. 2. 2 PCＲ扩增
从 GenBank中查找禾本科类植物的肌动蛋白
编码基因的同源序列，设计并合成引物，Actin F:
5-GTGGTCGTACAACGGTATTGTG-3;Actin Ｒ:5-
GCCCTCCAATCCAGACACTG-3。PCＲ 采用 20 μL
反应体系，包括 1. 0 μL cDNA，2. 0 μL 10 × PCＲ
buffer (含Mg2 +)，0. 4 μL actin F，0. 4 μL actin Ｒ，
0. 2 μL Taq 酶 (2. 5 U·μL －1)，1. 6 μL dNTP，
14. 4 μL ddH2O。反应程序为:94 ℃预变性 2 min;
94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 45 s，72 ℃延伸45 min，
30 个循环后 72 ℃延伸 10 min。扩增产物均用 1%
琼脂糖凝胶电泳分离。
1. 2. 3 阳性克隆筛选和鉴定
将回收的 PCＲ 产物连接到 pMDTM19-T 载体，
转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，于 LB 琼脂固
体培养基 (含 Amp)，IPTG，X-gal 蓝白斑筛选重
组子。阳性克隆经质粒 PCＲ鉴定后送交测序。
1. 2. 4 序列分析
NCBI SMAＲT对蛋白的保守区预测;DNAMAN
生物软件对蛋白序列进行序列同源性和进化树
分析。
2 结果与分析
2. 1 ＲNA提取和反转录
提取的紫羊茅总 ＲNA 经过琼脂糖凝胶电泳分
析结果显示 2 条清晰条带 (图 1)，28S 的亮度是
18S亮度的 2 倍，说明提取出的 ＲNA 有较高的完
整性，质量较好，可用于下一步的实验。
图 1 紫羊茅幼茎总 ＲNA甲醛变性凝胶电泳结果
2. 2 PCＲ 扩增与阳性克隆筛选和鉴定
反转录后进行 PCＲ扩增，产物在 500 ～ 750 bp
有一条明亮的条带 (图 2)，片段大小基本符合预
期目的片段长度，初步推测为紫羊茅肌动蛋白编码
基因核心片段编码基因序列片段。胶回收纯化后，
进行连接转化。阳性克隆菌液 PCＲ 鉴定结果见图
3。片段大小在 629 bp，片段大小合适，与 ＲT-PCＲ
结果一致。
M为 DNA marker;A图中 1、2、3、4、5 为 ＲT-PCＲ产物;B图中 1 为胶回收产物
图 2 ＲT-PCＲ产物凝胶电泳 (A)和胶回收产物凝胶电泳 (B)结果
M为 DNA marker;1—10 为阳性克隆产物
图 3 阳性克隆的 PCＲ鉴定结果
2. 3 序列分析
测序及推导结果表明此基因片段长 629 bp，
编码 208 个氨基酸 (图 4)。将推导的紫羊茅肌动
蛋白编码基因核心片段氨基酸序列在 GenBan 中
进行 Blast 分析发现该基因具有 Actin 超基因家族
的保守结构域 (图 5)。运用 DNAMAN 软件，将
从 NCBI 上下载大麦、小麦、花生、胡杨等十多
种禾本科植物的氨基酸序列，与紫羊茅肌动蛋白
编码基因核心片段的氨基酸序列进行比对分析
1920 2016 年第 57 卷第 11 期
(图 6)，并建立同源树 (图 7)和进化树 (图
8)。结果表明，紫羊茅 ACT 与谷子 Actin 基因同
源性为 93%，与花生、树棉、拟南芥、短花稻、
粗山羊草、胡杨的 Actin 基因同源性均为 90%，
与甘蓝油菜 Actin 基因同源性为 89%，其与其他
植物的同源性均在 88%以上，说明其是 Actin 基
因家族的成员，同时验证了植物肌动蛋白基因具
有高度的同源性。
图 4 核苷酸序列以及推导的氨基酸序列
图 5 保守结构域分析结果
从图 8 可知，进化树中紫羊茅与水稻和短花稻
的亲缘关系最近，处于同一分支上，其次是大麦和
小麦，在物种的进化过程中起源于同一祖先。短花
稻、水稻、大麦、小麦、紫羊茅 5 种单子叶禾本科
植物组成一个次级分化群，并与其他双子叶植物胡
杨、树棉、拟南芥同处于一个分化群中，谷子与双
子叶植物花生等分在一起，处于另一个分化群，以
上结果出现单子叶植物与双子叶植物的肌动蛋白在
进化中相互交叉。甘蓝油菜单独聚为一类，表明不
同种植物在肌动蛋白的分化方向和分化速率上有差
别，从而适应不同的生存环境。谷子与花生亲缘关
系较近，而与同为禾本科的短花稻、水稻、大麦和
小麦的亲缘关系较远，据此推断植物肌动蛋白基因
的进化是由多方面因素共同决定的。
刘 婷，等:紫羊茅肌动蛋白编码基因核心片段的克隆及序列分析 1921
ACT基因来源 (GenBank 登录号)，水稻 O. s ACT (EAY79170. 1)、甘蓝油菜 B. n ACT (ACU27921. 1)、粗山羊草 A. t ACT3
(EMT00396. 1)、树棉 G. a ACT7 (KHG20985. 1)、胡杨 P. e ACT7 (XP_ 011004377. 1)、短花稻 O. b ACT2 (XP_ 006661942)、刺儿
菜 C. s ACT (AEY77415. 1)、拟南芥 A. t ACT (AAA98561)、紫羊茅 F. r ACT (未知)、大麦 H. w ACT (BAJ85914. 1)、小麦 T. a ACT
(AHE76167. 1)、花生 A. h ACT (AIY35295)、谷子 S. i ACT (AAF82806)，图 7—8 同
图 6 紫羊茅 actin基因氨基酸序列同源性比较
图 7 紫羊茅与其他植物肌动蛋白基因的
氨基酸序列同源性
3 讨论
肌动蛋白是在植物中普遍存在的一类蛋白质，
参与植物体的重要生理过程，包括细胞分裂、细胞
运动、细胞形状控制、顶端生长、胞质环流、细胞
的内吞作用、细胞信号转导等，因此其具有重要的
研究价值［10］。近年来对肌动蛋白基因的研究已越
图 8 紫羊茅与其他植物肌动蛋白基因的进化分析
来越多，目前在 GenBank 中已注册的肌动蛋白已
超过 30 000 个，且有继续增加的趋势，对肌动蛋
白的研究已成为分子生物学研究的一个重要部分。
肌动蛋白基因编码序列是高度保守的，而非编
码序列有较大的差异，反映其进化上的时间进
程［11］。本试验运用同源序列法和 ＲT-PCＲ 技术分
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离获得了紫羊茅肌动蛋白编码基因核心片段，该片
段长 629 bp，编码 209 个氨基酸。获知该片段与其
他植物肌动蛋白氨基酸序列具有高度的同源性，均
在 88%以上，该结果验证了肌动蛋白在进化过程
中高度的保守性［12-13］。在高等植物的肌动蛋白进
化树中，单子叶植物与双子叶植物的肌动蛋白在进
化中相互交叉，表明被子植物肌动蛋白基因家族起
源于一个共同祖先［14］。紫羊茅与同为禾本科植物
的谷子亲缘关系较远，推断出植物肌动蛋白基因的
进化是由多方面因素共同决定的，在构建肌动蛋白
基因进化树过程中，现代植物分类标准的参考价值
有限。每 5 600 万 ～ 9 400 万年，植物与动物肌动
蛋白基因的分化率仅有 1%［15］。说明肌动蛋白基
因核苷酸是由一个共同的基因祖先进化而来，并且
在进化过程中的替换率极低，暗示肌动蛋白基因在
进化过程中承受很强的选择压力，在生物体内执行
非常重要的生物学功能［16］。因此，研究肌动蛋白
基因具有重要意义。
植物肌动蛋白的研究相对滞后，尤其缺少在植
物进化过程中占据关键位置的植物肌动蛋白基因序
列，亟须其他有代表性的肌动蛋白基因序列进行完
善［3］。本研究获得紫羊茅肌动蛋白编码基因核心
片段，不仅填补了肌动蛋白基因库中紫羊茅肌动蛋
白基因的空白，丰富了肌动蛋白研究的资料库，而
且可以作为内参基因为研究紫羊茅中其他重要功能
基因的表达与调控机制奠定基础，为草坪草抗性优
质基因筛选提供理论依据。
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(责任编辑:卢福庄
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